苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)

1、苯硫脲嘗味的遺傳學(xué)調(diào)查,遺傳學(xué)大實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),1實(shí)驗(yàn)的每一步都要詳細(xì)地記錄操作內(nèi)容、時(shí)間、步驟、結(jié)果等，以備查詢。 2對(duì)任何自己不熟悉的實(shí)驗(yàn)儀器都不要隨意操作（尤其是微量移液器）。在操作的過程中發(fā)現(xiàn)任何意外的現(xiàn)象都要及時(shí)向任課教師匯報(bào)。 3在實(shí)驗(yàn)的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），嚴(yán)禁隨地投棄！特別注意對(duì)廢棄細(xì)菌的殺滅和有毒垃圾的定點(diǎn)投放。 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要把用過的器皿清洗后歸放整齊并清點(diǎn)數(shù)目，向教師匯報(bào)征得同意后方可離開實(shí)驗(yàn)室,1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1）測定人群中PTC 嘗味基因的表現(xiàn)型和基因型，理解孟德爾遺傳基因型與表現(xiàn)型的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 （2）了解酶切擴(kuò)增多態(tài)序列（cl

2、eaved amplified polymorphic sequence，CAPS） （又稱為PCR-RFLP）技術(shù)的原理，學(xué)會(huì)用CAPS 技術(shù)檢測單核苷酸多態(tài)性 （SNPs）。在分子水平上測定PTC 嘗味的基因型。 （3）計(jì)算群體中PTC 嘗味的基因頻率，判斷群體是否達(dá)到Hardy-weiberg 平衡,2. 實(shí)驗(yàn)原理,2.1 苯硫脲嘗味的遺傳形式 苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的 苯基衍生物（圖2.1），為白色結(jié)晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能團(tuán)而有苦澀味。能嘗1/750,0001/50,000 PTC 濃度溶液味道的人（苦澀味，少數(shù)人感到甜味）稱

3、為苯硫脲“嘗味者（taster）”；只能嘗出PTC 濃度大于1/24,000 溶液的味道（甚至對(duì)PTC 的結(jié)晶物也嘗不出苦味）的人稱為苯硫脲“味盲者（nontaster,PTC 嘗味能力是受單基因控制的孟德爾遺傳性狀，是由位于7 號(hào)染色體上（7q35-7q36）的一種苦味味覺感受器基因TAS2R38 決定的，屬于常染色體不完全顯性遺傳。嘗味者中顯性基因T的純合子(TT)能嘗出1750,000 16,000,000的PTC 溶液的苦味，雜合子(Tt) 只能嘗出1480,000l380,000 的PTC 溶液的苦味。因此可以利用對(duì)PTC 的嘗味能力測定家族中的基因傳遞和人群中的基因頻率,2.2 人

4、類苯硫脲嘗味的基因 人類的 PTC 嘗味基因Homo sapiens taste receptor, type 2, member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38 或 T2R61。絕大多數(shù)嘗味者與味盲者的區(qū)別在于三處單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs,第一處：145 位，味盲者為G145（編碼丙氨酸ala），嘗味者為C145（編碼脯氨酸pro）； 第二處：785 位，味盲者為T785（編碼纈氨酸val），嘗味者為C785（編碼丙氨酸ala）； 第三處：886 位，味盲者為A886（編碼異亮氨酸ile），嘗

5、味者為G886（碼纈氨酸val,因此味盲者PTC 多肽中三處對(duì)應(yīng)的氨基酸分別是ala49、val262 和ile262，被稱為AVI 等位基因，而嘗味者的三處是pro49、ala262 和val262，被稱為PAV 等位基因（圖2.2，2.3,圖 2.2 味盲者PTC 嘗味基因編碼區(qū)（CDS）序列,圖2.3 味盲者PTC 多肽,味盲者的PTC 編碼區(qū)有五個(gè)限制性內(nèi)切Fnu4H1 的識(shí)別位點(diǎn)（識(shí)別序列5-GCNGC-3），如果是嘗味者，則其第785 位SNP 恰好形成了一個(gè)額外的Fnu4H1 識(shí)別位（GCTGC）。因此可以利用這個(gè)SNP 造成的限制性位點(diǎn)多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含785 位SNP

