斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)期

1、.斑馬魚胚胎發(fā)育的分期CHARLES B. KIMMEL, WILLIAM W. BALLARD, SETH R. KIMMEL等 原著俄勒岡大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)學(xué)院；達(dá)特茅斯學(xué)院生物系黃萬(wàn)旭 譯浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院摘要：我們對(duì)斑馬魚（zebranfish, Danio rerio）胚胎發(fā)育的分期作了一系列的闡述。我們定義了胚胎發(fā)育的七段時(shí)期（period）合子（zygote）、卵裂（cleavage）、囊胚（blastula）、原腸（gastrula）、分節(jié)（segmentation）、咽囊（pharyngula），以及孵化期（hatching period）。這一劃分強(qiáng)調(diào)了發(fā)生于受精后頭3天的主

2、要發(fā)育過(guò)程中的變化情況，同時(shí)我們也回顧了發(fā)生于每一時(shí)期的諸如形態(tài)發(fā)生及其他主要事件。時(shí)期的下一劃分單位是分期（stage）。各分期都有名稱，而非標(biāo)號(hào)，反映了分期序列的靈活性和持續(xù)演變過(guò)程，因?yàn)槲覀儚倪@一物種中還能得到更多。各分期的命名是基于用解剖立體顯微鏡（dissecting stereomicroscope）觀察活體胚胎所容易觀察到的形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)的，同時(shí)也充分利用了活體胚胎的透明性，這一性質(zhì)使我們可以用組合顯微鏡（compound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference contrast illumination）觀察到即使很深

3、層的結(jié)構(gòu)。顯微照相（photomicro-graphs）和組合顯微描圖（composite camera lucida line drawings）則以圖片刻畫了每一分期。此外還有一些圖像則顯示了發(fā)育過(guò)程中一些可用作分期輔助標(biāo)志的顯著特征。關(guān)鍵詞：斑馬魚，形態(tài)發(fā)生，胚胎發(fā)生，合子，卵裂，囊胚，原腸，分節(jié)，咽囊，孵化目 錄概 述1全文組織結(jié)構(gòu)1步 驟3溫度與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)育時(shí)間8合子期（0-0.75h）9卵裂期（0.75-2.25h）9囊胚期（2.25-5.25h）12原腸期 (5.25-10h)16體節(jié)期（10-24h）21咽囊期（24-48h）33孵化期（48-72h）42早幼期48謝 辭48.概

4、述分期為發(fā)育研究提供了準(zhǔn)確度。這是因?yàn)椴煌呐咛ゼ词乖谕蝗后w中一起生長(zhǎng)，其發(fā)育亦有不同程度的差異，我們已看到在斑馬魚發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的不同步性。體外同時(shí)受精產(chǎn)生的胚胎，孵育于溫度合適的稀疏環(huán)境（28.5，5-10個(gè)胚胎/ml），最早期即出現(xiàn)不同步性，并隨時(shí)間延續(xù)愈加顯著。通過(guò)對(duì)比顯示，不同群體中的差異比同一群體中的更大?；虿町惸懿糠终f(shuō)明而不能完全解決這一問題，因?yàn)榧词箒?lái)自同一斑馬魚克隆系的胚胎其發(fā)育亦有不同步性。就不同胚胎而言，通過(guò)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分期可部分解決這一問題。例如，頭部的原始三叉神經(jīng)感受神經(jīng)元（primary trigeminal sensory neurons）和軀干的原始運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元

5、（primary motoneurons）都是在體節(jié)連續(xù)沿體軸出現(xiàn)這段時(shí)期內(nèi)開始軸突發(fā)生的。通過(guò)體節(jié)數(shù)目分期比通過(guò)受精后逝去的時(shí)間分期能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)這些神經(jīng)元在發(fā)育過(guò)程中的位置。參照分期序列來(lái)記錄實(shí)驗(yàn)?zāi)芴峁┖芎玫姆绞酱_保實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性，并允許隨后加入新的觀察結(jié)果和數(shù)據(jù)。一系列基于形態(tài)學(xué)的劃分同時(shí)也有利于交流，“18-體節(jié)胚胎”比“受精后18小時(shí)胚胎”這一稱謂含有更豐富的意義，尤其在交叉物種比對(duì)中。以往的斑馬魚發(fā)育分期盡管不如目前的完善，也相當(dāng)準(zhǔn)確地反映了頭一天的胚胎發(fā)育，并提供了多組有用的圖片（Hisaokaand Battle, 1958; Hisaoka and Firlit, 1960）。

6、Warga 和 Kimmel （1990）簡(jiǎn)要地描述了囊胚期和原腸期。本系列分期的先前版本見于已出版和發(fā)行的斑馬魚手冊(cè)（The Zebrafish Book，Westerfield,1994）一書。新版做了細(xì)微的修正和補(bǔ)充，更新版本可以電子版形式在. 獲得。表1. 早期發(fā)育的各時(shí)期時(shí)期h描述合子0新受精的卵子完成首個(gè)合子細(xì)胞周期卵裂0.75細(xì)胞周期2至7快速同步發(fā)生囊胚2.25快速間時(shí)同步（metasynchronous）細(xì)胞周期（8，9）在原腸中期轉(zhuǎn)變中變?yōu)檠娱L(zhǎng)的異步（asynchronous）周期；隨后外包（epiboly）開始原腸5.25內(nèi)卷（involution）

7、、聚合(convergence)和延伸（extension）等形態(tài)學(xué)運(yùn)動(dòng)形成上、下胚層和胚軸；持續(xù)到外包運(yùn)動(dòng)結(jié)束分節(jié)10體節(jié)、原始咽弓和神經(jīng)原節(jié)（neuromeres）發(fā)育；原始器官發(fā)生；開始運(yùn)動(dòng)；尾部出現(xiàn)咽囊24種系期（phylotypic-stage）胚胎；體軸由先前繞卵黃囊的彎曲狀態(tài)開始伸直；循環(huán)系統(tǒng)、色素沉著和鰭開始發(fā)育孵化48原始器官系統(tǒng)完成快速形態(tài)發(fā)生；軟骨在頭和鰭中發(fā)育；陸續(xù)開始孵化早幼72鰾膨脹；覓食及積極的躲避行為全文組織結(jié)構(gòu)我們命名了每一分期，而不是像其他序列那樣使用數(shù)字編碼，因?yàn)槊姆制诟鼮殪`活且易于記憶和識(shí)別。分期的定義不是一個(gè)瞬間的時(shí)刻點(diǎn)，而只是一個(gè)用以近似定位連續(xù)

8、發(fā)育過(guò)程中一小段時(shí)間的手段。有了分期命名，我們就可以很容易地加入所知細(xì)節(jié)，或是為了某一特定的研究在序列中插入一個(gè)新的分期，而無(wú)需求助于諸如小數(shù)、負(fù)數(shù)、正數(shù)這類令人生厭的工具。例如：我們現(xiàn)在描述了一個(gè)5-，隨后又描述了一個(gè)14-，但一項(xiàng)特定的研究可能要用到其間的8個(gè)分期（6-體節(jié)，7-體節(jié)等等），此時(shí)我們可以立刻明白其含義（而不必再行描述）。我們強(qiáng)調(diào)的是，這里不作描述并不意味將其排斥于分期之外。表2. 胚胎發(fā)育的分期a分期hHB描述合子期1-細(xì)胞01，2胞質(zhì)流向動(dòng)物極，形成胚盤卵裂期2-細(xì)胞0.753部分卵裂4-細(xì)胞1422排列的卵裂球8-細(xì)胞1.25524排列的卵裂球16-細(xì)胞1.5644排列

