《染色體核型分析》.doc

1、精品文章染色體核型分析山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告xx年12月12日姓名程開(kāi)源系年級(jí)xx級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制同組者孫琳、孫晶鑫、竇云德科目分子細(xì)胞生物學(xué)題目染色體核型分析學(xué)號(hào)xx0023xx【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解小白鼠睪丸細(xì)胞染色體的形態(tài)及數(shù)目。2.初步掌握小白鼠睪丸細(xì)胞染色體的玻片標(biāo)本制作方法。3.觀察動(dòng)物細(xì)胞染色體的數(shù)目和形態(tài)。【實(shí)驗(yàn)原理】染色體的制備在原則上可以從所有發(fā)生有絲分裂的組織和細(xì)胞懸浮液中得到。最常用的途徑是從骨髓細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞和組織培養(yǎng)的細(xì)胞中制備染色體。小型動(dòng)物的染色體制片最好最有效的材料就是骨髓組織。骨髓細(xì)胞中，有絲分裂指數(shù)相當(dāng)高，因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必象淋巴細(xì)胞或其它組織那樣要

2、經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)；對(duì)大型動(dòng)物通常采用對(duì)骨骼、脊或胸骨穿刺術(shù)吸取紅骨髓，小型動(dòng)物多采用剝離術(shù)取股骨以獲得骨髓細(xì)胞。制作染色體標(biāo)本的先決條件1.細(xì)胞具有旺盛的分裂能力選擇活躍的組織：胸腺，骨髓，睪丸，小腸施加藥物使細(xì)胞分裂：pha2.設(shè)法得到大量的中期細(xì)胞：秋水仙素（1）pha：粗細(xì)胞分裂，使淋巴細(xì)胞返幼，變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞（2）秋水仙素：破壞微管裝配，使紡錘體不能形成，使大量細(xì)胞停止在分裂中期。（3）低滲作用：水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)容空間變大，染色體間的距離拉大，易于染色體展開(kāi)（4）空氣干燥：使細(xì)胞和染色體展開(kāi)（5）固定：用甲醇：冰醋酸=3：1作用使蛋白質(zhì)變性，對(duì)染色體內(nèi)的組蛋白講，變性后硬度增加，保持了

3、染色體的“及時(shí)形態(tài)”，對(duì)細(xì)胞膜蛋白講，變性使細(xì)胞膜硬度增強(qiáng)，形成屏障作用，防止了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外溢和丟失。對(duì)于小鼠精巢染色體標(biāo)本的制作，一般包括以下幾個(gè)要點(diǎn)：1.用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期，使中期染色體停留在赤道面處;2.用低滲法使將細(xì)胞膨脹，以至于在滴片時(shí)細(xì)胞被脹破，使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上;3.空氣干燥法可使使細(xì)胞的染色體在載片上展平，經(jīng)giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.材料。小白鼠。2.試劑。秋水仙素、0.3%kcl溶液、甲醇、冰醋酸、磷酸緩沖液（ph=6.8）吉姆薩原液。3.器械。手術(shù)刀、手術(shù)剪、鑷子、試管架、解剖盤(pán)、注射器、

4、針頭、吸管、離心管、離心機(jī)、玻片（冰片）、天平、試鏡紙、二甲苯、吸水紙、香柏油、燒杯、水浴鍋?！緦?shí)驗(yàn)步驟】4.取雄性小鼠以每克體重4ug注射秋水仙素，經(jīng)14-16小時(shí)后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸，用生理鹽水（0.9%的nacl）吸去血污。5.放入裝有1ml0.3%kcl液的小燒杯中剪碎（呈乳白色）。山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告xx年12月12日姓名程開(kāi)源系年級(jí)xx級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制同組者孫琳、孫晶鑫、竇云德科目分子細(xì)胞生物學(xué)題目染色體核型分析學(xué)號(hào)xx0023xx6.用銅網(wǎng)過(guò)濾到刻度離心管中，再加0.3%kcl液至4ml。7.37靜置30分鐘，進(jìn)行低滲處理。8.以800-1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘。9.棄液，加

5、入2ml甲醇、冰醋酸固定液（3。1），并用吸管吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定8min。10.再以800-1000轉(zhuǎn)/分，離心8min。11.棄液，加1ml固定液，制成細(xì)胞懸液，固定5min。12.取潔凈的低溫預(yù)冷載玻片，距10-15cm高度滴下2-3滴細(xì)胞懸液，從一邊輕輕吹氣，并隨時(shí)輕輕敲打，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體展開(kāi)。13.用濾紙擦去載玻片上多余液體，空氣干燥或文火干燥，染色。14.用giesma染色20-30分鐘，細(xì)水吸取多余染液，氣干。15.鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡或油鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。附：倒置染色法在玻璃板上用廢舊載玻片作支架，使標(biāo)本載玻片的標(biāo)本面向

