絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究進展

1、.絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究進展梁化亮（生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）Progress on antimicrobial peptide摘要 蛋白酶抑制劑（PIs）是一類能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，在許多生命活動過程中發(fā)揮必不可少的作用。根據(jù)活性位點氨基酸種類不同可將蛋白酶抑制劑分為四大類型:絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。其中尤以絲氨酸蛋白酶及其抑制劑在體內(nèi)一些重要生理活動中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用。其能對蛋白酶活性進行精確調(diào)控，包括分子間蛋白降解，轉(zhuǎn)錄，細胞周期，細胞侵入，血液凝固，細胞凋亡，纖維蛋白溶解

2、作用，補體激活中所起的作用。關(guān)鍵詞 絲氨酸蛋白酶抑制劑 分類 臨床應(yīng)用 防御1 絲氨酸蛋白酶抑制劑免疫系統(tǒng)是由組織，細胞，效應(yīng)分子構(gòu)成，并逐漸進化形成用于阻撓病原微生物的侵入攻擊，限制它們擴散進入宿主內(nèi)環(huán)境。這其中起到主要作用的是宿主產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑，廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白酶抑制劑在機體內(nèi)與相應(yīng)的蛋白酶形成一個動態(tài)的系統(tǒng)，在生物體系以及一系列的生理過程中起著調(diào)控作用1，是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它不僅能使侵入體內(nèi)的蛋白酶失活并且能將其清除，使附著在宿主表面的病原細菌無法附著生存。其中絲氨酸蛋白酶及其抑制劑在體內(nèi)一些重要生理活動中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用2。絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine

3、 protease inhibitor）泛指具有抑制絲氨酸蛋白酶水解活性的一類物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物、微生物體中3。在動物體中，絲氨酸蛋白酶抑制劑是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，一旦平衡失調(diào)即導(dǎo)致多種疾病，任何影響其活性的因素也會造成嚴重的病理性疾病。它們最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。作為調(diào)控物，絲氨酸蛋白酶抑制劑參與機體免疫反應(yīng)，對生物體內(nèi)的血液凝固、補體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細胞遷移、細胞分化、細胞基質(zhì)重建、激素形成、激素轉(zhuǎn)運、細胞內(nèi)蛋白水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等許多重要的生化反應(yīng)和生理功能有重要的影響4。鑒于其重要的生理功

4、能，絲氨酸蛋白酶抑制劑一直倍受研究者的關(guān)注，目前已分離得到多種天然絲氨酸蛋白酶抑制劑，同時如何將其更好地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域也成為近來研究熱點。1.1 絲氨酸蛋白酶抑制劑分類目前，典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑基于其序列、拓撲結(jié)構(gòu)及功能的相似性，至少可分為18個家族5，如表11所示。不同家族抑制劑的空間結(jié)構(gòu)也不同。通常這類抑制劑是片層或混合了螺旋和片層的蛋白質(zhì)，也可能是螺旋或富含二硫鍵的不規(guī)則蛋白質(zhì)。但它們都擁有規(guī)范的反應(yīng)活性位點環(huán)的構(gòu)象，從而使這些非相關(guān)的蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)功能6。因此典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑最明確最廣泛地代表了蛋白質(zhì)的趨同進化。1.2 SerpinsSerpins是一類分子量

5、較大的絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，氨基酸殘基數(shù)為350-500個，具有保守的空間結(jié)構(gòu)。Serpins多為單一肽鏈蛋白，其肽鏈結(jié)構(gòu)可表示為N端P15P9P1P1，P9P15C端，Pl是被靶酶中的底物識別位點識別的氨基酸7。距C端3040個氨基酸部位含有RCL(reactive central loop)，RCL暴露于蛋白表面，是serpins與目的蛋白相互作用的部位。Serpins最開始被認為起源于原核組織內(nèi)，但是到目前為止已經(jīng)在許多細菌和太古代的生物中發(fā)現(xiàn)8-10。但是這些原核生物的基因是否為原核serpins或側(cè)生基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的祖先還尚不得而知。1.2.1 Serpins的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)生物學(xué)對于我

6、們理解serpins的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。至今為止超過80種serpins結(jié)構(gòu)具有不同構(gòu)象，盡管serpins結(jié)構(gòu)多變，但是無論是無抑制活性的卵清蛋白（ovalbumin）或有活性的抗胰蛋白酶（antitrypsin）卻有著一些共同結(jié)構(gòu)11-12。典型的serpins如antitrypsin和ovalbumin都擁有3個片層（命名為A，B，C）和89個螺旋（hAhI）。Serpins還有一個反應(yīng)活性環(huán)（RCL），它是一個凸出的，延伸的，暴露的環(huán)，它與蛋白酶凹陷的反應(yīng)位點高度互補，是抑制劑與目的蛋白相互作用的部位。二者的結(jié)合方式與酶與底物的作用方式相似。RCL的氨基酸順序決定了抑制劑的選擇性

