雙縮脲法測定蛋白質(zhì)

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗,實驗記錄,實驗記錄是在進(jìn)行科學(xué)研究過程中積累資料、經(jīng)驗的一項重要工作，每一次實驗過程中都應(yīng)當(dāng)養(yǎng)成良好的習(xí)慣，及時做好記錄和總結(jié)。 要求： 真實性 原始性 完整性 條理性,實驗報告的書寫,實驗結(jié)束后，應(yīng)及時整理和總結(jié)實驗結(jié)果，寫出實驗報告。完整的實驗報告應(yīng)包括：實驗題目、實驗?zāi)康?、實驗日期、操作步驟與條件、實驗結(jié)果、討論和結(jié)論等項目,實驗室規(guī)則,上實驗課時不遲到，不早退，自覺遵守課堂紀(jì)律，上課時應(yīng)保持實驗室安靜，不得大聲說笑。進(jìn)入實驗室必須穿實驗工作服。 實驗課前認(rèn)真預(yù)習(xí)有關(guān)課程，明確實驗?zāi)康?、要求和注意事項，熟悉實驗?nèi)容和方法步驟。 實驗時應(yīng)遵守實驗操作規(guī)程，按教師

2、要求，認(rèn)真操作。要細(xì)心觀察實驗現(xiàn)象，認(rèn)真記錄實驗數(shù)據(jù)，作出結(jié)論，最后寫出實驗報告。 要愛護(hù)公物，小心使用儀器和實驗設(shè)備，注意節(jié)約用水、電、藥品和器材。 所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽,實驗室和實驗臺應(yīng)保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實驗完畢，儀器洗凈放好。 在實驗過程中必須遵守操作規(guī)程，不得隨意亂動亂用。如不會使用，應(yīng)請教指導(dǎo)教師。凡因亂動亂用違反操作規(guī)程而損壞儀器設(shè)備，造成事故者，按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行賠償和處理。 嚴(yán)禁在實驗室內(nèi)吃飯、吸煙、扔廢物和隨地吐痰，實驗室內(nèi)學(xué)生輪流安排值日，實驗結(jié)束離開實驗室之前，關(guān)好

3、窗戶，切斷電源，水源，確保安全,試劑使用規(guī)則,使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實驗所需。 取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。 取標(biāo)準(zhǔn)溶液時，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。 使用滴管時，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。 使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外,吸量管的使用,正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端。 取液：用吸耳球吸取液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。 調(diào)刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與

4、試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。 放液：吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動流出。吸量管應(yīng)最后靠壁15秒,吸量管上端標(biāo)有“吹”字。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為“吹出式”，未標(biāo)“吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。(0.5ml以下的都要吹） 吸量管尖應(yīng)接觸受器內(nèi)壁，但不應(yīng)插入受器內(nèi)的原有液體之中，以免污染吸量管及試劑。 吸取血液、尿、組織樣品、粘稠試劑或有顏色的吸量管，用后應(yīng)及時用自來水沖洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬

5、上沖洗，待實驗完畢后，用自來水沖洗干凈，晾干備用,吸量管的使用注意事項,玻璃器皿的一般清洗方法 一般玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自來水反復(fù)沖洗，最后用蒸餾水淋洗23次。干燥備用。 容量分析儀器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自來水沖洗，待晾干后，再用鉻酸洗液浸泡數(shù)小時，然后用自來水充分沖洗，最后用蒸餾水淋洗23次，干燥備用。 比色杯：用畢立即用自來水反復(fù)沖洗。洗不凈時，用鹽酸或適當(dāng)溶劑沖洗，再用自來水沖洗。避免用堿液或強(qiáng)氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙布(紙)擦拭。 上述所有玻璃器材洗凈(以倒置后器壁不掛水珠為干凈的標(biāo)準(zhǔn))后，根據(jù)需要晾干或烘干,分光光度

6、法,光是一種電磁波，通常用頻率和波長來描述光。 人的視覺所能感覺到的光稱為可見光，波長范圍在400760nm，人的眼睛感覺不到的還有紅外光（波長大于760-5000000nm）、紫外光（波長200-400nm）、x射線等。 在可見光區(qū)，不同波長的光呈不同的顏色，但各種有色光之間并沒有嚴(yán)格的界線，而是由一種顏色逐漸過渡到另一種顏色,溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系,一般性實驗-1,beer-lambert定律吸收光譜法基本定律,光吸收示意圖,吸收光譜和物質(zhì)的定性分析,物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。 吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征曲線。用各種不同波長的光線作為入射光測定物質(zhì)的吸光度（absorbance