9、的卵裂球32-細(xì)胞1.757規(guī)則的2層卵裂球，有時(shí)48排列64-細(xì)胞28規(guī)則的3層卵裂球囊胚期128-細(xì)胞2.2595層卵裂球；卵裂面不規(guī)則256-細(xì)胞2.57層卵裂球512-細(xì)胞2.759層卵裂球；NO：YSL形成1k-細(xì)胞31011層卵裂球；NO：?jiǎn)闻臲SL核；卵裂細(xì)胞周期輕度不同步高囊胚3.3311層卵裂球；胚盤開始變平；NO：2排YSL核；分裂不同步橢形3.6611胚盤變平產(chǎn)生橢球形；NO：多排YSL核球形412球形；胚盤與卵黃之間為水平邊界穹頂4.3313仍為球形；當(dāng)外包開始時(shí)，卵黃細(xì)胞向動(dòng)物極頂起30%-外包4.6614胚層如倒置杯狀不均一增厚；邊緣達(dá)動(dòng)植物極距離30%原腸期50%

10、-外包5.25胚層厚度仍不均一胚環(huán)5.66胚環(huán)在動(dòng)物極可見；50%-外包胚盾615胚盾在動(dòng)物極可見；50%-外包75%-外包816背側(cè)明顯增厚；可見上下胚層和排泄（evacuation）區(qū)90%-外包9腦原基增厚；脊索原基從節(jié)板分離尾芽1017尾芽顯著；脊索原基從神經(jīng)突（neural keel）分離；早期小膨出（polster）；神經(jīng)突前側(cè)出現(xiàn)中間矢狀溝；100%-外包體節(jié)期1-體節(jié)10.33第一體節(jié)溝5-體節(jié)11.6618小膨出顯著；視囊，Kuperffer囊14-體節(jié)1619EL=0.9mm；眼基板；腦神經(jīng)元，V形軀干體節(jié)；NO：前腎導(dǎo)管20-體節(jié)1920EL=1.4mm；0.5YE/YB

11、1；YB/HD=2;早期觸碰反射和簡(jiǎn)單的應(yīng)激運(yùn)動(dòng)；視網(wǎng)膜色素沉著；背側(cè)條帶達(dá)12體節(jié)；弱循環(huán)；主動(dòng)脈至尾端一半；主靜脈編織；淺胸鰭芽；直尾；NO：尾端細(xì)胞退化；第1大動(dòng)脈弓血液循環(huán)原基-2536EL=2.7mm；HTA=75；OVL=1；PF(H/W)=3/4；早期運(yùn)動(dòng)；尾部色素沉著，背部條紋加深；強(qiáng)循環(huán)；單一大動(dòng)脈弓對(duì)；主靜脈達(dá)尾部3/4； NO：PF頂端上胚層緣高胸鰭42EL=2.9mm；HTA=55；1/2OVL1；YE/YB=1.5;YB/HD1.3;PF(H/W)=1；去絨膜胚胎游動(dòng)后背上位靜息；YE仍為錐形；PF頂端上胚層緣顯著；早期側(cè)帶；完整的背側(cè)帶；黃素細(xì)胞僅見頭部；虹膜色素細(xì)

12、胞僅見視網(wǎng)膜；心包顯著；NO：心腔；血管段；顎弓和舌弓；前腸發(fā)育；嗅覺纖毛；耳囊壁增厚孵化期長(zhǎng)胸鰭48EL=3.1mm；HTA=45；OVL=1/2；PF(H/W)=2；背上位靜息；YE開始變細(xì)，PF突出；背腹側(cè)條紋匯于尾部；側(cè)帶約6個(gè)黑素細(xì)胞；視網(wǎng)膜上虹膜色素細(xì)胞豐富；頭部顯著黃色；NO：循環(huán)見于2-4大動(dòng)脈弓及血管段；嗅覺纖毛擺動(dòng)；半規(guī)管（semicircular canal）；神經(jīng)丘（neuromast）胸鰭60EL=3.3mm；HTA=35；運(yùn)動(dòng)迅速難以分辨；YR變細(xì)融入YB；側(cè)帶約10個(gè)黑素細(xì)胞；PF變平成鰭形，有明顯的循環(huán)；視網(wǎng)膜虹膜色素細(xì)胞環(huán)加深；虹膜色素細(xì)胞出現(xiàn)于背側(cè)；NO：P

13、F軟骨和角質(zhì)鰭條（actinotrichia）；腸道；耳囊分2腔；早期頜軟骨；循環(huán)于5-6大動(dòng)脈弓；口仍小，開于腹側(cè)眼中線突口72EL=3.5mm；HTA=25；寬口突出于眼前方；虹膜色素細(xì)胞出現(xiàn)于卵黃帶；虹膜色素細(xì)胞覆蓋眼部一半；背部黃色與頭部色調(diào)同；NO：腮裂和腮絲芽基；腮弓1-5軟骨；鰓蓋覆住1-2腮弓；匙骨（cleithrum）a EL：胚體長(zhǎng)度；PF：胸鰭；HB：Hisaoka 和 Battle (1958)斑馬魚分期大致序列（一直到HB分期20大致準(zhǔn)確）；HD：背側(cè)觀頭部直徑；NO：Nomarski optics；H/W：高/寬；YB：卵黃球；YE：卵黃延伸部；YSL：卵黃合胞體層

14、；HTA：頭-肢角；OVL：耳囊長(zhǎng)度為從更廣的視角觀察發(fā)育過(guò)程，我們將數(shù)個(gè)分期歸為一組，形成更長(zhǎng)的時(shí)間段稱為時(shí)期（表1），并在文中總結(jié)了發(fā)生在這些時(shí)期內(nèi)的主要事件。術(shù)語(yǔ)表中定義了一些特定的術(shù)語(yǔ)，文中黑體字強(qiáng)調(diào)的術(shù)語(yǔ)在分期中是重要的。表2對(duì)各個(gè)分期作了簡(jiǎn)要的描述，而圖1則展示了相應(yīng)的草圖。我們可以利用這些資料大致定位我們所感興趣的一個(gè)分期，然后盡可能在文中和其他圖中找到更多細(xì)節(jié)。步 驟分期我們可以通過(guò)使用立體顯微鏡觀察活體胚胎來(lái)大致確定發(fā)育分期，通常用透射光（而非反射或入射光）以及高放大倍數(shù)（約50）。在體節(jié)期尾部伸長(zhǎng)，如果胚胎仍處于絨膜（chorion）內(nèi)，尾部最終將環(huán)繞驅(qū)干和頭部，以致不易觀

15、察。此時(shí)，我們必須將胚胎移出絨膜，可以使用5號(hào)鑷子（forceps）手工移去，也可用蛋白溶解酶（proteolytic enzyme）處理。咽囊晚期，一旦受到觸碰，胚胎（如已去除絨膜）會(huì)反射性游走，這種情況下，可用0.003%三卡因（tricaine）以麻醉之。反復(fù)麻醉和沖洗會(huì)嚴(yán)重阻滯隨后的發(fā)育，雖然看起來(lái)似乎輕微。Nomarski光學(xué)系統(tǒng)裝有Nomarski微分干涉相差光學(xué)系統(tǒng)和倍率15至40的物鏡的組合顯微鏡能揭示活體標(biāo)本更多的細(xì)節(jié)，利于精確分期。例如，Nomarski光學(xué)系統(tǒng)可在囊胚期和體節(jié)期實(shí)現(xiàn)最精確的細(xì)胞和體節(jié)計(jì)數(shù)。此外，“原基”期（”prim” stages）指后側(cè)線原基（prim

