細菌和噬菌體的遺傳分析

1、第六章細菌和噬菌體的遺傳分析,第一節(jié) 細菌的遺傳分析,一、細菌的生物學(xué)特征 細菌是單細胞生物，完成每個世代只需20分鐘，而且容易得到它的生化突變型，它不僅在醫(yī)學(xué)上和農(nóng)業(yè)上重要，而且從進化角度上也是異常成功的，因為它占據(jù)地球上大部分的生物干重。 研究細菌遺傳的方法：主要是對細菌菌落形態(tài)的遺傳研究 (如圖，霉菌菌落) 原則上說，培養(yǎng)皿中每個細菌長成的菌落應(yīng)具有共同的遺傳組成，但是由于偶然發(fā)生的突變：形態(tài)性狀的突變，生理特性的突變或抗性的突變，而使這些突變后的細菌所形成的菌落與其他的菌落有所不同。 菌落形態(tài)性狀的突變包括：菌落的形狀、顏色和大小等,霉菌菌落,大腸桿菌,二、細菌的突變型 （一）營養(yǎng)缺陷

2、型 生理特性的突變包括：喪失合成某種營養(yǎng)物質(zhì)能力的營養(yǎng)缺陷型。 （二）抗藥突變型 抗性突變包括：抗藥性或抗感染性,三、細菌有性雜交 1964年Ledeberg和Tatum用大腸桿菌K，證明細菌有性雜交存在。 （一）大腸桿菌雜交試驗 A bio-(生物素) met-（甲硫氨酸） thr+（蘇） leu+（亮） thi+（VB1） B bio+(生物素) met+（甲硫氨酸） thr-（蘇） leu-（亮） thi-（VB1） A、B都為營養(yǎng)缺陷型，在基本培養(yǎng)基上不能生長,A 、B混合培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基上有10-710-8菌落,1、個別細菌由營養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)變?yōu)樵B(yǎng)型 a、基因突變 A bio- met

3、- bio+ met+ 或 B thr- leu- thi- thr+ leu+ thi+ 但單獨培養(yǎng)都未突變，間接說明不是。 b 、A B二細菌雜交 得 bio- met- thr+） leu+ thi+ bio+ met+ thr+ leu+ thi+ bio+ met+ thr- leu- thi- 2、營養(yǎng)物質(zhì)互補 A 能合成B不能合成物質(zhì),而B能合成A不能合成物質(zhì)，混合后二種物質(zhì)被同一細菌利用，可生長,二）U實驗 1950年Davis（戴維斯），做了U實驗，在U底部中間用濾片隔開，交替吸壓,證明菌落是由于AB二細胞接觸雜交基因重組,三）電境觀察-接合管,證實有性雜交存在。 問題：AB

4、二細胞遺傳物質(zhì)是混合，還是單向轉(zhuǎn)移,四）遺傳物質(zhì)單向轉(zhuǎn)移 Lederberg和Tatum認為細菌雜交似高等生物，二細胞融合基因重 組，1953年Hayes(海斯)在驗證雜交時偶爾發(fā)現(xiàn)雜交中AB細菌作用不同，遺傳物質(zhì)是單向轉(zhuǎn)移，AB，不能BA,結(jié)果不同，表明A、B有性雜交作用不同，提出遺傳物質(zhì)單向轉(zhuǎn)移。 供體：提供遺傳物質(zhì)的細菌 雄性 A 受體：接受遺傳物質(zhì)的細菌 雌性 B 所以 AB 不久發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致單向轉(zhuǎn)移的是細胞質(zhì)中一個微小可轉(zhuǎn)移因子F因子,四、大腸桿菌 F- F+ Hfr F/菌株 （一）F- F+ 菌株 1、F因子結(jié)構(gòu): 細胞質(zhì)中環(huán)狀DNA，分三個區(qū)段 原點：轉(zhuǎn)錄起點 致育基 致育基因：決