7、。改變RCL的氨基酸順序，尤其是Pl位點的氨基酸，也就改變了該抑制劑的蛋白酶選擇性。多數(shù)Serpins的P1部位均為精氨酸，并且他們能抑制不同的絲氨酸蛋白酶。RCL易被靶酶之外的蛋白酶切除比較不同Serpins的氨基酸順序發(fā)現(xiàn)：雖然典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑的同一個家族成員中，氨基酸序列呈現(xiàn)出高度的多樣性，但RCL的主鏈構(gòu)象卻很相似，即RCL及其相鄰部位的幾個氨基酸順序在該家族中是保守的。即使在不同家族中也一樣，在同酶形成復(fù)合物后，RCL的主鏈構(gòu)象就更加相似了13-14。Serpins能以多種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在15：(1)與靶酶作用之前的結(jié)構(gòu)。與卵清蛋白等其它晶體結(jié)構(gòu)類似，含有五條A B折疊鏈和一個R

8、CL螺旋區(qū)；(2)RCL被剪切的serpin，其鉸鏈區(qū)與RCL鑲嵌于A折疊；(3)C折疊解離出l鏈，使得鉸鏈區(qū)及RCL在無鍵斷裂的情況下可以完全插入到A折疊片段中(如PAI2、抗凝血酶等)：(4)抗凝血酶的部分鉸鏈區(qū)插入于左折疊。除此之外，最為重要的是與酶形成復(fù)合物時的Serpin結(jié)構(gòu)。非功能性抑制子(卵清蛋白)和潛伏性抑制子(PAI1)的RCL構(gòu)型表現(xiàn)出兩種極端的狀態(tài)，卵清蛋白的S4鏈不插入A折疊，而PAI1的RCL全部鑲嵌到A一折疊中。然而，這兩種具有極端結(jié)構(gòu)的Serpin均不能抑制蛋白酶。對抗凝血蛋白酶、肝素共價因子、MENT、鼠類抗胰蛋白酶等抑制劑與靶酶的復(fù)合物進行X射線晶體結(jié)構(gòu)分析，

9、發(fā)現(xiàn)RCL環(huán)的前兩個氨基酸會插入頂部A折疊中。這種部分插入的構(gòu)象由于能使得共價因子更方便地結(jié)合并插入serpins中，進行完全暴露的形態(tài)轉(zhuǎn)化16-17，因子它對于serpins是否具有抑制活性起到了關(guān)鍵作用。1.2.2 Serpins的作用機制在二十世紀七十年代術(shù)期，研究者們認為：serpins與其它蛋白酶抑制劑不同，它與靶酶以共價酯鍵相結(jié)合。然而，這是通過分析SDSPAGE中的變性復(fù)合物而不考慮其天然條件下的復(fù)合物得出的結(jié)論。后來的研究認為：天然的Serpin/Protease復(fù)合物是可逆的，因此二者不可能是共價結(jié)合，它不同于鎖鑰構(gòu)型，而是與Kunitz，Kazal型等小分子類抑制劑相似，很

10、可能是形成米氏復(fù)合物18。目前認為Serpin與其靶酶的作用方式有兩種19：“底物”途徑和“自殺”途徑。大部分serpins是以“底物”途徑與靶酶進行相互作用。在“底物”途徑中，Serpins與靶酶形成共價復(fù)合物20。Serpins結(jié)構(gòu)研究表明復(fù)合物形成期間，會發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化（緊密型松散型）21-24，即RCL環(huán)插入片層A中形成一個額外的第四股束，這種構(gòu)象變化對于serpins對靶酶的抑制作用相當(dāng)重要。酶(E)與抑制劑(I)先以氫鍵形成米氏復(fù)合物(EI)，然后再轉(zhuǎn)換成亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)（EIt），然后絲氨酸蛋白酶抑制劑P1部位氨基酸的梭基與靶酶絲氨酸蛋白酶的梭基之間形成酯鍵，繼而轉(zhuǎn)換成脂?；鶑?fù)合物(EI

11、*)，最后通過第二個復(fù)合物(EIt*)生成被剪切的抑制劑(I*)和仍有活性的酶（E）。上述可表示為：E+I EI 【EIt】 EI* EIt* E+I*第二種為“自殺”途徑。Serpin通過自殺性底物的作用機制與酶發(fā)生不可逆的反應(yīng)。酶最初與抑制劑的剪切位點P1-P1兩側(cè)的殘其相互作用，形成非共價的米氏復(fù)合物，然后剪切位點鍵攻擊酶活性位點絲氨酸，導(dǎo)致酶Ser195及P1位點羰基之間形成共價酯鍵，并且P1位點被剪切25。在“自殺”途徑中，Serpin的剪切比較緩慢，因此在Serpin發(fā)生剪切之前，Serpin/Protease復(fù)合物已經(jīng)分解。該途徑可表示為：E+I EI EI* E+I*2 蛋白酶