16、ordium of the posterior lateral line）這一結(jié)構(gòu)的位置，我們必須利用Nomarski光學(xué)系統(tǒng)以準(zhǔn)確確定大部分咽囊期的一些分期。將胚胎麻醉、去除絨膜，并置于橋接蓋玻片之間以利于觀察和隨后的恢復(fù)。 圖 1. 斑馬魚胚胎發(fā)育各分期顯微掃描圖。早期動(dòng)物極位于頂端，后來(lái)前緣成為頂端，例外的是原腸胚的胚環(huán)和胚盾期在其側(cè)面觀的圖片下顯示了相應(yīng)的動(dòng)物極（AP）觀圖片。卵裂期和囊胚期圖片為正面觀。胚盾期后為胚胎左側(cè)觀，但在胚盾出現(xiàn)前并不能確切地分辨哪一面是左側(cè)。 這里忽略色素沉著。 箭頭指示了以下分期判定的一些關(guān)鍵特征：1k-細(xì)胞期：YSL細(xì)胞核；穹頂期：隆起的卵黃合胞體；胚環(huán)

17、期：胚環(huán)；胚盾期：胚盾； 75%外包期：Brachet裂縫；90%外包期：胚層外圍包裹卵黃；尾芽期：小膨出；3-：第3體節(jié)；6-：眼原基（上方箭頭）、Kuperffer囊（下方箭頭）；10-：耳基板；21-：晶狀體原基；原基-6期：后側(cè)線原基（背側(cè)觀）、孵化腺（卵黃球上）；原基-16期：心臟；高胸鰭期：胸鰭芽。比例尺=250m 對(duì)活體胚胎進(jìn)行分期總是比將其致死和固定后再分期要好。例如在伸直和孵化期間的分期需要對(duì)頭部大小和卵黃質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，而固定期間會(huì)造成不同程度的收縮而破壞了正常的關(guān)系。然而，如果保存良好，我們可以利用其他標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)可靠地對(duì)固定或完全包埋的胚胎進(jìn)行分期，但切割后則不易分期。成像所

18、附圖片均為活體胚胎，后期為麻醉處理。原始圖片被制作為彩色幻燈片（柯達(dá) Ektachrome 160T DX），而黑白插圖由中間底片復(fù)制而成。彩色幻燈片可付費(fèi)向作者索取。顯示整個(gè)胚胎的低倍圖像由Zeiss STEMI立體顯微鏡獲得：將胚胎置于凹槽載片的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中，而不需要蓋玻片，介質(zhì)中含有1.5-3%甲基纖維素（methyl cellulose）以利于預(yù)期定位。顯示部分胚胎的高倍圖像由Nomarski光學(xué)系統(tǒng)（通常配合Zeiss 40浸水物鏡）攝得，使用Zeiss UEM組合顯微鏡。將胚胎包埋于蓋玻片之間，有時(shí)加1%瓊脂以固定。 溫度與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)育時(shí)間我們將分期信息轉(zhuǎn)換為“標(biāo)準(zhǔn)發(fā)育時(shí)間”，用字母h表

19、示，定義為在28.5這一適宜溫度孵育下受精后的小時(shí)數(shù)。孵育在其它溫度下會(huì)改變發(fā)育速度，而這在特定研究中可能會(huì)有用。例如，使兩個(gè)胚胎在某一時(shí)間達(dá)到不同的分期以作異時(shí)移植。對(duì)孵育于不同溫度下的胚胎進(jìn)行對(duì)比須謹(jǐn)慎進(jìn)行，因?yàn)椴荒鼙ＷC當(dāng)溫度變化時(shí)胚胎所有特性均隨發(fā)育速度作同步變化。然而，若是將胚胎保存在25-33范圍內(nèi)，其發(fā)育似乎正常，超出這一范圍溫度作長(zhǎng)時(shí)間孵育將出現(xiàn)異常。圖2顯示了在極值點(diǎn)的發(fā)育速率，圖右側(cè)的說(shuō)明提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的公式可用以估算出這一范圍內(nèi)的任一溫度下胚胎發(fā)育所能達(dá)到的某一分期。圖 2 . 孵育于25和33的胚胎孵育速度。A：尾芽期，B：突口期。縱軸為28.5標(biāo)準(zhǔn)溫度下孵育的分期?？梢?/p>

20、想象，28.5下的發(fā)育曲線為通過(guò)原點(diǎn)的直線，斜率1.0。注意到25和33下的發(fā)育曲線均為直線，且斜率在兩圖中幾乎相同。因此發(fā)育速度隨孵育溫度而變化，可用以下公式估算任一溫度下達(dá)到某分期所需發(fā)育時(shí)間：HT =h/(0.055T-0.57). HT為T溫度下的發(fā)育時(shí)間，h是在28.5下達(dá)到某分期所需時(shí)間（見表1）。分期縮寫：c: cell, d: dome, s: shield, b: bud; s: somite, p: prim, hp: high-pec, lp: long-pec, pf: pec-fin, pm: protruding-mouth. 方法：對(duì)自然產(chǎn)卵形成的胚胎進(jìn)行觀察，分

21、3組，每組20-30個(gè)胚胎，孵育于150ml大燒杯。用多項(xiàng)指標(biāo)確定分期，并確保取出觀察的胚胎與保留在燒瓶中的無(wú)發(fā)育差異。因?yàn)榇荡?、去絨膜、麻醉等處理會(huì)顯著阻滯發(fā)育，如此處理的胚胎比長(zhǎng)胸鰭期的對(duì)照組晚2-6小時(shí)。合子期（0-0.75h）新受精的卵子直至其第一次卵裂發(fā)生，稱合子期（圖3），約受精后40分鐘。受精時(shí)形成的合子直徑約0.7mm。合子期只含有一個(gè)分期，但其間也發(fā)生很多變化，可以很容易劃分這一時(shí)期（見Hisaoka and Battle,1958）。合子期的分期1-細(xì)胞期（0 h）.絨膜膨脹并脫離新受精的卵子（圖3A）。受精同時(shí)也活化胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)，約10分鐘內(nèi)很容易看到。非卵黃胞質(zhì)開始向動(dòng)物極

22、流動(dòng)，促使胚盤和卵黃顆粒豐富的植物極胞質(zhì)分離（圖3B）。這一分離在卵裂早期仍在繼續(xù)。 圖 3 . 合子期。A：受精后數(shù)分鐘，絨膜膨脹。B：受精后約10分鐘，動(dòng)物極朝上的去絨膜合子。非卵黃胞質(zhì)開始分離進(jìn)入動(dòng)物極。比例尺=250m卵裂期（0.75-2.25h）首次卵裂形成的兩個(gè)細(xì)胞，或稱卵裂球在間隔15分鐘后分開（圖4，5）。胞質(zhì)分裂為部分分裂，只是在胚盤底部不完全切開，卵裂球仍通過(guò)胞質(zhì)橋結(jié)構(gòu)相連。這一時(shí)期的6次卵裂通常按規(guī)則的方向方向發(fā)生，因而我們可以通過(guò)卵裂球的排列知道其數(shù)目，而不必一一計(jì)數(shù)。這一時(shí)期和下一時(shí)期的早期都可用Nomarski光鏡劃分每細(xì)胞周期以實(shí)現(xiàn)精確分期。胚盤中所有細(xì)胞都同時(shí)或

