中藥提取物對灰樹花深層發(fā)酵的影響

1、中藥提取物對灰樹花深層發(fā)酵的影響摘要：研究了中藥提取物對灰樹花深層發(fā)酵的影響，在試驗的6味中藥水提物中，茵陳、黃芪、薏苡仁、白花蛇舌草對灰樹花菌絲體的生長具有一定的促進作用，而連翹、黃芩對灰樹花生長抑制作用顯著；添加薏苡仁水提物的灰樹花發(fā)酵液中多糖的含量遠高于對照。在試驗的6種中藥醇提物中，薏苡仁促進灰樹花生長且呈量效關(guān)系，黃芩抑制生長，白花蛇草、黃芪、連翹、茵陳影響不顯著；每升發(fā)酵液中分別添加0.5 g白花蛇草、0.2 g薏苡仁、2.0 g連翹、0.5 g黃芪的醇提物時對灰樹花胞外多糖的生產(chǎn)有顯著的促進作用，但茵陳、黃芩的醇提物卻抑制胞外多糖的產(chǎn)生。試驗結(jié)果表明，白花蛇草、薏苡仁、連翹、黃芪

2、等中藥在合適的添加量下可以顯著促進灰樹花液體發(fā)酵胞外多糖的生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：中藥提取物；灰樹花；深層發(fā)酵；胞外多糖Effects of extracts from Chinese medicines on the submerged fermentation of Grifola frondosaAbstract:The effects of extracts from 6 kinds of Chinese medicines on the production of biomass andexopolysaccharide in the submerged fermentation of G.

3、frondosa were investigated in this paper. Of allthe water extracts of 6 kinds of Chinese medicine, 4 kinds can improve the culture of G. frondosa, 2 kindsinhibite the growth, and Coix lachryma-jobi can increase the production of exopolysaccharide. As to the 6kinds of ethanol extracts of Chinese medi

4、cine, C. lachryma-jobi can enhance the growth of G. frondosa,but Radix scutellariae inhibites the growth, other 4 kinds have no significantly influence. The productionof extracellular polysaccharide can be enhanced by the ethanol extracts from Oldenlandia diffusa, C.lachryma-jobi, Weeping forsythia

5、and Astragalus membranaceus at the best levels (0.5 g/L, 0.2 g/L, 2.0 g/L, 0.5 g/L, respectively). The ethanol extracts from R. scutellariae and Artemisia capillaris can inhibit the灰樹花(Grifola frondosa)又名千佛菌、栗子蘑等，日本稱舞茸，是一種主要分布在亞熱帶至溫帶森林中的灰白色真菌，香味濃郁，質(zhì)地脆嫩，在民間有悠久的食用歷史，其子實體富含氨基酸、多糖以及微量元素等多種營養(yǎng)成分1?；覙浠ǘ嗵菫榛覙?/p>

6、花的主要生物活性成分，國內(nèi)外有關(guān)專家近年來研究發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖類物質(zhì)具有明顯的抗腫瘤、抗艾滋病病毒、免疫調(diào)節(jié)、治療肝炎等功效。特別是灰樹花多糖的抗腫瘤活性，比國際公認的抗癌新藥香菇多糖還要高許多2?；覙浠刹捎霉腆w栽培獲得，但周期較長；而液體深層發(fā)酵方法不受季節(jié)的影響，且具有液體菌種培養(yǎng)周期短，成本低，能快速增殖菌體細胞，活性物質(zhì)的有效成分易于控制，能顯著提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點，已受到人們的廣泛關(guān)注。目前國內(nèi)外對灰樹花液體深層發(fā)酵技術(shù)已取得較大進展，但如何進一步提高灰樹花活性成分(多糖類化合物)的產(chǎn)量，仍然是目前國內(nèi)外相關(guān)研究者的主要課題3-5。中藥含有萜類、黃酮類、生物堿、皂甙類、糖類、蛋白等豐

