生物物質(zhì)的分離與純化演示課件

1、1,2,第十三章生物物質(zhì)的分離與純化,1、培養(yǎng)液的預(yù)處理 2、培養(yǎng)液的固液分離 3、細(xì)胞的破碎 4、生物物質(zhì)的分離純化方法 5、生物分離工藝介紹,教 學(xué) 內(nèi) 容,3,補(bǔ)充內(nèi)容（一,發(fā)酵醪(發(fā)酵液)的 一般特征,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵醪特性不同，其預(yù)處理方法和提取、精制方法的選擇也有差異。應(yīng)針對發(fā)酵醪的特性來合理選擇處理方法，大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在發(fā)酵醪中，也有少數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在菌體中，或發(fā)酵醪和菌體都 含有，例如四環(huán)類抗生素。各種發(fā)酵產(chǎn)物無論在發(fā)酵醪或是在菌中體現(xiàn)往往濃度較低，并與種種的溶解和懸浮的雜質(zhì)混在一起，要分離提純發(fā)酵產(chǎn)物，首先要針對發(fā)酵醪的特性進(jìn)行預(yù)處理,4,發(fā)

2、酵醪的特性一般可歸納為： 1、發(fā)酵醪大部分是水，一般含量達(dá)90%-99%. 2、發(fā)酵醪中發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，盡管由于菌種、原料、工藝條件不同，發(fā)酵產(chǎn)物于發(fā)酵醪中濃度的高低也有差異，但總的來說發(fā)酵醪中發(fā)酵產(chǎn)物濃度都是比較低的，除了酒精、檸檬酸、葡萄糖酸等發(fā)酵產(chǎn)物濃度在10%以上外，其余的都在10%以下，而抗生素的濃度更低，一般在1%以下。 3、發(fā)酵醪中的懸浮固體物主要含有菌體和蛋白質(zhì)膠狀物。由于發(fā)酵醪中存在一定數(shù)量的菌體和蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)，不僅使發(fā)酵醪粘度增加，不利于過濾，而且增加提取和精制后工序的操作困難，在濃縮過程中變得更粘稠，同時容易產(chǎn)生泡沫。采用溶媒萃取法提煉時，蛋白質(zhì)的存在奪產(chǎn)生乳化，使溶

3、媒相和水相分層困難；采用離子交換法提煉時，蛋白質(zhì)的存在也會增加樹脂的吸附量，加重樹脂的負(fù)擔(dān),5,4、發(fā)酵醪的培養(yǎng)基殘留成分中還含有無機(jī)鹽類，非蛋白質(zhì)大分子其降解產(chǎn)物對提取和精制均有一定的影響。 5、發(fā)酵醪中除了發(fā)酵產(chǎn)物外，常有其他少量的代謝產(chǎn)物。發(fā)酵過程中除了主代謝產(chǎn)物外，尚伴有一些其他的副代謝產(chǎn)物。這些少量的副產(chǎn)物，有時其結(jié)構(gòu)特性與發(fā)酵主產(chǎn)物極為近似，這就會給分離提純操作帶來困難。 6、發(fā)酵醪中還含有色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)。盡管它們的確切組成還不十分明了，但它們對提煉影響相當(dāng)大。為了保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)通過預(yù)處理將色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)先除去,6,發(fā)酵成熟醪中