23、近似同時(shí)地完成細(xì)胞周期。約在細(xì)胞周期的前半部分，即細(xì)胞間期，細(xì)胞核存在且可見，核形態(tài)也發(fā)生系統(tǒng)性變化（見下，圖10）。每個(gè)早間期細(xì)胞核都是球形的，晚間期為類球體，其后隨細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，核逐漸變?yōu)闄E球體，直至有絲分裂前期消失。橢球體的長(zhǎng)軸指示了隨后卵裂的取向。有絲分裂期的染色體很難看到。近有絲分裂晚期，在胞質(zhì)分裂之前，卵裂球形狀變得更圓。卵裂期的分期2-細(xì)胞期（3/4 h）.結(jié)束第一個(gè)合子細(xì)胞周期的首次卵裂形成的卵裂溝是垂直的，一直到32-細(xì)胞期都是如此。卵裂溝在近動(dòng)物極形成，迅速向植物極伸長(zhǎng)，只經(jīng)過(guò)胚盤區(qū)域而不經(jīng)過(guò)卵黃區(qū)域（圖4A）。在近于胚盤底部，卵裂溝變?yōu)樗椒较?，以Wilson（188

24、9）最早描述的黑鱸（sea bass）那種方式切割胚盤，但仍只是部分與底下的卵黃區(qū)域分開。形成的兩個(gè)卵裂球體積相同，似乎不易相互區(qū)分。隨后的幾次分裂嚴(yán)格按第一次分裂的方向進(jìn)行，然而最終的身體對(duì)稱軸（即背腹軸和前后軸）似乎并不能完全由卵裂方向決定（Kimmel and Warga, 1987; Abdelilah等, 1994; Helde 等, 1994），而有些報(bào)道則認(rèn)為可以（Strehlow and Gilbert, 1993; Strehlow等, 1994）。4-細(xì)胞期（1 h）.兩個(gè)卵裂球不完全裂開（圖4B），裂平面以合適角度穿過(guò)動(dòng)物極和第一次卵裂面。因而第三細(xì)胞周期開始于22排列的

25、4個(gè)卵裂球。從動(dòng)物極看（見圖6）胚盤呈橢球體，而第二次卵裂面是沿長(zhǎng)軸方向的。圖 4 . 卵裂期胚胎。除B外均為正面觀，B顯示的是胚胎在動(dòng)-植物極的扭曲，約偏離正面45。 A :2-細(xì)胞期（0.75 h）；B：4-細(xì)胞期（1 h）；C：8-細(xì)胞期（1.25 h）；D：16-細(xì)胞期(1.5 h)；E：32-細(xì)胞期（1.75 h）；F：64-細(xì)胞期（2 h）。比例尺=250m圖 6. 動(dòng)物極觀，前5次卵裂平面示意圖。外圈為卵黃，A內(nèi)部橢圓為未分裂的胚盤。B-F為連續(xù)的卵裂，奇數(shù)次卵裂沿短軸切割胚盤，偶數(shù)次卵裂沿長(zhǎng)軸切割胚盤。引自Kimmel 等 (1991)，經(jīng)Wiley & Sons子公司W(wǎng)ile

26、y-Liss John Inc惠允。圖 5 . 受精后（在28.5），卵裂球數(shù)目隨時(shí)間變化的理想曲線，此段時(shí)間卵裂發(fā)生較為同步，在第10細(xì)胞周期的囊胚中期轉(zhuǎn)變之前。8-細(xì)胞期（1.25 h）.卵裂發(fā)生于第3細(xì)胞周期結(jié)束，仍為不完全卵裂。兩個(gè)獨(dú)立的卵裂面與第1次卵裂面平行，將胚盤切割為24排列的卵裂球。由于去絨膜胚胎通常側(cè)躺于培養(yǎng)皿，其4-細(xì)胞面（而非2-細(xì)胞面）正對(duì)觀察者。此“正面”觀（Kimmel and Law, 1985a）沿奇數(shù)卵裂面（卵裂溝1和3可見，圖7）。一直到囊胚晚期去絨膜胚胎總傾向于以此方向平展開，圖1第一部分（到高囊胚期）、圖4（4B除外）和圖7均為此“正面”觀所得。16-

27、細(xì)胞期（1.5 h）.第4組卵裂同樣沿兩個(gè)面進(jìn)行，均與第2次卵裂面平行，產(chǎn)生44排列的細(xì)胞，須小心與8-細(xì)胞期鑒別，因?yàn)槠湔嬗^很相似（圖4C,D）。第一次出現(xiàn)部分細(xì)胞完全與其他細(xì)胞分離，這些細(xì)胞是位于最中心處的4個(gè)卵裂球。此四分體在圖6E中完全被其他細(xì)胞包繞。全分裂發(fā)生于近16-細(xì)胞期末，因?yàn)榇舜温蚜褱舷葟呐弑P中心底部切開，再向外圍延伸。實(shí)際上，作底部切開的卵裂溝并未到達(dá)外圍，包圍此四細(xì)胞的12個(gè)細(xì)胞（稱外圍卵裂球）仍與卵黃細(xì)胞通過(guò)胞質(zhì)橋相連（Kimmel and Law, 1985a）。此分期之后直到囊胚中期，每次卵裂均能完全或大部分分離非外圍卵裂細(xì)胞，仍不能完全分離外圍卵裂細(xì)胞。圖 7.

28、 卵裂期正面觀顯微掃描示意圖，顯示從4-細(xì)胞期一直到64-細(xì)胞期卵裂球的世系關(guān)系。各卵裂球根據(jù)期世系標(biāo)號(hào)，同時(shí)也指出其位置。每一標(biāo)號(hào)代表胚胎中的兩個(gè)細(xì)胞，其中一個(gè)在圖中可見，而另一個(gè)須將胚胎沿動(dòng)-植物極軸旋轉(zhuǎn)180才可看到（比如，此處在4-細(xì)胞期只顯示2個(gè)細(xì)胞）。在4-細(xì)胞期，細(xì)胞L處于第1次卵裂面左側(cè)，細(xì)胞R處于右側(cè)（因此，這里的標(biāo)號(hào)L和R并非指未來(lái)胚體的左右側(cè)；見正文）。細(xì)胞L分裂產(chǎn)生L1（更靠近動(dòng)物極）和L2。L1分裂產(chǎn)生L11（更靠近動(dòng)物極）和L12，如此等等。對(duì)于64-細(xì)胞期，深層細(xì)胞沒有繪出。引自Kimmel and Law (1985a)，經(jīng)由Academic Press惠允。3

29、2-細(xì)胞期（1.75 h）.第5細(xì)胞周期結(jié)束時(shí)的卵裂通常發(fā)生于四個(gè)平行面，而不是位于第1和3卵裂面之間兩個(gè)平面。然而此時(shí)，斜向卵裂溝很明顯。通常32細(xì)胞呈48排列，但除規(guī)則排列之外，不規(guī)則排列也很常見。側(cè)面觀，在外圍和動(dòng)物極之間常可見雙層細(xì)胞。這是因?yàn)榕弑P平面彎曲，外圍細(xì)胞更近于植物極，其中的部分細(xì)胞排到了靠近動(dòng)物極的非外圍細(xì)胞之前。64-細(xì)胞期（2 h）.第6次細(xì)胞周期結(jié)束時(shí)的卵裂是水平的，所以從動(dòng)物極看細(xì)胞排列和32-細(xì)胞期很相似，只是正進(jìn)入第7次細(xì)胞周期的卵裂球體積較小。側(cè)面觀，細(xì)胞堆疊明顯變高（圖1，4F，7）。第一次出現(xiàn)部分細(xì)胞完全覆蓋其他細(xì)胞。被覆蓋的細(xì)胞（或稱深層細(xì)胞）都是由32