7、富的成分，研究表明一些中藥可促進靈芝菌活性產(chǎn)物的生物合成6-9。目前，中藥對灰樹花液體發(fā)酵的影響方面的研究報道較少，僅見山藥、苦蕎、天麻等少數(shù)幾味中藥10-12，結(jié)果顯示添加合適的中藥可促進灰樹花的生長代謝，為在更大的范圍篩選可促進灰樹花液體發(fā)酵胞外多糖合成的中藥種類，本文研究報道了6味中藥對灰樹花發(fā)酵菌體生長及活性代謝產(chǎn)物(胞外多糖)生產(chǎn)的影響。1 材料與方法1.1 菌種灰樹花(Grifola frondosa WZ)：由溫州大學發(fā)酵工程研究室保存。1.2 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(PAD)：20%馬鈴薯、0.15%KHPO4、0.075% MgSO4、2%葡萄糖、2%瓊脂。種子培養(yǎng)基：2%玉米粉、

8、2%葡萄糖、1%麩皮粉、0.15% KHPO4、0.1% MgSO4。發(fā)酵培養(yǎng)基：2.5%葡萄糖、0.3%蛋白胨、0.15% KHPO4、0.1% MgSO4、50 mg/L VB1。1.3 中藥材茵陳(Artemisia capillaris)、黃芪(Astragalusmembranaceus)、連翹(Weeping forsythia)、薏苡仁(Coix lachryma-jobi)、白花蛇舌草(Oldenlandiadiffusa)、黃芩(Radix scutellariae)：溫州葉同仁堂醫(yī)藥連鎖有限公司。1.4 主要儀器VS-840K-U超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHW

9、Y-2112B恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-40SBI滅菌鍋：申安醫(yī)療器械廠；JP-RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬儀器有限公司；TU-1810PC紫外可見分光光度計：北京普析通用分析儀器有限公司。1.5 中藥水提液的制備分別稱取中藥材(已切片)，加適量水浸泡4h，在電爐中煎熬，待中藥煮沸后，調(diào)整加熱強度，保持溫和的沸騰狀態(tài)，煮沸30 min，倒出藥汁。補加適量冷水于藥渣中，再次煮沸20 min，倒出藥汁。合并兩道藥汁，用8層紗布過濾，待用。1.6 中藥醇提物的制備中藥材分別磨碎，過60目篩，以乙醇浸提兩次，每次48 h，合并兩次提取液，減壓蒸去乙醇，置于85 烘箱中烘干

10、，得到中藥的醇提物。1.7 灰樹花的液體發(fā)酵將灰樹花菌種經(jīng)活化后接入已滅菌的種子培養(yǎng)基，250 mL錐形瓶中裝液量為80 mL，25 、150 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7 d，得到液體菌種。將一定量的中藥水提液或者烘干的中藥醇提物加入250 mL錐形瓶中，再加入基礎的發(fā)酵培養(yǎng)基，充分溶解混勻，接入灰樹花液體菌種，接種量10%，裝液量為80 mL，置于25 、150 r/min恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d。每個處理設3個平行，其中對照組是在不添加中藥的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結(jié)果，其他條件相同。secretion of exopolysaccharide. Bio-active polysaccharid

11、e of G. frondosa can be produced by addingappropriate amount Chinese medicines in the substrate to culture G. frondosa, such as O. diffusa, C.lachryma-jobi, W. forsythia and A. membranaceus.Key words:extracts of Chinese medicine; Grifola frondosa; submerged fermentation; exopolysaccharide食 品 科 技FOOD