4、常含有各種樣的雜質(zhì)，而所需要的發(fā)酵產(chǎn)物則含量很少。因此，要獲得純凈的發(fā)酵產(chǎn)物，它的提取與精制過程便成為一個復(fù)雜而必不可少的工藝過程。提取和精制的目的在于從發(fā)酵液中制取高純度的、合符質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的發(fā)酵成品。 盡管由于菌種、發(fā)酵醪的特征及發(fā)酵工藝的不同，發(fā)酵產(chǎn)物可以多種多樣，但從工業(yè)發(fā)酵范疇來看，從發(fā)酵醪中獲得產(chǎn)物大致可分為三類,發(fā)酵產(chǎn)物的分類,補(bǔ)充內(nèi)容（二,7,菌體 主要以菌體細(xì)胞作為發(fā)酵產(chǎn)品，如單細(xì)胞蛋白、面包酵母、飼料酶母等。此外就是從菌體細(xì)胞中提取有用的發(fā)酵產(chǎn)物，如由酵母細(xì)胞提取輔酶A、核糖核酸等產(chǎn)品。有的抗生素主要存在于菌絲體中，如灰黃霉素產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的灰黃霉素主要在菌絲中，

5、因此，也要從菌絲體中進(jìn)行提取。 酶 發(fā)酵產(chǎn)物為酶制劑，包括胞外酶和胞內(nèi)酶。如-淀粉酶、-淀粉酶、異淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、右旋糖酐酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、轉(zhuǎn)化酶、蜜二糖酶、柚苷酶、花青素酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基?；浮⑻於彼崦?、青霉素酰胺酶、磷酸二酰酶、天冬酰胺酶等，均在工業(yè)上和醫(yī)藥上發(fā)揮作用,代謝產(chǎn)物 中間代謝產(chǎn)物包括醋酸、乳、檸檬酸、葡萄糖酸、衣康酸及延胡索酸等。氨基酸發(fā)酵產(chǎn)物包括谷氨酸、賴氨酸、色氨酸等。由于對菌種的變異和氨基酸代謝機(jī)理的研究日益深入，所以其他氨基酸，除蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸外，18種氨基酸均可用直接發(fā)酵法制造,8,有機(jī)溶劑發(fā)酵產(chǎn)物包括酒精、丙酮、丁

6、醇等。 核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)物包括肌苷、肌苷酸以及鳥苷酸等。5-肌苷酸和5-鳥苷酸均為呈味核苷酸，核酸的微生物包括輔酶A、ATP、輔酶I等均為重要的醫(yī)藥品。 抗生素發(fā)酵產(chǎn)物包括青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素及利福霉素等。 多糖發(fā)酵產(chǎn)物包括右旋糖酐及多糖B-1459等。多糖是醫(yī)藥和工業(yè)上重要粘性物質(zhì)來源之一，右旋糖酐經(jīng)過部分水解后供代血漿用。多糖B-1459是水溶性、高分子量的胞外異多糖。 維生素發(fā)酵產(chǎn)物有核黃素、維生素C和維生素B12. 甾體氧化的產(chǎn)物為甾體激素，是重要的品。如醋酸可的松、氫化可的松、醋酸潑尼松、氫化潑尼松等促皮質(zhì)激素及腎上腺皮質(zhì)激素制劑、黃體酮

7、、甲孕酮（安宮黃體酮）等性激素、炔諾酮等避孕藥,9,問題,1、發(fā)酵醪有哪些特性,2、發(fā)酵醪中獲得產(chǎn)物大致可分為 、 、 三類,3、發(fā)酵液中的細(xì)胞代謝產(chǎn)物有哪些？分別舉出2個具體代表產(chǎn)物,10,生化生產(chǎn)過程的最后一個環(huán)節(jié)是把目標(biāo)產(chǎn)物從培養(yǎng)液或反應(yīng)液中分離提取出來。多數(shù)生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)微生物發(fā)酵、酶反應(yīng)過程或動植物細(xì)胞大量培養(yǎng)，并通過包括產(chǎn)物回收、粗分離、純化及精制等處理后，才能符合一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在生物產(chǎn)品生產(chǎn)過程中一般將微生物發(fā)酵、酶反應(yīng)過程或動植物細(xì)胞大量培養(yǎng)稱為“上游過程”，而與之相應(yīng)的產(chǎn)物回收、粗分離、純化及加工等后續(xù)過程就稱之為“下游過程”，或稱之為生化分離和純化過程。眾所周知