30、-細(xì)胞期的4個(gè)中心細(xì)胞中每個(gè)分裂產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞中的一個(gè)構(gòu)成；而另一個(gè)則仍處于表面，形成胚盤的最上層此時(shí)稱包被層（the enveloping layer , EVL）。與此同時(shí)，每個(gè)外圍細(xì)胞的水平卵裂也產(chǎn)生兩個(gè)EVL細(xì)胞，所以64-細(xì)胞期正面觀似有三層EVL細(xì)胞（圖7）。囊胚期（2.25-5.25h）囊胚期指從128-細(xì)胞期或第8次合子細(xì)胞分裂開始形成球形胚盤直到第14次卵裂開始原腸期為止這一段時(shí)期。此期有很多重要事件發(fā)生：胚胎進(jìn)入囊胚中期轉(zhuǎn)變（midblastula transition, MBT）、卵黃合胞體層（the yolk syncytial layer, YSL）形成、外包（ep

31、iboly）開始。外包將一直持續(xù)到原腸期。此期用“實(shí)囊胚”（ “stereoblastula”）稱之可能更準(zhǔn)確，因?yàn)檫@一術(shù)語(yǔ)意味著胚胎還沒有形成囊胚腔（blastocoele），而事實(shí)正是如此（圖8），僅在胚盤深層細(xì)胞之間存在不規(guī)則的間隙。卵裂取向不確定，比卵裂期亦更不規(guī)則。此后卵裂產(chǎn)生的子細(xì)胞從整齊的細(xì)胞面伸出，不論從側(cè)面還是從頂面觀都是如此，因而確定此期分期用細(xì)胞大小判斷比用細(xì)胞位置判斷更為有效。從動(dòng)物極觀，胚盤呈輕度橢球形（尤在早期）。圖 8 . 囊胚期胚胎正面觀。A：256-細(xì)胞期（2.5h）；B：高囊胚期（3.3h）；C：高囊胚期和橢形期之間的轉(zhuǎn)變（3.5h）；D：橢形期和球形期之間

32、的轉(zhuǎn)變（3.8h）；E：穹頂期（4.3h）；F：30%-外包期（4.7h）。比例尺=250m囊胚早期細(xì)胞繼續(xù)同步分裂，和之前節(jié)奏相同（圖5，9）。更準(zhǔn)確的說(shuō)，囊胚早期的分裂為間時(shí)同步，因?yàn)橛薪z分裂并不完全同時(shí)發(fā)生，相反，在每個(gè)細(xì)胞周期末期，一條波線穿過(guò)胚盤，近動(dòng)物極細(xì)胞最先進(jìn)入波線，外圍細(xì)胞最后進(jìn)入。波線一般斜穿胚盤，以致從正面觀可見波線沿胚盤長(zhǎng)軸穿過(guò)細(xì)胞野。圖 9. 囊胚中期轉(zhuǎn)變過(guò)程中細(xì)胞周期的延長(zhǎng)和同步性的減弱，開始于第10合子周期（512-細(xì)胞期）。A中不同的標(biāo)點(diǎn)表示從三種不同的胚胎中收集的數(shù)據(jù)；B中的分布表示一種胚胎中單個(gè)細(xì)胞周期的延長(zhǎng)。引自Kane and Kimmel (1993)

33、，經(jīng)Company of biologists Ltd. 惠允。細(xì)胞周期延長(zhǎng)標(biāo)志著囊胚中期轉(zhuǎn)變（MBT）的開始（圖9A）。并非所有細(xì)胞周期都同時(shí)延長(zhǎng)或延長(zhǎng)相同程度（圖9B）。MBT開始后的任意時(shí)刻，一些細(xì)胞處于間期，可用Nomarski光鏡很容易看到細(xì)胞核（圖10A,D），而另一些細(xì)胞處于有絲分裂期（無(wú)核，圖10C,E），因而形態(tài)學(xué)上可明顯看到不同步性。MBT開始于第10次細(xì)胞周期（512-細(xì)胞期），比爪蟾（Newport and Kirshner, 1982a,b）早兩個(gè)細(xì)胞周期，然而MBT的一些性質(zhì)以及如何控制開始，在兩物種間相同（Kane and Kimmel, 1993）。隨間期延長(zhǎng)，

34、細(xì)胞可以移動(dòng)，RNA合成增加。時(shí)滯分析（time-lapse analysis）顯示MBT開始后深部細(xì)胞在其長(zhǎng)的間期內(nèi)可動(dòng)，其運(yùn)動(dòng)似無(wú)方向性，至少表面上如此。囊胚早期的外圍細(xì)胞層則有所不同。它們緊挨著卵黃細(xì)胞排列并在整個(gè)卵裂期都與之通過(guò)胞質(zhì)相連。從第10細(xì)胞間期開始（Kimmel and Law,1985b），外圍細(xì)胞經(jīng)歷了一次塌陷，其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均留在與其緊密相連的卵黃細(xì)胞質(zhì)中。因此形成卵黃合胞體層（yolk syncytial layer , YSL），這一結(jié)構(gòu)用Nomarski光鏡可明顯看到，對(duì)分期也很重要（圖10）。YSL形成后，原先在胚盤第二層的EVL細(xì)胞成為最外層。它們看起來(lái)和先

35、前的最外層相似，但有一個(gè)重要的不同點(diǎn)在于此時(shí)的外圍細(xì)胞是非合胞體的：這也是第一次出現(xiàn)所有卵裂球均不與其它細(xì)胞通過(guò)胞質(zhì)橋相連，除了那些新分裂仍短時(shí)間相連的子細(xì)胞對(duì)之外。雖然YSL正好在MBT期間形成，但二者的調(diào)節(jié)機(jī)制似相互獨(dú)立。MBT獨(dú)自依賴于核-質(zhì)比（nuclear-cytoplasmic ratio , Kane, 1991）。YSL的核在囊胚中期繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂，但核分裂并不伴隨胞質(zhì)分裂，卵黃細(xì)胞仍不分裂并仍保持合胞體。由于在胚盤，囊胚中期YSL分裂周期延長(zhǎng)，但又并非延長(zhǎng)同樣多，YSL核繼續(xù)進(jìn)行間時(shí)同步分裂，并非不同步。約3個(gè)細(xì)胞周期之后，在外包開始同時(shí)，YSL分裂突然中止(Kane et

36、 al., 1992; 另見 Trinkaus, 1992)。YSL核開始增大，可能表示其正在活躍地轉(zhuǎn)錄RNA。YSL是硬骨魚（teleosts）特有的結(jié)構(gòu)，可能為胚外器官，對(duì)胚體無(wú)直接貢獻(xiàn)。起先YSL以窄環(huán)包繞胚盤邊緣（圖10），但很快（兩個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)）其延伸到胚盤底部，形成完全的“內(nèi)在”合胞體（“internal syncytium, the I-YSL）并一直持續(xù)到整個(gè)胚胎發(fā)生。I-YSL在胚胎細(xì)胞及其卵黃儲(chǔ)備之間的位置上，推測(cè)其可能發(fā)揮滋養(yǎng)作用。相應(yīng)的另一部分，E-YSL，在外包期間暫時(shí)性位于胚盤邊緣的“外部”。實(shí)際上，對(duì)硬骨魚類的克鯉魚（Fundulus）的研究顯示，E-YSL這一區(qū)