12、 SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物與應用 187 2013年 第 38卷 第 09期1.8 生物量的測定將發(fā)酵液用紗布過濾濾得菌絲球，置于65 的干燥箱內(nèi)干燥至恒重，稱重得灰樹花生物量。1.9 胞外多糖的測定取發(fā)酵上清液，加4倍95%乙醇沉淀，4 放置24 h，3000 r/min離心20 min，棄去上清液，用85%乙醇洗滌沉淀兩次，3000 r/min離心20 min棄去上清液。所得沉淀待酒精完全揮發(fā)后，溶于蒸餾水以硫酸-苯酚法進行測定。2 結(jié)果與分析2.1 中藥水提物對灰樹花發(fā)酵的影響將6味不同的中藥切片分別煎汁制成水提物后，以187.5 g/L生藥量的劑量加入液體發(fā)酵

13、培養(yǎng)基中，接種灰樹花后培養(yǎng)7 d后測定灰樹花生物量和胞外多糖含量，結(jié)果如表1所示。圖2 中藥醇提物對灰樹花深層發(fā)酵胞外多糖生產(chǎn)的影響表1 中藥水提液對灰樹花深層發(fā)酵的影響中藥名稱 對照 茵陳 黃芪 連翹 薏苡仁 白花蛇舌草 黃芩生物量/(g/L) 3.730.20 5.050.31 4.410.28 0.550.01 4.610.28 6.320.85 0.750.17多糖含量/(mg/L)405.6 38.32.4 41.74.5 35.44.2 111.08.7 22.32.3 49.84.9從灰樹花發(fā)酵生物量來看，在所試驗的6種中藥水提物中，茵陳、黃芪、薏苡仁、白花蛇舌草對灰樹花菌絲體的

14、生長具有一定的促進作用，這4種中藥對應各組的生物量分別是對照組的1.181.69倍；連翹、黃芩對灰樹花生長抑制作用顯著，生物量僅為對照的14.7%和20.1%。從發(fā)酵液中多糖的測定結(jié)果來看，薏苡仁水提物灰樹花的發(fā)酵液中多糖的含量遠高于對照(為對照的2.78倍)，可能是薏苡仁中某些成分促進了灰樹花胞外多糖的分泌，但也有可能是薏苡仁水提物中本身中藥多糖的含量較高引起的。為了排除中藥本身所含多糖的干擾，本文進一步研究了6味中藥的醇提物對灰樹花液體發(fā)酵的影響。2.2 中藥醇提物對灰樹花發(fā)酵的影響選取茵陳、黃芪、連翹、薏苡仁、白花蛇舌草、黃芩等6味中藥，磨碎后用乙醇浸提，提取液蒸去乙醇后再烘干，所得的中

15、藥醇提物按不同濃度加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定灰樹花生物量和胞外多糖含量，考察不同濃度的中藥醇提液對灰樹花發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1、圖2。圖1 中藥醇提物對灰樹花深層發(fā)酵菌體生長的影響物能大大促進灰樹花菌體的生長，而且其促進作用呈現(xiàn)量效關(guān)系，當其添加量為2.0 g/L時生物量是對照的2.60倍；連翹、黃芪、茵陳、白花蛇舌草醇提物對灰樹花的生長影響不明顯；黃芩醇提物明顯抑制灰樹花的生長，以致這組的生物量數(shù)據(jù)都無法測得，而且產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)使發(fā)酵液的pH異常上升。與同種中藥水提物的影響相比較，發(fā)現(xiàn)黃芩的醇提物對灰樹花生長的作用與水提物一致，而連翹、薏苡仁、白花蛇舌草的兩種提取物對

16、灰樹花生長的作用卻不同。如薏苡仁醇提物對灰樹花生長促進作用極顯著(在2%的添加量時生物量是對照的2.72倍)，而水提物卻不顯著，可能薏苡仁醇提物中的某些弱極性物質(zhì)是灰樹花生長的促進因子，而水提物中這類促進因子沒有或者量太少。在利用靈芝發(fā)酵中藥的研究中也有類似的現(xiàn)象，薏苡仁油可以明顯促進靈芝的生長及多糖的生產(chǎn)，說明薏苡仁中肯定存在能促進靈芝、灰樹花等藥用真菌生長及多糖分泌的弱極性或非極性物質(zhì)，它們刺激藥用真菌生長及多糖分泌的作用可能是由于其脂肪酸與細胞膜結(jié)合，從而利于菌體結(jié)果表明，在試驗濃度范圍內(nèi)，薏苡仁醇提食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物與應用 188