8、，要使生物技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)化，必須要上下游過程兼容、協(xié)調(diào)、以使全過程能優(yōu)化進(jìn)行。 鑒于生化產(chǎn)品具有如下特點：目的產(chǎn)物在初始物料中的含量低；含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除了產(chǎn)物外，還含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無機(jī)鹽等；生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差，對PH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，易失活、變性；生化產(chǎn)品種類繁多，包括了大、中、小分子量的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)雜又各異的生物活性物質(zhì)；生化產(chǎn)品的應(yīng)用面廣，許多產(chǎn)品用作醫(yī)藥、食品、試劑等，對含量和純度要求高等。因此，應(yīng)用于生化產(chǎn)品的后處理過程中的分離純化技術(shù)必須滿足以下一些要求,11,條件溫和，特別對具有生物活性的物質(zhì)，在后處理過程

9、中必須保持其生物活性； 分離純化技術(shù)的選擇性好、專一性強(qiáng)，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，以達(dá)到較高的分離純化倍數(shù)； 目的產(chǎn)物的量和活性具有較高的收率,應(yīng)用于生化產(chǎn)品的后處理過程中的分離純化技術(shù)必須滿足以下一些要求,12,在提高單個分離技術(shù)的收效率的同時，注意各單元操作間的有效組合和整體協(xié)調(diào)，以減少工藝過程的步驟； 快速，以提高生產(chǎn)能力。 就目前的發(fā)展和應(yīng)用情況來看，在大多數(shù)生物產(chǎn)品的開發(fā)研究中，后處理過程等的研究費用約占全部費用的50%以上，在產(chǎn)品的成本構(gòu)成中，后處理成本占總成本的40%-80%,對于精細(xì)胞和藥用的產(chǎn)品，此比例就更高。生產(chǎn)過程中后處理投入的人力和物力占全部的70%

10、-90%. 生物產(chǎn)品的后處理分離純化技術(shù)和工藝不僅影響產(chǎn)品的質(zhì)量和成本，也決定著產(chǎn)品的產(chǎn)量。生化產(chǎn)品由于沒有適當(dāng)?shù)奶崛　⒎蛛x和純 化方法或因回收率太低致使,13,生產(chǎn)成本過高而不能投產(chǎn)的例子是屢見不鮮的。 不同的生化產(chǎn)品，由于自身的特性及其對純度要求的不同，所采用的分離純化路線常常也是不同的。例如從發(fā)酵液中提取和精制菌體和胞內(nèi)酶，就與分離與純化細(xì)胞的代謝產(chǎn)物有明顯的不同；同樣即使產(chǎn)物都屬于代謝產(chǎn)物，由于產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，其提取和精制的方法也就不同。但一般來說，分離純化路線都包括了兩個基本階段：產(chǎn)物的初級分離階段；產(chǎn)物的純化精制階段,14,初級分離階段在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束之后，其任務(wù)是分離培養(yǎng)液、破

11、碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物（如果產(chǎn)物在胞內(nèi)）、溶解包涵體、復(fù)原蛋白質(zhì)、濃縮產(chǎn)物和去除大部分雜質(zhì)等。 純化精制階段是在初級分離的基礎(chǔ)上，用各種高選擇的手段和方法，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能地分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到相關(guān)的要求，成為級別的產(chǎn)品。 生物產(chǎn)品的后處理過程一般包括：發(fā)酵液的預(yù)處理；提??；精制三個步驟,15,圖13-1生物產(chǎn)品分離純化的一般步驟,發(fā)酵液或培養(yǎng)液,細(xì)胞產(chǎn)物,胞外產(chǎn)物,胞內(nèi)產(chǎn)物,離心或過濾細(xì)胞 （洗滌,離心或過濾 （洗滌,離心或過濾 （洗滌,細(xì)胞破碎 （化學(xué)法機(jī) 械法等,整體細(xì) 胞萃取,離心、過濾,干燥,分離劑回收、再生,提取、分離 沉淀、吸附、萃取、過濾等,分離劑回收、再生,純化、精制 層