37、域在外包過(guò)程中有重要促進(jìn)作用（Trinkaus, 1984）。外包（epiboly）始于囊胚晚期（Solnica-Krezel and Driever, 1994），是YSL和胚盤變薄延伸覆蓋卵黃細(xì)胞的過(guò)程。就正如向頭上戴一頂滑雪帽一般，最終在原腸期結(jié)束時(shí)將卵黃完全吞入。在這一形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)的早期，胚盤高度變薄，從高高隆起的細(xì)胞堆疊（圖8B）變?yōu)閹缀跬缓穸鹊谋瓲疃鄬蛹?xì)胞（圖8F）。最內(nèi)部的細(xì)胞向外移動(dòng)達(dá)到表層，標(biāo)志外包運(yùn)動(dòng)完成，內(nèi)部細(xì)胞逐步運(yùn)動(dòng)過(guò)程中隨機(jī)與表層細(xì)胞混合（Wilson et a1.,1993）。這些所謂的激進(jìn)插入者（Keller, 1980）引起積極的細(xì)胞重組也是早期外包運(yùn)動(dòng)的驅(qū)

38、動(dòng)力之一。插入細(xì)胞并未驅(qū)動(dòng)深層細(xì)胞進(jìn)入包被層（EVL），EVL仍是獨(dú)立的單層（Kimmel et al., 1990b）。此外，外圍深層細(xì)胞其融合程度遠(yuǎn)比中心細(xì)胞輕（Helde et al., 1994），如圖8所示，外包開始前，細(xì)胞堆積很厚。外圍細(xì)胞融合的相對(duì)不足對(duì)相應(yīng)的早期發(fā)育建立意義重大，這是因?yàn)橹信邔訉倪@些非融合的外圍深層細(xì)胞開始（參見下文命運(yùn)圖，圖14）。假定標(biāo)示中胚層的事件如同爪蟾中似乎出現(xiàn)的那樣始于外包之前，那么外圍深層細(xì)胞群在外包期間相對(duì)融合不足可能在維持不同細(xì)胞“規(guī)格”（Kimmel et al., 1991）或特征中有重要作用。圖 10 . 卵黃合胞體層（YSL）的形成，

39、由Nomarski光鏡觀察所得。A：第10細(xì)胞周期間期的外圍卵裂球（512-細(xì)胞期，箭頭指示其細(xì)胞核）。B：當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，核消失，特殊的是無(wú)胞質(zhì)分裂，核分裂產(chǎn)生的一對(duì)子細(xì)胞核在第11細(xì)胞周期間期再次出現(xiàn)于胞質(zhì)中。在每一間期早期核均為球形（C），隨后，在再一次進(jìn)入有絲分裂期之前，核變大呈橄欖球形（D）。YSL核在有絲分裂期再次消失（E：第11次有絲分裂，注意到間期細(xì)胞核只在胚層細(xì)胞中出現(xiàn)，而不是在YSL中，意味著胚層和YSL已不再同步），間期又再次出現(xiàn)（F：第12細(xì)胞周期間期），如此經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)有絲分裂周期，總是位于公共的合胞體內(nèi)。引自Kimmel and Law (1985b)，經(jīng)Acad

40、emic Press惠允。比例尺=50m在激進(jìn)插入發(fā)生的同時(shí)卵黃細(xì)胞也發(fā)生明顯的形態(tài)變化，I-YSL表面向動(dòng)物極膨出或是“隆起”，這一變化是外包開始最明顯的標(biāo)志（圖8E），同時(shí)也大大增加了I-YSL與胚盤內(nèi)表面的接觸面積。卵黃細(xì)胞由于隆起而占據(jù)了深層細(xì)胞因激進(jìn)插入而空出的區(qū)域，同時(shí)也對(duì)深層細(xì)胞的外移施加了驅(qū)動(dòng)力。不論外包運(yùn)動(dòng)的結(jié)果如何，它都很明顯同時(shí)包括了胚盤和卵黃細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，并且迅速發(fā)生。在隨后的數(shù)小時(shí)內(nèi)，隨外包的繼續(xù)，E-YSL也繼續(xù)前行，穿過(guò)卵黃直達(dá)依附其上的細(xì)胞前方。至少在克鯉魚，橋粒（desmosome）有助于將E-YSL和EVL邊緣連接起來(lái)（Betchaku and Trinkau

41、s, 1978），而不斷伸展的YSL似乎將EVL丟在了后邊。外包似乎有賴于功能微管（Strahle and Jesuthasan, 1993）并可能受控于早期作用的合子基因（Kane, 1991）。目前已知最早表達(dá)的基因編碼位于局部的推定轉(zhuǎn)錄因子（putative transcription factors）并在囊胚晚期表達(dá)（如notail基因，Schulte-Merker et al., 1992；goosecoid基因，Stachel et al., 1993；snaill基因，Thisse et al., 1993）。在囊胚期EVL也發(fā)生變化。在卵裂期結(jié)束時(shí)EVL細(xì)胞數(shù)比深層細(xì)胞數(shù)多，但

42、隨著連續(xù)分裂EVL細(xì)胞數(shù)目大增，EVL變平、變薄，明顯延伸最終形成密封的更難看到的上皮單層。囊胚晚期，EVL細(xì)胞周期比深層細(xì)胞周期更長(zhǎng)，并表現(xiàn)出更少的同步性。同時(shí)EVL細(xì)胞也有了世系限制，其細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞總在EVL內(nèi)。但其發(fā)育潛能在囊胚晚期似并未受到限制，如將其逐個(gè)移至深層細(xì)胞，其子代將獲得新的分化方向。囊胚期的分期128-細(xì)胞期（2.25 h）.第8細(xì)胞周期始于128個(gè)細(xì)胞排列成高的細(xì)胞堆疊，位于卵黃細(xì)胞之上，呈緊密半球形。與早先卵裂不同，這一結(jié)束64-細(xì)胞期的卵裂溝很不規(guī)則，以至于此后幾無(wú)例外無(wú)法從細(xì)胞位置推斷其祖系。然而我們?nèi)匀豢梢耘卸硞?cè)面觀是對(duì)應(yīng)于先前的奇數(shù)次卵裂面（正面觀，見

43、前文）還是偶數(shù)次卵裂面，因?yàn)榕唧w仍和4-細(xì)胞期描述的那樣為橢球形。從正面觀，EVL細(xì)胞在動(dòng)物極和外圍之間排列成約5個(gè)不規(guī)則的層。256-細(xì)胞期（2. 5 h）.第8組卵裂結(jié)束時(shí)的正面觀（圖8A）顯示EVL細(xì)胞形成7個(gè)不規(guī)則的層。在第細(xì)胞間期，EVL細(xì)胞高度變薄，深層細(xì)胞數(shù)目大大超過(guò)了EVL細(xì)胞數(shù)目。第9次卵裂也是最后一次高度同步或間時(shí)同步的分裂。512-細(xì)胞期（2. 75 h）.此期開始囊胚中期轉(zhuǎn)變；細(xì)胞周期在后幾次分裂中不斷延長(zhǎng)（圖9A）。正面觀，在動(dòng)物極和外圍之間有9個(gè)不規(guī)則的層。在此期的后半部尤其在正準(zhǔn)備進(jìn)入第10次有絲分裂時(shí)，外圍細(xì)胞（第一層EVL細(xì)胞）失去其連接卵黃細(xì)胞的底部邊界（圖