7、），然后以波長（）為橫軸，相應(yīng)的吸光度（a）為縱軸，按結(jié)果作圖，可得到該物質(zhì)的吸收光譜曲線，這種曲線體現(xiàn)了物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力。 在一定的溫度、ph值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個或幾個吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長（max）。物質(zhì)不同，它們的最大吸收波長也往往不同,不同濃度的vitb12溶液對相同波長的光的不同吸收,原理：根據(jù)物質(zhì)對于入射光的特征吸收，可應(yīng)用于物質(zhì)溶液的定性檢測 比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同。 比較最大吸收波長：不同物質(zhì)的最大吸收波長不同；化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)最大吸收波長相同，吸收系

8、數(shù)不同。 比較吸光度的比值：多用于檢測物質(zhì)的純度（dna a260/a280=1.8 純度鑒定,物質(zhì)定性分析常用方法,物質(zhì)的定量分析,標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光。測定時先以空白溶液調(diào)節(jié)透光率100%，然后分別測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖得到一條通過原點的直線，叫做標(biāo)準(zhǔn)曲線（或稱a-c曲線）。 標(biāo)準(zhǔn)管法 對個別樣品進(jìn)行測定，且a-c曲線線性良好直接比較測定結(jié)果。 a標(biāo) =k標(biāo)c標(biāo)b標(biāo) a測 =k測 c測 b測 c測 =a測 /a標(biāo) c標(biāo),分光光度計的基本構(gòu)造,儀器中光源經(jīng)過單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單

9、色光（入射光）進(jìn)入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產(chǎn)生光電流，放大后在測量儀上顯示出吸光度（a）或透光度（t,722分光光度計使用方法,接通電源，打開儀器電源開關(guān)，打開樣品室蓋，預(yù)熱10min; 將空白液或?qū)φ找杭皽y定液分別裝入比色杯3/4體積并用擦鏡紙擦凈外壁，放入樣品室內(nèi), 空白液一般放于最外格，樣品比色杯放入位置與試管位置對應(yīng); 調(diào)好波長; 調(diào)節(jié)按鈕 開蓋時，調(diào) t 參數(shù) 調(diào)為 100 合上蓋，調(diào) a 參數(shù) 調(diào)為 0; 逐步拉出樣品室拉桿（聽到“咔”一聲），讀取吸光度值(a）; 讀數(shù)完打開樣品室蓋，再將讀數(shù)寫入記錄本,722分光光度計使用注意事項,樣品室蓋應(yīng)輕開輕放； 比色皿拿

10、其磨砂面，液體裝入約3/4高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，每次用完后自來水沖洗干凈，倒置于濾紙上； 倒取試劑時不能在儀器表面上方操作，儀器上請勿放任何物品； 每調(diào)換一次波長，都應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)至“0,雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,實驗?zāi)康?了解和掌握雙縮脲測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法,蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿性溶液中與稀硫酸銅溶液作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。 具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來測定蛋白質(zhì)的濃度。 在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。因此可用比色法測定蛋白質(zhì)濃

11、度,實驗原理,紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu),在分光光度法中，許多不吸收光的無色物質(zhì)可以用顯色反應(yīng)變成有色物質(zhì)，使之能進(jìn)行比色測定，并能提高測定的靈敏度和選擇性。在比色分析或分光光度分析中，將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫做顯色反應(yīng)，與待測組分反應(yīng)生成有色化合物的試劑叫顯色劑。 在實際分析中，同一待測組分可與多種顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，生成不同的有色物質(zhì)。為了保證測定的靈敏度和準(zhǔn)確度，在分析時常需對顯色反應(yīng)進(jìn)行選擇，選擇原則如下： 1. 選擇性好，干擾少或干擾易消除； 2. 靈敏度要高； 3. 生成有色化合物的組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定； 4. 生成的有色化合物與顯色劑之間的顏色須有明顯的差別，最大吸收波長之差大于60nm,顯色劑與顯色反應(yīng),實驗步驟