6、下放置到支架上，在玻璃板和標(biāo)本載玻片之間滴加giemsa染液，目的一可以節(jié)省染料，二可以避免染液快速揮發(fā)，三可以防止染色顆粒沉淀，影響觀察，在操作時(shí)應(yīng)注意，多個(gè)樣品同時(shí)染色應(yīng)擺放緊密，不要有間隙；滴染液時(shí)應(yīng)盡量滿，不要有氣泡，以免部分染色體不能著色?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】圖一染色體中期（10x40）圖二染色體中期未摔開(kāi)（10x40）圖三染色體間期（10x40）山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告xx年12月12日姓名程開(kāi)源系年級(jí)xx級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制同組者孫琳、孫晶鑫、竇云德科目分子細(xì)胞生物學(xué)題目染色體核型分析學(xué)號(hào)xx0023xx【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】圖一：此圖接近染色體分裂期的中期，染色體較粗，已發(fā)生固著，但是程度還不夠。在40

7、x10的鏡下看到的染色體應(yīng)為顆粒狀，隱約能看到顆粒中的分叉。圖二：此圖明顯為染色體的中期，可以清楚地看到從兩級(jí)發(fā)出的紡錘絲牽拉染色體到細(xì)胞的赤道板。但是細(xì)胞膜沒(méi)有摔破，無(wú)法確認(rèn)染色體的個(gè)數(shù)。圖三。此圖為染色體的分裂間期或分裂期前期，染色體還較細(xì)，呈絲狀?！痉此寂c總結(jié)】本次實(shí)驗(yàn)我們一共做了三只小鼠，但最終的結(jié)果還是不夠理想。第一只小鼠的注射時(shí)間為21個(gè)小時(shí)左右，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)在第一次進(jìn)行低滲時(shí)，我們實(shí)際加入的是等滲溶液，發(fā)現(xiàn)后立即加入水降低溶液的滲透壓，而且又補(bǔ)了一些低滲液，等離心，沉降等過(guò)程完成后，我們低滲已經(jīng)超過(guò)了規(guī)定時(shí)間。經(jīng)過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)中期的細(xì)胞較少，而且很多細(xì)胞堆疊在一起，沒(méi)有摔開(kāi)。第二只小

8、鼠全過(guò)程都是按照實(shí)驗(yàn)步驟規(guī)范地操作，由于第一次的許多細(xì)胞沒(méi)有摔開(kāi)，我們就將滴片的高度增加到1.8m。經(jīng)過(guò)觀察，我們和第一次的結(jié)果做比較發(fā)現(xiàn)：雖然本次細(xì)胞摔得較散，但是摔開(kāi)的細(xì)胞形態(tài)并沒(méi)有第一的效果好，初次之外，中期的細(xì)胞較少，絕大部分的細(xì)胞處于分裂間期。經(jīng)過(guò)比較兩次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)步驟，我們歸納出了一下幾個(gè)需要注意的地方：1.兩次制得的片中中期的細(xì)胞都比較少，說(shuō)明秋水仙素的作用效果不明顯，我們懷疑：秋水仙素在小鼠體內(nèi)一定時(shí)間后，可能會(huì)被機(jī)體代謝，停滯在中期的細(xì)胞可能會(huì)在細(xì)胞信號(hào)分子的誘導(dǎo)下發(fā)生凋亡或著將細(xì)胞中的秋水仙素代謝出去，恢復(fù)正常狀態(tài)，所以我們認(rèn)為注射秋水仙素的時(shí)間不是越長(zhǎng)越好。我們通過(guò)