5、定細菌的育性, 含有育性區(qū)的大腸桿菌在細胞 表面有很多毛狀的性纖毛（或性傘毛）。 配對區(qū)：與細菌環(huán)狀染色體配對區(qū)段相對應(yīng)，通過簡單的單交換可到細菌染色體上。 2、F因子存在方式 游離狀態(tài)：在細胞質(zhì)中 ，能自我復(fù)制獨立遺傳 整合狀態(tài)：整合到細菌環(huán)狀染色體上，與細菌染色體一起遺傳,3、F因子的特性 （1）決定大腸桿菌育性 F+菌株，含游離F因子 供體 雄性 F菌株，無游離F因子 受體 雌性 （2）F因子高頻率轉(zhuǎn)移 當(dāng)F+F, F+的F因子復(fù)制為二,通過接合管將F因子傳遞給F菌株,使F轉(zhuǎn)變?yōu)镕+,頻率高達95%,即高頻率的轉(zhuǎn)移F因子. 接合管的形成：菌株靠近細胞膜融合兩細胞間形成接合管 F因子轉(zhuǎn)移：

6、F因子從原點斷裂，以原點為先導(dǎo)，邊復(fù)制邊轉(zhuǎn)移（因此叫滾環(huán)復(fù)制），復(fù)制后的F因子轉(zhuǎn)移到另一個細胞中。細胞分開，使F-變成F+。 (3)基因重組的頻率低 當(dāng)F+F, F+菌株環(huán)狀DNA復(fù)制通過接合管進入F-細菌細胞，與F-細菌的基因交換，使基因重組，但頻率很低1%，菌落很少。 (4)F因子可以自發(fā)喪失,二）高頻重組菌株 （Hfr菌株） 1951年，卡瓦里（Cavalli）等人，1954年海斯（Hayes）先后在A菌株中分離出新的菌株。 1.1.特點 (1 1)可以作為供體，與B雜交，重組頻率比AB高1000倍，稱高頻重組菌株。 ( 2)轉(zhuǎn)移F因子頻率低 2、2.Hfr形成 F因子整合到細菌環(huán)狀DN

7、A上，這種整合狀態(tài)F菌株叫Hfr（高頻重組,3、HfrF,雜交過程也是先形成接合管，然后Hfr邊復(fù)制邊轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的順序：原點配對區(qū)大腸桿菌基因配對區(qū)育性基因。 整合到細菌環(huán)狀染色體上的F因子容易在原點處斷開，并以線性以原點為起點進入受體細胞中，將細菌環(huán)狀染色體上基因帶入受體細胞中，基因重組頻率高。但在轉(zhuǎn)移過程中，結(jié)合管很易斷開，這樣轉(zhuǎn)移到受體的部分只是靠近原點的一部分（全部轉(zhuǎn)移需溫和條件120分鐘），形成部分二倍體。致育基因位于最后，而接合管隨時可能斷開，轉(zhuǎn)移F因子頻率低,三)接合生殖和交換特點 1、接合生殖 供體細菌的DNA通過接合管進入受體細菌，實現(xiàn)基因重組的方式。 由于Hfr或F的DNA

8、在轉(zhuǎn)移過程中，結(jié)合管很易斷開，進入受體細胞的DNA僅部分，在受體細胞中染色體為部分二倍體。 2、基因重組 （1）部分二倍體：一個完整的基因組和一個不完整的基因組所構(gòu)成的二倍體。其中受體的基因組叫內(nèi)基因子，供體的基因組叫外基因子。 外基因子轉(zhuǎn)移到受體以后，a) 以游離狀態(tài)存在，隨著細胞分裂代數(shù)的增加被稀釋，消失；b）與內(nèi)基因子發(fā)生交換、重組。 (2)基因交換過程,3）交換特點 交換發(fā)生在完整的F環(huán)狀染色體和供體線性染色體片段之間即部分二倍體 奇數(shù)交換，形成一個線狀分子，在大腸桿菌中不能復(fù)制，導(dǎo)致細胞死亡；無效交換。偶數(shù)交換，形成環(huán)狀重組體（有效）和線狀分子（不能復(fù)制，消失）。 只出現(xiàn)一種重組子（

9、雜交后代），無對應(yīng)重組體，真核生物出現(xiàn)四種雜交后代。 (四) F/菌株 F因子可從Hfr脫離成為F+，通常準(zhǔn)確脫離，偶爾不準(zhǔn)，使F因子帶有細菌的個別基因。這種帶有細菌個別基因的F因子，稱F/菌株。 （五）大腸桿菌的F-、F+、Hfr、F、菌株,五、細菌的遺傳作圖 （一）細菌的遺傳重組 原核生物的遺傳重組實質(zhì)上是指受體中插入來自供體的遺傳性不同的DNA片段，并把這種DNA片段或它的復(fù)本整合為受體基因組的一部分。受體的遺傳重組可以通過三種途徑來實現(xiàn)： 1、接合 供體細菌的DNA通過接合管進入受體細菌，實現(xiàn)基因重組。 2、轉(zhuǎn)化 游離的細菌DNA片段被不同的細菌細胞（受體）吸收. 3、轉(zhuǎn)導(dǎo) 一種細菌的

