蛋白不表達：常見原因及分析Word版

1、傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！蛋白不表達：常見原因及分析根據(jù)自己體會和蛋白版的既往精華帖子，總結(jié)了沒有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的原因，或者蛋白質(zhì)不表達的原因，歡迎大家拍磚。1.載體構(gòu)建錯誤。 這個屢見不鮮，很多克隆新人經(jīng)常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其克隆位點常有一兩個堿基的區(qū)別；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導致讀碼框錯誤，從而表達不出來。2.宿主菌選擇不當。不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進行表達。因此，

2、當你的蛋白沒有表達出來時，可以考慮更換宿主菌。見下圖3.密碼子的使用頻率低。有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個堿基之內(nèi)的稀有密碼子，對蛋白表達有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達似乎效果很好，對真核表達系統(tǒng)未見得有很好的效果。曾經(jīng)有某人在畢赤酵母表達某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優(yōu)化進行表達，結(jié)果還是沒有表達。一氣之下將該優(yōu)化的基因序列克隆到原核表達載體，表達量居然出奇地高！這是一個辛酸的笑話，但是一個真實的故事。但是有一點我可以有很大把握的說：對于真核表達，密碼子優(yōu)化只能起錦上添花的作用（確認有表達，以此來提高表達量），而不能雪中送炭（沒有表達出來，通過密碼子優(yōu)化極

3、有可能不奏效）。4、質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失。pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時，也許有可能產(chǎn)生-lactamase降解了抗生素，使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達重組的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，造成質(zhì)粒丟失。這種情況多見于真核表達系統(tǒng)。5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當?shù)鞍譔-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規(guī)則。N-端是Met時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met偷走，特別是Met后緊跟著一個帶小側(cè)鏈的氨基酸時。C-末端存在非極性氨基酸時，也容易導致蛋白被

4、降解。C末端最后5個氨基酸是極性的或者帶電荷的，則不易被降解。6、二級翻譯起始位點。這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結(jié)合位點完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預期大小的片段。7、SD序列。 這個不陌生吧？考研時老師喜歡出名詞解釋，也難怪人家老是拿這個出題-SD序列和起始密碼子序列（80%是AUG，也有GUG的）之間的距離，對蛋白表達的效率也有著非常重要的影響。SD序列本身的組成對翻譯效率也有影響。有時為了減少包涵體的產(chǎn)生，還特別對SD序列進行修飾呢！8、mRNA的二級結(jié)構(gòu)。在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和

5、核糖體結(jié)合位點和/或翻譯起始位點互補的序列。如然，你最好進行同義密碼子替換。否則由此形成的mRNA二級結(jié)構(gòu)，會讓翻譯嘎然而止的。9、意外終止。這種情況見于PCR擴增序列時，會和你開個不大不小的玩笑。比如它會將序列中間TAC突變?yōu)門AA，讓你的蛋白翻譯剎車。所以在進行表達之前，一定要進行測序，避免這種情況的發(fā)生。10、轉(zhuǎn)錄終止子。轉(zhuǎn)錄終止子的存在可以促進蛋白表達；但是缺少時就會造成“通讀”，沒完沒了地讀下去。這在pET系統(tǒng)里不成問題，因為它在靶基因的相反方向有個選擇性的標記基因。如果你的靶基因正好和這個標記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個轉(zhuǎn)錄終止子。如果沒有的話，它們會競爭得天昏地

6、暗，搶著生成mRNA和蛋白質(zhì)。11、mRNA的不穩(wěn)定性。 靶基因的mRNA常聚集于細胞內(nèi)。但是大腸菌的mRNA及其不穩(wěn)定。如果在mRNA的5-非翻譯區(qū)和3-rho非依賴性終止子處插入穩(wěn)定結(jié)構(gòu)序列，可以促進mRNA的穩(wěn)定性。尤其是5末端要是有個不帶突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能讓mRNA在胞漿內(nèi)無生命之虞。12、檢測方法的可行性。有時候，蛋白的確表達了，只是表達量特別低，或者和雜帶靠得特別近，致使你錯誤地以為蛋白沒有表達。這時候，你可千萬別忘記了生物學實驗的兩大黃金準則：對照和重復。說到對照，有很多層意思。最基本的意思是，要設立空載體對照。在真核系統(tǒng)表達的蛋白，常常量特別低。因此你不要老是想著WB和SDS-PAGE去檢測。這時候，你必須多看文獻，另辟蹊徑，從文獻中找找看這個蛋白有米有很特別的性質(zhì)-比如說如果它具有酶活性，那簡直就是便宜你了。還比如說，某些蛋白具有異樣性質(zhì)，比如說流感病毒的HA，你拿表達的不同梯度稀釋的蛋白做個血凝。如果發(fā)生血凝，并且呈現(xiàn)一定的梯度關系，那簡直就是板上