9、查文獻(xiàn)，看到注射實(shí)驗(yàn)為4-6個(gè)小時(shí)，決定將第三只老鼠的注射時(shí)間控制在這個(gè)范圍內(nèi)。2.第一次的細(xì)胞雖然摔得沒(méi)有第二次的細(xì)胞好，但是第一次細(xì)胞的形態(tài)要比第二次好許多。我們認(rèn)為這與低滲這一步有很大的關(guān)系。第一次我們做的低滲時(shí)間較長(zhǎng)，使細(xì)胞已經(jīng)膨脹到了一定程度，效果較好。第二次的時(shí)間較短，低滲不充分，因此應(yīng)該適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)低滲時(shí)間。不過(guò)，據(jù)其他的實(shí)驗(yàn)組所說(shuō)，低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞在滴片之前裂解，在觀察的時(shí)候視野中都是雜亂、散落的染色體。除此之外，低滲的溫度也很重要，之前低滲的時(shí)候，所取的低滲液，用滴管吹細(xì)胞時(shí)均沒(méi)有進(jìn)行恒溫，在第三次實(shí)驗(yàn)時(shí)我們要做到全方位的恒溫，在低滲和用固定之前，先把低滲液和固定液放入

10、恒溫水中。3.用銅網(wǎng)過(guò)濾的時(shí)候我們發(fā)現(xiàn)，若只是將銅網(wǎng)平鋪在試管上，則傾倒液體時(shí)，液體很容易沿著試管壁流出。改進(jìn)的辦法是：將銅網(wǎng)覆蓋在試管上時(shí)，用拇指壓一下銅網(wǎng)，使其形成一個(gè)凹槽，將液體倒人凹槽中，讓其慢慢地過(guò)濾，液面不要超過(guò)試管的高度，防止外溢。4.用剪刀剪小鼠的睪丸，吸管吹氣打散細(xì)胞的時(shí)候要盡可能地仔細(xì)，使組織或細(xì)胞盡可能分散，體積盡可能小。這樣過(guò)濾得到的液體就比較充裕，離心后，最終制得的細(xì)胞懸液也比較多，細(xì)胞的密度也較大。5.第二次摔細(xì)胞的高度明顯比第一次的高度高，所得的細(xì)胞較分散，這點(diǎn)應(yīng)該山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告xx年12月12日姓名程開(kāi)源系年級(jí)xx級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制同組者孫琳、孫晶鑫、竇云德科目

11、分子細(xì)胞生物學(xué)題目染色體核型分析學(xué)號(hào)xx0023xx堅(jiān)持。6.設(shè)備也很重要，我們?cè)谟^察之前需要找一個(gè)好的顯微鏡。經(jīng)過(guò)一番總結(jié)后我們制定出一套新的實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備在第三只老鼠身上進(jìn)行實(shí)踐，其中有一下幾個(gè)要點(diǎn)：（1）秋水仙素：注射量，處理時(shí)間，自己配置秋水仙素（事先）（2）解剖小鼠取睪丸減少附帶組織，并用生理鹽水沖洗干凈，附帶血污影響觀察。剪刀切碎是要徹底，增多分離出來(lái)的細(xì)胞（3）低滲液的量可以稍多一些。低滲時(shí)間應(yīng)掌握準(zhǔn)確，低滲液預(yù)熱全程恒溫處理（隨時(shí)滴片觀察細(xì)胞形態(tài)，確定低滲終點(diǎn)。）低滲后的細(xì)胞吹打時(shí)動(dòng)作要輕（4）恒溫水浴箱的溫度計(jì)不太靈敏，用自己的溫度計(jì)（5）固定液的量以及固定的時(shí)間（6）離心速度

12、不能高于1000r/min，離心之后用氣泡法吹散細(xì)胞時(shí)要適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間（7）摔細(xì)胞的高度（8）用質(zhì)量好的顯微鏡“z”字型仔細(xì)觀察我們?cè)谧龅谌恍∈蟮臅r(shí)候，先注射了1.5ml的秋水仙素，但是經(jīng)過(guò)了84個(gè)小時(shí)后，小鼠仍沒(méi)有死亡，估計(jì)秋水仙素的作用已經(jīng)消失。我們?cè)僖淮巫⑸淝埃约号渲昧饲锼伤?。從冰柜里取出?50mg的秋水仙素，進(jìn)過(guò)一個(gè)植物實(shí)驗(yàn)室學(xué)姐的指導(dǎo)，我們來(lái)到了三樓用電子天平精確稱(chēng)出了秋水仙素10.0mg加入到烘干的試劑瓶中，配置0.1mg/ml的秋水仙素溶液。我們于中午1：30給小鼠注射了配置的秋水仙素，到下午7：00的時(shí)候我們來(lái)到實(shí)驗(yàn)室，準(zhǔn)備殺死小鼠，取睪丸細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在殺死小鼠前，我們還現(xiàn)配置了固定液40ml（甲醇：冰醋酸=3：1）。然后當(dāng)我們打開(kāi)小鼠的