10、DNA片段經(jīng)過溫和的或有缺陷的噬菌體傳遞給另一種細菌,二）利用中斷雜交試驗作圖 人為的中斷大腸桿菌雜交而進行的基因定位叫中斷雜交法。 1、原理： 2、方法 沃爾曼（Wollman）、雅各布（Jacob） 疊氮化鈉 噬菌體 乳糖 半乳糖 鏈霉素 Hfr azir tonr lac+ gal+ strs F-： azis tons lac- gal- strr 將 Hfr與F-同時加入裝有完全培養(yǎng)基的大試管中，一定時間取樣振蕩，稀釋接種至添加str的基本培養(yǎng)基（葡萄糖和無機鹽）上，生長形成的菌落基因型為F-strr(F-或具Hfr部分基因的F-)，再把菌落分別轉(zhuǎn)移到只添加azi、ton、以lac或

11、gal為炭源的選擇性培養(yǎng)基上,進入F-的Hfr基因 8/ 不生長 有噬菌斑 不生長 不生長 無 9/ 生長 有噬菌斑 不生長 不生長 azir 11/ 生長 無噬菌斑 不生長 不生長 azir tonr 18/ 生長 無噬菌斑 生長 不生長 azir tonr lac+ 24/ 生長 無噬菌斑 生長 生長 azir tonr lac+ gal+ F因子約在120分鐘后進入,1）Hfr的基因按一定順序和時間間隔進入F- （2）每個基因進入F-有一定頻率，且在短時間內(nèi)達到最高 （3）進入F-越早，頻率越高 （4）F因子進入遲，頻率低,3、Hfr染色體上基因排列順序,4、細菌染色體為環(huán)狀,三) 基因

12、重組作圖 利用交換值做出連鎖基因圖 例如：已知lac+ 和ade+緊密連鎖，由中斷雜交知lac+ 比ade早進入受體。 作出兩連鎖基因連鎖圖。 選用雜交親本為Hfr lac+ ade+ strsF- lac- ade-strR混合后接種,由于lac+ 比ade+先進入受體，此時lac+ 已進入受體但不一定重組到細菌染色體上，兩種情況,四) 重組作圖,如果兩個基因間的轉(zhuǎn)移時間小于2分鐘，用中斷雜交法所得的圖距不太可靠，應(yīng)采用傳統(tǒng)的重組作圖法。例如，有兩個緊密連鎖的基因lac-(乳糖不發(fā)酵)和ade-(腺嘌呤缺陷型)，為了求得兩個基因間的距離，可采用Hfr lac+ ade+和F- lac- ad

13、e-的雜交實驗。用完全培養(yǎng)基但不加腺嘌呤，可以選出F- ade+的菌落,檢測,lac- ade+菌落數(shù)上菌落數(shù)上菌落數(shù) 交換值lac- ade+菌落數(shù)/ ade+菌落數(shù) 或?qū)⒂坝〉紼MB（伊紅甲基藍）完全培養(yǎng)基上 lac+ade+ 能發(fā)酵乳糖 菌落紫紅色 lac- ade+ 不能發(fā)酵乳糖 菌落白色 由上求出交換值為22，由中斷雜交實驗得到lac+比ade+早1分鐘進入受體，大量實驗統(tǒng)計1分鐘20,重組作圖,一 噬菌體結(jié)構(gòu)和類型 （一）結(jié)構(gòu) 病毒是比細菌更為簡單的生物，它們也只有一條染色體，即單倍體。有些病毒的染色體是DNA，還有一些病毒是RNA。 病毒主要是由蛋白質(zhì)外殼及其包被的核酸所組成的顆