17、 2013年 第 38卷 第 09期從培養(yǎng)基中攝入營養(yǎng)物質(zhì)，促進生長10。與中藥水提物相比，中藥醇提物對灰樹花胞外多糖的影響更能反映出真實的規(guī)律，因為醇提物基本排除了中藥中本身所含多糖的干擾。結(jié)果(圖2)表明，茵陳醇提物對灰樹花胞外多糖的產(chǎn)生有不同程度的抑制作用；黃芪醇提物在較低濃度時有一定的抑制作用，但隨著濃度的增加表現(xiàn)出對胞外多糖的促進作用；白花蛇舌草、薏苡仁、連翹醇提物能刺激灰樹花胞外多糖的分泌。在試驗濃度范圍內(nèi)，白花蛇舌草、薏苡仁、連翹、黃芪4種中藥醇提物的最佳添加量分別為0.5、0.2、2.0、0.5 g/L，對應的灰樹花胞外多糖產(chǎn)量分別為對照的1.83、1.33、1.30、1.28

18、倍。3 結(jié)論中藥中的成分與藥用真菌的生長代謝間存在著相互作用，因此中藥中的某些成分可能刺激藥用真菌的生長或活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生9,13。本文開展了添加多種中藥進行灰樹花發(fā)酵的試驗研究，對適合灰樹花發(fā)酵的中藥種類進行篩選，以期提高灰樹花液體發(fā)酵胞外多糖的生產(chǎn)。研究結(jié)果表明，白花蛇草、薏苡仁、連翹、黃芪等中藥醇提物在合適的添加量下(分別為0.5、0.2、2.0、0.5 g/L)，能促進灰樹花胞外多糖的產(chǎn)生，胞外多糖產(chǎn)率是對照組的1.281.83倍。有的中藥不僅含有能促進灰樹花多糖產(chǎn)量的功能因子，還能顯著刺激菌體的生長，例如薏苡仁，生物量最高可達到對照的2.60倍，而且薏苡仁是藥食兩用中藥，薏苡仁酯具

19、有很強的抗腫瘤活性14，基質(zhì)中添加薏苡仁進行灰樹花液體發(fā)酵，發(fā)酵液中可能包含灰樹花活性次生代謝產(chǎn)物(灰樹花多糖)及中藥活性成分(薏苡仁酯等)，具有良好的應用價值。而黃芩、茵陳等不適用于灰樹花發(fā)酵，黃芩水提物和醇提物對灰樹花生長以及胞外多糖的抑制作用極其顯著，茵陳雖然不抑制灰樹花的生長但卻不利于其胞外多糖的產(chǎn)生。至于中藥對灰樹花發(fā)酵的影響機理目前尚不清楚，還有待于進一步研究。參考文獻：1劉振偉,史秀娟.灰樹花的研究開發(fā)現(xiàn)狀J.食用菌,2001,23(4):5-62李小定,榮建華,吳謀成.灰樹花多糖藥理研究進展J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,15(14):364-3683汪維云,吳守一,朱金華.

20、灰樹花液體深層培養(yǎng)工藝研究J.生物工程學報,1999,15(3):378-3824Cui FJ, Li Y, Xu ZH, et al. Optimization of the mediumcomposition for production of mycelial biomass and exo-polymer by Grifola frondosa GF9801 using response surfacemethodologyJ. Bioresource Technology,2006,97:1209-12165Hsieh C, Liu CJ, Tseng MH, et al. Effect of olive oil on theproduction of mycelial biomass and polysaccharides ofGrifola frondosa under high oxygen concentration aerationJ.Enzyme and Microbial Technology,2006,39:434-4396楊海龍,吳天祥,章克昌.中藥提取液對靈芝深層