12、抑制劑臨床應(yīng)用天然的蛋白酶抑制劑具備抗病毒的潛能，能控制外源細菌釋放的蛋白酶水解抑制特異性病毒生長并使自身細胞不受傷害?；谏鲜龉δ?，蛋白酶抑制劑作為藥物使用已經(jīng)被研究開發(fā)了好多年，目前已被用于治療人類免疫缺陷?。℉IV）和高血壓等疾病26。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制劑是一個用于藥物治療的蛋白酶抑制劑27。ACE能催化血管緊縮素和血管緊縮素的水解，一個有效的血管收縮藥能使緩激肽失活。而ACE抑制劑通過降低周圍血管阻力達到降低血壓的目的，同時ACE抑制劑能降低蛋白尿和穩(wěn)定腎功能，對治療糖尿病腎病有療效。ACE抑制劑的使用最初源于1977年。目前其它的ACE抑制劑也已投入市場。這些藥物制劑的研

13、究成功引起了人們對于蛋白酶抑制劑治療作用的極大興趣。下面將集中介紹蛋白酶抑制劑針對多種疾病的潛在使用價值。3 魚類的病原微生物及防御魚類體內(nèi)外細菌，真菌和酵母菌生長所需的小分子化合物，如游離的氨基酸或者簡單的糖類都來自于酶解體外的生物大分子，包括蛋白酶和糖苷酶。這在細菌蛋白酶不受宿主蛋白酶抑制劑調(diào)控時，對于細菌感染非常重要，它能破壞宿主蛋白。目前的研究表明，許多病微原生物蛋白酶類都參與到了侵入組織進行破壞、宿主防御系統(tǒng)的侵入和宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等反應(yīng)中。為了應(yīng)對病原性細菌的攻擊，魚類以多因子協(xié)調(diào)的方式一起作用。魚類自身有許多非特異性，特異性，體液和細胞免疫機制來抵抗細菌性病害。非特異性的體液免

14、疫因子包括蛋白酶抑制劑，如轉(zhuǎn)鐵蛋白和抗蛋白酶；溶菌酶，C活性蛋白（CRP），抗菌肽和一些松散的，具有促炎癥反應(yīng)，趨化性和調(diào)理活性的補體參與吞噬反應(yīng)。這些反應(yīng)都首先由中性白細胞和巨噬細胞進行。吞噬細胞含有許多水解酶，被細菌刺激后會產(chǎn)生活性氧類（ROS）。ROS是高度殺菌的。另外，中性白細胞具有大量的髓過氧化酶（MPO），它能從鹵化物離子和H2O2產(chǎn)生殺菌離子。巨噬細胞能接收來自中性白細胞的MPO，這能增強它們的抗菌活性?？贵w組成了特殊體液免疫系統(tǒng)，它能抑制細菌粘附或非吞噬細胞的侵入，并能使細菌毒性失活。抗體可以作為調(diào)理素來激活補體，溶解細菌細胞，激活炎癥反應(yīng)，并進一步增強吞噬作用。巨噬細胞的殺菌

15、活性可以被與特異性抗原接觸的T淋巴細胞釋放的細胞活素類激活。這其中最為重要的免疫因子就是蛋白酶抑制劑，它是一種針對病原性細菌分泌的蛋白酶，改善由其參與的病理學(xué)過程，降低侵入細菌的生長速率，同時能重新構(gòu)建宿主防御的反應(yīng)體系的物質(zhì)。4 研究意義與展望鯽魚魚卵作為一種豐富的水產(chǎn)資源，其綜合利用潛力有待進一步開發(fā)，以提高其附加值。研究表明，魚卵中存在多種蛋白酶抑制劑成分，在魚卵中除執(zhí)行生理調(diào)節(jié)功能外，在病原生物防御中也起到了重要作用。然而，截止目前為止只對少數(shù)魚卵中的蛋白酶抑制劑進行了研究，且大多集中于半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究。因此，對其進行研究顯得極為必要，既可以進一步揭示魚類的自身防御機制，探討

16、其在魚卵中生理、防御功能，又可為其在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1 Braun, N.J., Schnebli, H.P., . A brief review of the biochemistry and pharmacology of Eglin c, an elastase inhibitor. Eur. J. Respir. Dis. Suppl J. 1998, 146, 541547.2 Hibbetts, K., Hines, B., and Williams, D. An overview of proteinase inhibitors J. J. Vet. Inter

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