14、粒。病毒可根據(jù)宿主(動物、植物、細菌)或遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)來分類。細菌病毒(Bacterial phage)，稱為噬菌體(phage)(如圖)，是目前經(jīng)過廣泛研究，了解比較清楚的一種病毒噬菌體是指浸染細菌、放線菌以及真菌的病毒。都沒有細胞結(jié)構(gòu)，由一個蛋白質(zhì)外殼包圍一段DNA或RNA（煙草花葉病毒為RNA病毒,第二節(jié) 噬菌體的遺傳分析,噬菌體,二)類型 烈性噬菌體 遺傳學(xué)上應(yīng)用較廣泛的是大腸桿菌的T偶數(shù)系列噬菌體。它們的外貌都象蝌蚪狀(如圖)。 T偶數(shù)系列噬菌體具有六角形的頭部，其內(nèi)部含有雙鏈DNA分子，尾部包括一個中空的針狀結(jié)構(gòu)及外鞘。末端是基板，由尾絲及尾針組成。 T偶數(shù)系列噬菌體的

15、尾絲附著在大腸桿菌表面時，通過尾鞘的收縮將噬菌體DNA經(jīng)中空尾部注入寄主細胞，破壞寄主細胞的遺傳物質(zhì)，并合成大量的噬菌體DNA和蛋白質(zhì)，組成許多新的子噬菌體，最后使細菌裂解，釋放出無數(shù)個子噬菌體。所以這樣的T偶數(shù)系列噬菌體稱為烈性噬菌體,溫和噬菌體 溫和噬菌體侵入細菌后，細菌并不裂解，即它們有溶源性的生活周期。例如和P1噬菌體可代表略有不同的溶原性類型。 噬菌體附著在大腸桿菌染色體的gal和bio位點之間的att座位上，它能通過交換而整合到細菌染色體上，整合的噬菌體稱為原噬菌體(圖,原噬菌體,P1噬菌體不整合到細菌的染色體上，而是獨立地存在大腸桿菌的細胞內(nèi)。 原噬菌體通過紫外線照射，或溫度改變

16、可轉(zhuǎn)變?yōu)榱倚允删w,P1噬菌體,二、噬菌體的突變型 快速溶菌突變型 少量T系列噬菌體（如T2）和大量大腸桿菌混合，涂于固體平板，噬菌體裂解速度越快，出現(xiàn)的噬菌斑越大。 野生型r+ 噬菌斑小，邊緣模糊 快速生長突變型r 噬菌斑大，邊緣整齊 基因型 r+ r- 表現(xiàn)型 噬菌斑小 噬菌斑大 溶菌時間 30 20,寄主范圍突變型 野生型T2（用h+表示）：只能浸染B菌株（對T2敏感的細菌），不能感染B2菌株（抗T2的細菌）； T2突變型（用h表示）：既能浸染B菌株，也能浸染B2菌株。當(dāng)在含有B/B2的固體培養(yǎng)基上接種h+后，出現(xiàn)半透明的噬菌斑；而接種h后，出現(xiàn)透明的噬菌斑,三、 噬菌體的基因重組和遺傳

17、作圖 h+r hr+ 子代噬菌體基因型 h+r hr+ h+r+ hr 含B/B2培養(yǎng)基上噬菌斑 大半透明 小透明 小半透明 大透明 交換值重組型噬菌體數(shù)/總噬菌斑數(shù)100%= h+r+hr/總100% =小半透明+大透明/總100% （二）連鎖圖 T2快速溶菌突變型有多種，如ra、rb、rc都形成大噬菌斑，用不同類型快速溶菌突變型與宿主范圍突變型雜交，結(jié)果如下： 雜交組合 h+r hr+ h+r+ hr 重組值 hr圖距 h+rahr+ 34.0% 42% 12% 12% 24% 24 h+rbhr+ 32.0% 56% 5.9% 6.4% 12.3% 12.3 h+rchr+ 39.0% 59% 0.7% 0.9% 1.6% 1.6 按圖距h、ra、rb、rc有4種排列,求drb-rc B型快速溶菌 rbrc+C型快速溶菌 rb+rc 混合感染大腸桿菌B， 子代噬菌體 rbrc+ rb+rc rb+rc+ rbrc 噬菌斑 大 大 小 大 交換值 rb+rc+ rbrc/總100%2小噬菌斑/總100% 求出drb-rcdrb-h， rb rc在同側(cè) 實驗表明（1）（2）都成立，提出連鎖圖為環(huán)狀,如（1）（2）