6、位點(diǎn)的PTC 基因編碼區(qū)的一部分，然后用Fnu4H1切割擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否能把擴(kuò)增產(chǎn)物切開而判定是某個(gè)人的單倍型（haplotype,4. 實(shí)驗(yàn)步驟,1）講解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線。 （2）講解口腔上皮細(xì)胞總DNA 的快速提取、基因PCR 擴(kuò)增、DNA 電泳、PCR 產(chǎn)物純化、DNA 酶切、遺傳學(xué)分析等實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)。 （3）講解高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、渦旋振蕩器、磁力攪拌器、電子天平、PCR 儀、微波爐、紫外分光光度計(jì)、電磁爐、恒溫水浴鍋、恒溫干熱議、凝膠成像儀、制冰機(jī)、超凈工作臺(tái)、通風(fēng)櫥、恒溫振蕩搖床、37培養(yǎng)箱、pH 計(jì)、微量移液器、

7、冰箱、-80超低溫冰箱等主要儀器設(shè)備以及必須的電腦軟件的使用方法、注意事項(xiàng),4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 4.2.1.1 主要儀器設(shè)備 高壓蒸氣滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、冰箱。 潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的容量瓶、量筒、燒杯、螺口試劑瓶，一次 性醫(yī)用無菌PE 手套、乳膠手套、塑料滴管，一次性紙杯，記號(hào)筆,4.2 PTC 嘗味能力的測定,4.2.1.2 試劑和材料 （1）材料：受試者為全體修讀遺傳學(xué)大實(shí)驗(yàn)的學(xué)生。 （2）試劑：苯硫脲（PTC）結(jié)晶，娃哈哈純凈水,4.2.1.3 溶液配制 （1）原液（1 號(hào)液）：稱取PTC 結(jié)晶0.65 g，加娃哈哈純凈水500 ml，

8、在室溫(20左右)下溶解l2d（經(jīng)常搖晃）（或60水浴中1 h 充分溶解），PTC 濃度約為1750，過濾滅菌。 （2）稀釋液：用娃哈哈純凈水逐級(jí)稀釋原液214 倍，編為2-14 號(hào)（表4.1）。 將配好的14 種濃度的PTC 溶液，過濾滅菌，分別置于滅菌過的100 ml 螺口試劑瓶中。另取娃哈哈純凈水作為第15 號(hào)液,4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）讓受試者正坐，仰頭張嘴伸舌，用滴管滴23 滴 15 號(hào)液于受試者舌根部，讓受試者慢慢咽下反復(fù)咂嘴品味液體嘗味，然后用純凈水做同樣的試驗(yàn)，交替給 受試者嘗味，避免受試者的臆意猜測而影響結(jié)果的準(zhǔn)確。 （2）詢問受試者能否鑒別此兩種溶液的味道。 （3）若不

9、能鑒別或鑒別不準(zhǔn)，則依次用 141 號(hào)溶液 重復(fù)試驗(yàn)，直到能明確鑒別出PTC 的苦味為止。 （4）復(fù)嘗味3 次，3 次結(jié)果相同時(shí)，才是可靠。 （5）記錄所品出苦味的液體的編號(hào)和稀釋濃度,注：統(tǒng)計(jì)民族、生源地是想調(diào)查PTC 味盲分布與民族和地理位置是否有相關(guān)性。（此生源地統(tǒng)計(jì)的不是受試者戶籍所在地，而是其家族或家庭成員長期生活的地方,4.3 人口腔上皮細(xì)胞總 DNA 的提取,4.3.1 實(shí)驗(yàn)材料 4.3.1.1 主要儀器設(shè)備 高壓蒸氣滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、超凈 工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、渦旋振蕩器、高速離心機(jī)、 恒溫振蕩搖床、微量移液器、電磁爐、冰箱、 -80超低溫冰箱、計(jì)時(shí)器、pH 計(jì)。 潔

10、凈、經(jīng) 121高壓滅菌 20min 的量筒、燒杯、螺口試劑 瓶、牙簽、1.5 mL滅菌微量離心管、微量移液器 吸頭（槍頭），離心管架，一次性醫(yī)用無菌 PE 手套、乳膠手套、口罩，記號(hào)筆,4.3 人口腔上皮細(xì)胞總 DNA 的提取,4.3.1.2 試劑和材料 （1）材料：每實(shí)驗(yàn)小組選取 1 名受試者，用滅 菌牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞。 （2）試劑：滅菌水，pH 標(biāo)準(zhǔn)液，細(xì)胞基因組 DNA 提取試劑盒,4.3 人口腔上皮細(xì)胞總 DNA 的提取,4.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）在 1.5 ml 滅菌微量離心管中加入 100 L 滅菌水。 （2）受試者用無菌牙簽輕刮口腔腮內(nèi)側(cè)，刮下來 的細(xì)胞在滅菌水中漂洗。 （

