葉綠體色素定量測(cè)定及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、題目： 葉綠體色素定量測(cè)定及理化性質(zhì)鑒定 一、實(shí)驗(yàn)原理1、葉綠體色素定量測(cè)定植物葉綠素在紅光區(qū)有最大吸收值，因此，利用分光光度計(jì)測(cè)定其在特定波長(zhǎng)下的吸光值，然后利用朗伯-比爾定律計(jì)算葉綠素含量。根據(jù)郞伯-比爾定律，當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)（稀溶液）時(shí)，其吸光值A(chǔ)與吸光物質(zhì)的濃度C及吸收層厚度d成正比，及A=KCd。如果溶液中含有數(shù)種吸光物質(zhì)，則混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光值等于各組分在此波長(zhǎng)下吸光值的總和。如欲測(cè)定葉綠素混合提取液中葉綠素a、b、葉黃素、胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在3個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光值A(chǔ)，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)即可求出

2、其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光應(yīng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b分別663nm和645nm（80丙酮提?。┯凶畲笪罩担煌瑫r(shí)已知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b吸收系數(shù)分別為82.04和9.27；在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.6；在有葉綠素存在的條件下，用分光光度計(jì)法可同時(shí)測(cè)出溶液中類胡蘿卜素的含量，其推導(dǎo)公式如下：A663 = 82.04 Ca + 9.27 Cb；A645 = 16.75 Ca + 45.6 Cb；Ca = 12.21 A663 - 2.81 A645；Cb = 20.13 A645 5.03 A645；Cxc

3、=式中，Ca、Cb和Cxc分別為葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度。2、葉綠素理化性質(zhì)鑒定葉綠素是一種雙羧酸，其中一個(gè)羧基被甲醇所酯化，另一個(gè)被葉醇所酯化。故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠素的鹽。皂化反應(yīng)如下： 葉綠素分子吸收光量子后轉(zhuǎn)變激發(fā)態(tài)后很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠體含卟啉環(huán)，卟啉環(huán)中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子進(jìn)入葉綠體后置換鎂原子，形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。而去鎂葉綠素中的氫離子，易被銅離子取代，形成穩(wěn)定的藍(lán)綠色銅代葉綠素。二、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 1、實(shí)驗(yàn)儀器：分光光度計(jì)，研缽，剪刀，50mL容量瓶，玻

4、璃棒，小漏斗，濾紙（?。?mL移液管，洗耳球，膠頭滴管，10mL試管，試管夾，酒精燈。 2、實(shí)驗(yàn)試劑：80丙酮，純丙酮，碳酸鈣，20KOH甲醇溶液，苯，0.5molmol/LHCl，醋酸銅粉末。三、實(shí)驗(yàn)材料 新鮮菠菜葉；干菠菜葉粉末。四、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）葉綠體色素定量的測(cè)定 1、稱取新鮮菠菜葉樣品0.1g，放入研缽中，加少量碳酸鈣和純丙酮研磨；研磨較充分時(shí)，再加10mL的80丙酮，繼續(xù)研磨至成勻漿。 2、取一張小濾紙，折疊后放入漏斗中，并用80丙酮濕潤(rùn)，使濾紙緊貼壁。然后將提取液濾入50mL容量瓶中，用少量丙酮沖洗研缽及研錘數(shù)次。 3、用膠頭滴管吸取80丙酮，緩慢沖洗濾紙上的殘留葉綠素，將其

5、全部洗入量瓶?jī)?nèi)，最后用80丙酮定容至50mL。 4、在分管光度計(jì)上，分別測(cè)定663nm，645nm和470nm處的吸光值，以80丙酮為空白對(duì)照。 5、結(jié)果計(jì)算 按原理中的公式分別計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度（mg/L），即：Ca = 12.21 A663 - 2.81 A645；Cb = 20.13 A645 5.03 A645； Cxc=再按下式計(jì)算組織中各色素含量（用mg/g鮮重表示）：葉綠體色素含量（mg/g）= （二）葉綠素理化性質(zhì)的鑒定 1、皂化作用 a.吸取葉綠體色素提取液約5mL放入試管中，再加入5mL20的KOH甲醇溶液，充分搖勻，然后加入苯，搖勻。 b.沿試管壁慢慢加入

6、1.5mL蒸餾水，輕輕混勻，與試管架上靜置，觀察其現(xiàn)象。 2、葉綠素取代反應(yīng) a.取兩支試管，向一支試管中加入5mL葉綠體色素提取液，然后將其一部分倒入另一支試管中，作為對(duì)照。向試管里加入12滴0.5mol/L HCl后搖勻。 b.將加了HCl的葉綠素溶液倒出一部分置于另一空試管中作對(duì)照，然后向管內(nèi)加入四分之一勺左右的醋酸銅粉末，慢慢加熱，然后置于試管架上，過段時(shí)間后觀察其現(xiàn)象。 3、熒光現(xiàn)象 取干菠菜粉末約1g，加入5mL80丙酮，等待一會(huì)兒，用燈光照射試管，觀察其在反射光和投射光下的熒光顏色。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、思考題 1、測(cè)定植物葉片葉綠素含量有什么意義？ 答：意義：植物葉片葉綠素含量與光合

7、速率、營(yíng)養(yǎng)狀況等密切相關(guān)，對(duì)葉片中葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，可以了解物質(zhì)轉(zhuǎn)化的速度和程度。在作物栽培上，通常測(cè)定葉綠素含量以表征植物生長(zhǎng)狀況，也往往把葉色變化作為看苗診斷和肥水管理的重要指標(biāo)，同時(shí)有利于了解作物生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)存在的問題，改良栽培方式，提高產(chǎn)量，這對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有很大的現(xiàn)實(shí)意義；在水體治理中，通過測(cè)定葉綠素含量，了解水中植物的光合能力，借此尋找治理方案?？傊瑴y(cè)定植物葉片葉綠素含量對(duì)于我們生產(chǎn)實(shí)踐具有重大意義。 2、測(cè)量出葉綠素含量偏低，可能是因?yàn)槭裁矗?答：（1）選取的葉片比較嫩，葉片內(nèi)葉綠素含量較低； （2）取材時(shí)，取到含葉脈較多或大葉脈的部分，而葉脈內(nèi)不含葉綠體； （3）實(shí)驗(yàn)過程中，在過濾一步中，未用丙酮洗研缽或未清洗濾紙； （4）研磨不充分，導(dǎo)致葉綠素未完全析出； （5）實(shí)驗(yàn)過程中葉綠素析出后在光下時(shí)間較長(zhǎng)（研磨時(shí)間過長(zhǎng)），導(dǎo)致葉綠素分解；3、正常葉綠素a：葉綠素b的比值約為3:1，測(cè)出該比值偏低，可能原因是什么？ 答：（1）植物若經(jīng)過遮光處理，葉綠素a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化加快，葉綠素a水解形成脫植基葉綠素a，脫植基葉綠素a再轉(zhuǎn)化為脫植基葉綠素b，最后合成葉綠素b，從而降低了葉綠素a/b的比值； （2）若植物是