實驗室常用菌株及特性

1、一、 實驗室常見菌株簡介Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+ lacIq (lacZ)M15 hsdR17(rK- mK+)。特點：具有卡那抗性、四環(huán)素抗性和氯霉素抗性。用途：分子克隆和質(zhì)粒提取。BL21(DE3)菌株基因型：F ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5)。特點：該菌株用于以T7 RNA聚合酶為表達系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達

2、受控于噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動子，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合于非毒性蛋白的表達。用途：蛋白質(zhì)表達。BL21(DE3)ply菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3) pLysS(cmR)。特點：該菌株帶有pLysS，具有氯霉素抗性。此質(zhì)粒還有表達T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達。 適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達。用途：蛋白質(zhì)表達DH5菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15 (

3、lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, 特點：一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株。 其80dlacZM15基因的表達產(chǎn)物與pUC載體編碼的-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)互補，可用于藍白斑篩選。recA1和 endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達。JM109菌株基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ (lac-proAB) e14- F traD36 proAB+ lacIq lacZM15hsdR17(rK-mK+)。特點：部分抗性缺陷，適合重復基因表達, 可用于M13克隆序

4、列測定和藍白斑篩選。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達。DH10B菌株基因型：F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 endA1 recA1 deoR (ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL -The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。host for pUC and other -complementation vectors; pBR322useful for generating genomic librarie

5、s containing methylated cytosine or adenine residues，useful for plasmid rescue procedures。ELECTROMAX DH10B T1 CELLS說明：DH10B細胞是高轉(zhuǎn)化效率的E. coli，可以完美應用于大多數(shù)實驗應用。DH10B基因型具有以下特點： lacZM15 用于重組克隆的藍/白斑篩選消除了mcrA、mcrBC、mrr和hsdRMS限制系統(tǒng)，允許構(gòu)建更多具有代表性的基因組文庫(1,2)endA1突變，可以增加質(zhì)粒產(chǎn)量和數(shù)量? 高效率轉(zhuǎn)化大小為150 kb的質(zhì)粒，用于產(chǎn)生cDNA或基因組文庫DH10

6、B?可以表達tonA的基因型，tonA能夠提供對T1和T5噬菌體感染的抗性(DH10B? T1R)。DH10B的基因型：F mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupGDH10B T1R的基因型：F mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupG tonARosetta(DE3)菌

7、株首先來一些大腸桿菌表達的基本概念：一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株，如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達載體的選擇上。表達載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復制子，篩選標記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的。復

8、制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復制子的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關(guān)，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復制元是否相容的問題。篩選標記和報告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個載體的篩選標記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注

9、意的問題應該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。 對于做表達來說，如果不是要研究啟動子的強弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選擇適用原核表達版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點啟動子：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模

10、式上看有組成型表達和誘導調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子，生物通在下面和后繼的文章中會逐一介紹組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。誘導調(diào)控型表達：表達載體采用誘導型啟動子，只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但

11、是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導表達的，也屬于誘導表達系統(tǒng)。融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。可溶性表達：大腸桿菌表達效率很

12、高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列

13、，其中能與rRNA16S亞基3端互補的SD序列對形成翻譯起始復合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達，要留意。表達菌株：我們往往最容易忽視的一點。不同的表達載體對應有不同的表達菌株，一些特別設(shè)計的菌株更有助于解決一些表達難題，這一點生物通會有專門的介紹。同樣的，交換獲得的免費菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？當心。注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！幾個常用的啟動子和誘導調(diào)控表達系統(tǒng) 最早應用于的表達系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，由 啟動子Plac + 操縱基因lacO + 結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負調(diào)控。lacU

14、V5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO 上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不

15、高，僅能滿足細胞自身的lac操縱子，無法應付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導致非誘導條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調(diào)控產(chǎn)物表達，能過量表達lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌株。現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導表達系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開發(fā)。熱誘導不用添加外來的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中

16、加熱升溫比較慢而影響誘導效果，而且熱誘導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。以噬菌體再起轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR表達載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴謹調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達系統(tǒng)，

17、就是將受trp啟動子嚴謹調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導抑制trp啟動子，抑制cI基因的表達，從而解除強大的PL啟動子的抑制。 T7啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流，這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強大的T7啟動子完全專一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍當二者同時存在時，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大

18、腸桿菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要將外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導條件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有何高招？且看生物通為你一一道來： 有幾種方案可用于調(diào)控T7 RNA 聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達系統(tǒng)。1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達菌株，構(gòu)建好的表達載體可以直接轉(zhuǎn)入表達菌株中，誘導調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導。2.另一種策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用CE6噬菌體侵染宿主細胞CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7 R