12、析、結(jié)晶、電泳等,干燥,廢物,產(chǎn)物,產(chǎn)物,濾液,循環(huán),副產(chǎn)物,廢物,濾渣,副產(chǎn)物,循環(huán),廢物,細(xì)胞,濾渣,副產(chǎn)物,廢物,細(xì)胞,含產(chǎn)物的清液,預(yù)處理階段,16,一、培養(yǎng)液的預(yù)處理,問題,1、培養(yǎng)液的預(yù)處理的目的是什么,2、培養(yǎng)液的預(yù)處理包括哪些步驟,菌體細(xì)胞的分離 固體懸浮物的去除 蛋白質(zhì)的去除 重金屬離子的去除 色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的去除 改善培養(yǎng)液的處理性能 調(diào)節(jié)適宜的PH和溫度,17,二、培養(yǎng)液的固液分離方法,1、分離前的處理,加熱 由于加熱可能使某些熱敏感性蛋白發(fā)生不可逆的變性，因此這種預(yù)處理方法僅適用于對非熱敏感性產(chǎn)品發(fā)酵液的預(yù)處理。適當(dāng)加熱之后，發(fā)酵液中的蛋白由于變性而凝

13、聚，形成較大的顆粒，發(fā)酵液的粘度就會降低，一般加熱的用65-80 調(diào)節(jié)PH值 適當(dāng)?shù)腜H值可以提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性，減少其在隨后的分離純化過程中的損失。此外，發(fā)酵液PH值的改變會影響發(fā)酵液中某些成分的電離程度，從而降低發(fā)酵液的粘度。在調(diào)節(jié)PH值時要注意選擇比較溫和的酸和堿，以防止局部過酸或過堿。草酸是一種較常用的PH值調(diào)節(jié)劑。 加入絮凝劑 通常情況下，細(xì)菌的表面都帶有負(fù)電荷，可以在發(fā)酵液中加入帶正電荷 的絮凝劑，從而使菌體細(xì)胞與絮凝劑結(jié)合形成絮狀沉淀，降低發(fā)酵液的上粘度，利于菌體的收獲,18,2、固液分離方法,3、碟式離心機(jī)結(jié)構(gòu)及工作原理,進(jìn)料,輕液出口,菌體及固體雜質(zhì),當(dāng)發(fā)酵醪由轉(zhuǎn)鼓中心進(jìn)料入高

14、速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)，由于固、液比重不同，在碟片空間內(nèi)由于離心力的作用下，把發(fā)酵醪分成固相和液相兩部分。比重較輕的清液有規(guī)則地沿著碟片的上表面向碟片軸心方向移動，由環(huán)形輕液出口處排出，而比重較大的菌體及濃縮物，則有規(guī)則地沿著上一個碟片的底表面滑移到碟片邊緣，經(jīng)轉(zhuǎn)鼓壁上的噴嘴噴出收集于菌體收集器內(nèi)，從而達(dá)到分離菌體的目的。 此機(jī)的轉(zhuǎn)速可高達(dá)6000-10000r/min左右。我國廣州重型機(jī)械廠生產(chǎn)的DP-400型酵母高速離心分離機(jī)轉(zhuǎn)速為6500r/min，可適用于發(fā)酵工業(yè)的菌體分離,20,表13-2細(xì)胞破碎方法的分類,干燥處理,機(jī)械法,非機(jī)械法,固體剪切作用,流體剪切作用,破碎方法,溶胞處理,珠磨法,