44、10A,B）。這一形態(tài)學(xué)變化預(yù)示著YSL形成的開始；外圍細(xì)胞在第10次有絲分裂后特異性地不進(jìn)行胞質(zhì)分裂。第10次卵裂相當(dāng)同步，以致我們?cè)?分鐘左右的時(shí)間里仍能看到所有細(xì)胞（包括卵黃細(xì)胞）都處于有絲分裂期（即無(wú)間期細(xì)胞核，圖10C），512-細(xì)胞期是可能發(fā)生此類情況的最后一個(gè)細(xì)胞周期。1 k-細(xì)胞期（3 h）.我們?？煽吹結(jié)SL形狀不規(guī)則并將共約20細(xì)胞核包含在圍繞胚盤邊緣的單一環(huán)中（圖10D）。第10次卵裂后的細(xì)胞數(shù)少于1024，因?yàn)樵谇耙环制诘谝粚樱ㄗ钔鈱樱〦VL細(xì)胞被并入了YSL。此外，還因?yàn)閅SL的形成方式，此期組成第一層YSL的細(xì)胞是前一分期第二層YSL細(xì)胞的子細(xì)胞。在某些胚胎，YSL

45、經(jīng)由兩個(gè)細(xì)胞周期才形成，其開始時(shí)間可能早于也可能晚于1 k-細(xì)胞期。YSL約有11層細(xì)胞。第11組有絲分裂的發(fā)生猶如波線穿過(guò)胚盤，這也是最后一次發(fā)生此種情況。在此期間，第一次可以看到許多細(xì)胞與其它細(xì)胞不同步，一些由間期細(xì)胞核，一些則沒有。高囊胚期（3.25 h）.此期標(biāo)志著胚盤“高聳”于卵黃細(xì)胞之上的終結(jié)（圖8B,C）。在外圍細(xì)胞和YSL相遇處仍有一緊縮的環(huán)，或稱縊痕。可以通過(guò)胚盤細(xì)胞和YSL細(xì)胞核的外形和數(shù)目來(lái)區(qū)別高囊胚期與其前面的分期。側(cè)面觀可見在外圍和動(dòng)物極之間有至少11層EVL細(xì)胞。在整個(gè)高囊胚期胚盤的任一區(qū)域總有一些細(xì)胞處于間期，而另一些細(xì)胞則處于有絲分裂期。大部分胚盤細(xì)胞已完成第1

46、2次合子細(xì)胞周期，而有一些在此期已完成第13個(gè)合子細(xì)胞周期。YSL仍是薄的環(huán)形，但其外周輪廓更為平滑。YSL細(xì)胞核在其第2次分裂（第11次卵裂）時(shí)再次出現(xiàn)，通常仍都處于胚盤邊緣之外，并相互包裹得更緊密（圖10F）。橢形期（3.66 h）.隨著胚盤向卵黃的壓縮，動(dòng)-植物極軸變短?？梢韵胂?，這是由于表面持續(xù)增加的張力引起的。自從1-細(xì)胞期非卵黃細(xì)胞質(zhì)升高開始形成的胚盤外圍縊痕在此期減弱（圖8C）直至消失。最終從側(cè)面觀胚盤變?yōu)檩喞交臋E球形，因而此期被稱為橢形期。此時(shí)，卵裂高度不同步，其中許多處于第12或13次細(xì)胞周期。EVL此時(shí)極薄，須用Nomarski光鏡仔細(xì)觀察才能看到。YSL在胚盤底部伸展

47、開，同時(shí)也與胚盤分離。在此期間，YSL核形成數(shù)排，其中一些細(xì)胞核永久地留在了I-YSL。球形期（4 h）.動(dòng)-植物極軸的持續(xù)縮短使得囊胚晚期變?yōu)槠交慕蝮w。其整體形狀在此后數(shù)小時(shí)內(nèi)略有變化，很好地進(jìn)入了原腸期，而細(xì)胞重排比以往任何發(fā)育階段都要快?？赏ㄟ^(guò)對(duì)胚盤下部和卵黃細(xì)胞上部的I-YSL深層平面聚焦，根據(jù)其形狀區(qū)分球形期與其后的穹頂期，在前者該平面是平的或近于平的（圖8D）。此期大部分胚盤細(xì)胞處在第13次細(xì)胞周期，在EVL,此期尤其長(zhǎng)，以至于EVL中很少發(fā)生有絲分裂。E-YSL通常比前期明顯變薄，大部分YSL細(xì)胞核是內(nèi)在的。YSL發(fā)生最后一次核分裂。通常，去絨膜胚胎動(dòng)物極開始豎起，而不是像先

48、前那樣倒在一邊。穹頂期（4.33 h）.I-YSL表面深入胚盤，開始向動(dòng)物極隆起（圖8E）。這一發(fā)生于卵黃細(xì)胞和胚盤界面的顯著而快速的變化是外包運(yùn)動(dòng)開始的確切信號(hào)。EVL細(xì)胞處在較長(zhǎng)的第13細(xì)胞周期，而許多深層細(xì)胞已進(jìn)入第14細(xì)胞周期。E-YSL開始變窄（Solnica-Krezel and Driever, 1994）。YSL細(xì)胞核處于有絲分裂后期，也就是說(shuō)，與穹頂期前的有絲分裂期相比，此時(shí)的細(xì)胞核總是可見的，它們開始變大，很容易看到。30%-外包期（4.66 h）.外包運(yùn)動(dòng)，包括卵黃細(xì)胞的隆起，產(chǎn)生所謂的胚層（blastoderm），厚度幾乎一致（圖8F）。此時(shí)的胚層包括高度平坦的EVL單

49、層（須用Nomarski光鏡嚴(yán)格聚焦于胚層表面，否則不易見）和約4層細(xì)胞厚的深層細(xì)胞多層（deep cell multilayer , DEL）。胚層包被卵黃的程度提供了極有用的分期指標(biāo)。我們定義外包百分率（percent-epiboly）指從此期開始直至外包結(jié)束胚層所包被卵黃的程度。覆蓋百分率（percent-coverage）可能會(huì)更準(zhǔn)確地表達(dá)這一意思，但外包百分率著重于過(guò)程，且使用更為廣泛。因此，30%-外包時(shí)，是指沿動(dòng)-植物極軸估計(jì)，胚層邊緣達(dá)動(dòng)-植物極距離的30%。此期許多胚胎的胚層厚度并不嚴(yán)格一致。由于囊胚繞動(dòng)-植物極旋轉(zhuǎn)，從側(cè)面觀察將會(huì)看到其邊緣某一區(qū)域明顯比其它地方薄而平。這一

50、區(qū)域?qū)l(fā)育為胚胎背側(cè)（Schmitz and Campos-Ortega, 1994）。用低倍Nomarski光鏡最容易觀察到這一不對(duì)稱性。然而要完全確定背側(cè)尚需等到胚盾期（6 h）。原腸期 (5.25-10h)外包運(yùn)動(dòng)的繼續(xù)，以及形態(tài)發(fā)生細(xì)胞的內(nèi)卷（involution）、集合（convergence）和延伸（extension）運(yùn)動(dòng)的發(fā)生，產(chǎn)生了原始胚層和胚軸。內(nèi)卷運(yùn)動(dòng)的開始意味著原腸期的開始，目前可以說(shuō)是發(fā)生于50%-外包時(shí)（圖11A）。結(jié)果在達(dá)到50%-外包后的數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)增厚的外圍區(qū)域，稱作胚環(huán)（germ ring），幾乎與此同時(shí)完全包圍了囊胚邊緣（圖11B，及C箭頭所指）。隨