11、3）渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻 10 s， （4）離心機(jī)瞬時(shí)離心 10 s。 （5）沸水浴中煮沸 5 min。 （6）離心機(jī) 13200rpm 離心 2 min。 （7）基因組 DNA 4C 保存?zhèn)?4.5 PTC 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測,4.5.1. 主要儀器設(shè)備 高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠成像儀、制冰機(jī)、超凈工作臺(tái)、通風(fēng)櫥、微量移液器、冰箱、-80超低溫冰箱。 潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架， PCR管架，三角瓶，一次性醫(yī)用無菌 PE手套，記號(hào)筆，保鮮袋，微波爐用手套，三角瓶，搪瓷盤,4.5.2. 試劑和

12、材料 （1）材料：受試者PTC 基因PCR 產(chǎn)物 （2）試劑：Tris 堿，冰乙酸，Na2EDTA.2H2 O,溴化乙錠，瓊脂糖，Marker I 4.5.3. 溶液配制 （1）50 TAE 電泳緩沖液（儲(chǔ)存液，pH約8.5）：Tris 堿 242g，57.1ml 冰乙酸，37.2g Na2 EDTA.2H2 O ，去離子水定容至1L （2）1 TAE 電泳緩沖液（工作液）：取50TAE 電泳緩沖液，去離子水稀釋50倍,3）0.5mg/ml 溴化乙錠（EB）（1000 儲(chǔ)存液）：50mg 溴化乙錠溶于100mL dd water，4C 避光儲(chǔ)存）。 (4) 溴化乙錠（EB）工作液：0.5mg/

13、ml EB（1000 儲(chǔ)存液），去離子水稀釋 1000倍。（注：EB為扁平分子，可以嵌入DNA，為潛在誘變劑，接觸時(shí)須帶一次性醫(yī)用無菌PE手套，但也不是洪水猛獸，不小心濺到皮膚上時(shí)，不會(huì)被皮膚吸收只是停留在表面，用大量流水沖洗即可,1）配制 1.2%瓊脂糖凝膠：稱取 0.6g 瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1 TAE電泳緩沖液，放入微波爐中加熱，并不斷取出混勻，注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，直至完全熔解（燙，戴手套）。50ml 正好倒一塊大膠（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中?。?。（2）將膠液置桌面上室溫冷卻致熱但不燙手（約50-60,4.5.2 實(shí)驗(yàn)方法,3 ）把梳子插到凝膠灌制模具的正確位

14、置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可。在桌面上靜置10-20 分鐘待膠完全凝固.（剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝膠沒入電泳槽電泳液中，凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極,4）取 1 片光面紙，點(diǎn) 5uL 滅菌水、2uL 6 加樣緩沖液，再加入 5uL PCR 產(chǎn)物制成10uL DNA 樣品。 （5）在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10ul 的吸液頭 分別依次加入5uL Marker I 對(duì)照，各小組12uL PCR 產(chǎn)物電泳樣品（互相比較） （6）根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至120V (10V/cm)，電泳2030min。（注意正負(fù)電極的位置連

15、接正確）。 （7）把凝膠小心放入盛有 EB的搪瓷盤中，染色 10分鐘 后，取出用自來水浸泡10min 。 （8）放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照,4.6.1 實(shí)驗(yàn)材料 4.6.1.1 主要儀器設(shè)備 高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、渦旋振蕩器、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、恒溫干熱議、制冰機(jī)、紫外分光光度計(jì)、微量移液器、冰箱、-80超低溫冰箱。 潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的1.5 mL 滅菌微量離心管、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架，一次性醫(yī)用無菌PE 手套，塑料飯盒，記號(hào)筆,4.6 PTC 基因PCR 產(chǎn)物酶切,4.6.1.2 試劑和材料 （1）材料：受試者PTC 基因PCR 產(chǎn)物 （2）試劑：限制性內(nèi)切酶Fnu4H1,4.6.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1） 提前2 h 將恒溫水浴鍋或恒溫干熱儀(或恒溫水浴鍋)電源打開，調(diào)節(jié)工作溫度穩(wěn)定至37 C。 （2）從制冰機(jī)中盛取碎冰（0C ），從冰箱中取出所需試劑，在碎冰中解凍 （3）將試劑在渦旋振蕩器上渦旋振蕩混勻10 s （4）瞬時(shí)離心10 s。 （5） 取1L 受試者