51、后集合運(yùn)動(dòng)幾乎同樣快速地沿胚環(huán)產(chǎn)生一個(gè)局部的堆積，稱胚盾（embryonic shield , 圖11D，及E箭頭所指）。在發(fā)生這些事件期間，外包暫時(shí)中止，但胚盾形成后外包又繼續(xù)。胚層邊緣沿卵黃細(xì)胞延伸直至將其完全包繞（圖11F-L）。其延伸近乎恒定速度進(jìn)行，約每小時(shí)包繞卵黃細(xì)胞的15%，這也提供了大部分原腸期分期的有用指標(biāo)（圖12）。正因?yàn)槟遗咂跊]有囊胚腔，原腸期既沒有消化道（archenteron），也沒有胚孔（blastopore）。DEL細(xì)胞在胚層邊緣進(jìn)行內(nèi)卷，因而發(fā)揮了胚孔的作用。內(nèi)卷通過(guò)將胚層向后折疊形成胚環(huán)。因此，胚環(huán)內(nèi)由兩個(gè)胚層：位于上方的稱上胚層（epiblast），在整個(gè)原

52、腸期繼續(xù)給位于下方的下胚層（hypoblast）提供細(xì)胞。注意到上、下胚層這些術(shù)語(yǔ)可同樣描述鳥類胚層結(jié)構(gòu)，但所命名的胚層在這兩種脊椎動(dòng)物中似乎完全不同。圖 11 . 原腸期發(fā)育。除特別標(biāo)注外均為左側(cè)觀，前側(cè)朝上，背側(cè)朝左。A：50%-外包期（5.25h）；B：胚環(huán)期（5.7h）；C：動(dòng)物極觀胚環(huán)期，箭頭指示胚環(huán)，胚盾將發(fā)育于胚環(huán)右下方的平坦區(qū)域；D：胚盾期（6h），胚盾標(biāo)志背側(cè)，是胚環(huán)左側(cè)增厚區(qū)域；E：動(dòng)物極觀胚盾期，箭頭指示胚盾；F：70%-外包期（7.7h），左邊的胚層背側(cè)比右側(cè)的胚層腹側(cè)厚，前軸下胚層或脊索前板（prechordal plate，箭頭所示）延伸近動(dòng)物極；G：70%-外包期

53、腹側(cè)觀，但微向前側(cè)傾斜以顯示此時(shí)很明晰的軸下胚層（箭頭所示）的脊索前板；H：75%-外包期（8h），箭頭示腹側(cè)薄的排泄區(qū)；I：80%-外包期（8.4h）背側(cè)觀，箭頭示軸中胚層與中線邊界，近軸中胚層在其一側(cè)；J：90%-外包期（9h），在一些胚胎中可見尾芽（箭頭所示）；K：90%-外包期腹側(cè)觀，前側(cè)脊索前板（對(duì)比G）增大為小膨出；L：尾芽期（10h），箭頭示小膨出，短箭頭示尾芽，尾芽腹側(cè)（即此圖左側(cè)）的顯著區(qū)域顯示外包結(jié)束時(shí)卵黃消失處。比例尺=250m發(fā)育時(shí)間（h）外包百分率圖 12. 外包期間胚層邊緣覆蓋卵黃前行的速率理想曲線（在28.5）。外包百分率指的是被胚層覆蓋的胚胎（胚層加卵黃細(xì)胞）占

54、整體的份額。在6.66h之后，其速率相對(duì)恒定，約為每小時(shí)外包15%。我們觀察了一起發(fā)育的多組胚胎（每組約12個(gè)）而獲得這些數(shù)據(jù)，此處忽略了胚胎中可能的變異。 作為形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)，胚層邊緣的內(nèi)卷似乎很好地證明了一種硬骨魚玫瑰無(wú)須鲃（rosy barb）的發(fā)育在很多方面與斑馬魚極為相似（Wood and Timmermans, 1988）。然而J.P Trinkaus 最近獲得了一些資料（尚未發(fā)表）證明克鯉魚的胚胎根本不發(fā)生內(nèi)卷，相反，近于表面的細(xì)胞獨(dú)自由表面向深部遷移，而不是以整個(gè)細(xì)胞層進(jìn)行卷動(dòng)。這一運(yùn)動(dòng)稱內(nèi)移運(yùn)動(dòng)（ingression），也可能在斑馬魚中發(fā)生（J. Shih and S.E. F

55、raser，尚未發(fā)表），這是用高分辨率的時(shí)滯分析對(duì)Wood和Timmermans曾觀察過(guò)的整個(gè)細(xì)胞野做進(jìn)一步研究所得。隨著細(xì)胞向內(nèi)運(yùn)動(dòng)，一條裂溝稱Brachet裂縫在Nomarski光鏡下開始變得可見（圖13），在橫斷面位于上下胚層之間。我們?cè)?5%-外包期的圖1中指出了這一裂縫的所在，但用立體顯微鏡常不易定位（對(duì)比圖11和13）。正常情況下，胚層的細(xì)胞不會(huì)跨過(guò)Brachet裂縫進(jìn)行融合（不過(guò)實(shí)驗(yàn)條件下可能，見下文）。兩胚層內(nèi)的細(xì)胞以各自不同的方向進(jìn)行流動(dòng)。除背側(cè)區(qū)域（見下文），上胚層通常向外側(cè)流動(dòng)，而達(dá)到外圍后又向內(nèi)運(yùn)動(dòng)進(jìn)入下胚層。然后，作為下胚層細(xì)胞游離外圍（Warga and Kimme

56、l, 1990）。原腸期結(jié)束時(shí)仍留在上胚層的細(xì)胞相當(dāng)于最后的外胚層（ectoderm），將產(chǎn)生諸如表皮、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)嵴以及感受基板等組織。而下胚層將產(chǎn)生中胚層（mesoderm）和內(nèi)胚層（endoderm），Thisse等（1993）稱之為“內(nèi)中胚層”（“mesendoderm”）。兩個(gè)名稱都強(qiáng)調(diào)了在原腸期的任一分期都不存在三個(gè)獨(dú)立的胚層，只有兩個(gè)。環(huán)繞大部分胚胎周圍的下胚層此時(shí)只有一兩層細(xì)胞厚（圖13），目前尚不知其何以分化成內(nèi)胚層和中胚層。圖 13 . 原腸中期胚胎的背側(cè)胚層，75%-外包期，Nomarski光鏡。我們將胚胎植物極朝上，輕輕平放于兩蓋玻片之間，再聚焦，大致在動(dòng)植物極中

57、線處獲得此光學(xué)剖面圖。因而，此圖是沿胚軸觀察而得，中心為中線結(jié)構(gòu)。上面的細(xì)胞中胚層覆蓋下面的卵黃細(xì)胞。EVL在此期極薄，不可見（但在表面觀可見）。箭頭示上下胚層的顯著邊界Brachet裂縫。上胚層似為厚度幾乎均一的多層細(xì)胞，但實(shí)際上此時(shí)它可能正在形成單細(xì)胞層的假層上皮（pseudostratified epithelium，Papan and Campos-Ortega, 1994）。下胚層夾在上胚層和YSL之間。遠(yuǎn)離背中線（例如箭頭附近區(qū)域）近軸中胚層似為單層立方細(xì)胞。特別在中線區(qū)域Brachet裂縫較不明顯，軸下胚層增厚，可能包含不止一層細(xì)胞。隨后，軸下胚層將同時(shí)貢獻(xiàn)于中胚層（如脊索）和內(nèi)胚層。比例尺=50m在4h時(shí)的球形期EVL發(fā)生世系限制之