15、壓榨法,超聲法,化學(xué)法,物理法,高壓勻漿,酶溶法,三、細(xì)胞的破碎,細(xì)胞破碎就是通過采用不同手段破壞細(xì)胞外圍使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來，轉(zhuǎn)入液相中，以便于進(jìn)行產(chǎn)物的分離純化。細(xì)胞破碎的方法有很多，按照是否存在在外加作用力可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。如圖13-2為細(xì)胞破碎方法的分類。 表13-2列出了主要的細(xì)胞破碎方法的原理，使用的設(shè)備、特點和存在的缺點,21,表13-2細(xì)胞破碎方法,22,問題,細(xì)胞破碎的方法的具體有哪些,四、生物物質(zhì)的分離純化方法,發(fā)酵產(chǎn)物的提取和精制過程也就是濃縮和純化過程，一般包括：發(fā)酵液的預(yù)處理；提取；精制三個步驟。在提取前還必須使菌體、懸浮固形物、固體發(fā)酵液開，即進(jìn)行過濾或

16、離心分離，并加入一些物質(zhì)或采取一些措施，以改變發(fā)酵液的性質(zhì)，便于以后的提取，這過程稱為發(fā)酵液的預(yù)處理。由于發(fā)酵液體積大，發(fā)酵液中的發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，一步操作遠(yuǎn)不能滿足要求，而常要好幾步操作。其中第一步操作從發(fā)酵液中分離提取發(fā)酵產(chǎn)物最為重要，稱為提取。而以后幾步操作所處理的體積小了，操作要容易些，主要將發(fā)酵產(chǎn)物部分除去雜質(zhì)、濃縮、提純及精煉，這過程統(tǒng)稱精制,用于生物物質(zhì)分離、純化的方法除了傳統(tǒng)的沉淀法、吸附法、離子交換、萃取法等之外，還有超濾、反滲透、電滲析、凝膠電泳、離子交換層析、新和層析、疏水層析、等電聚焦、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠團(tuán)萃取、凝膠層析等。表13-3、表13-4、表13-5分別

17、列出了一些生物分離純化技術(shù)及其它們的特點、經(jīng)濟(jì)性,23,表13-3主要的生物分離純化技術(shù)一覽表,24,問題,請列舉出生物物質(zhì)分離純化的方法（至少5個）,五、生物分離工藝介紹,生物產(chǎn)品的商品化，除了必須有良好、高效的生物分離純化的方法外，還必須對這些方法進(jìn)行合理的安排，以得到可用于大規(guī)模生產(chǎn)的、具有良好的經(jīng)濟(jì)的性的生物分離工藝。為了獲得優(yōu)化的生物分離工藝，保證生產(chǎn)目的的實現(xiàn)，設(shè)計具體工藝前一般需要考慮以睛的總體概念：P246 純度和質(zhì)量 成本 利用微生物、工程菌進(jìn)行發(fā)酵或動植物細(xì)胞培養(yǎng)、酶反應(yīng)等進(jìn)行生物產(chǎn)品的上游過程中的各種因素均對分離純化的方法和分離工藝有直接的影響。P246共7點,25,生化

18、產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)對分離純化技術(shù)和生物分離工藝有以下一些要求：P247 生物分離工藝設(shè)計的方法主要有：P247248 方法啟發(fā)式 設(shè)計啟發(fā)式 專家啟發(fā)式 數(shù)學(xué)模型式 合成式,生化產(chǎn)物在物料中的存在形式基本上有兩種情況：細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外。在工藝設(shè)計時為從原始物料中回收產(chǎn)品，首先需要進(jìn)行液-固分離，若產(chǎn)物是在溶液中，固-液分離后所得的含產(chǎn)物和大量雜質(zhì)的稀溶液，經(jīng)濃縮后，再進(jìn)行分離純化。而對于產(chǎn)物處于細(xì)胞內(nèi)時，固-液分離后，得到的細(xì)胞需要進(jìn)行破碎，使產(chǎn)物釋放到溶液中，再經(jīng)過液-固分離后，得到含產(chǎn)物和大量稀溶液，再經(jīng)濃縮,26,后，再進(jìn)行分離純化。若產(chǎn)物是在細(xì)胞內(nèi)以包涵體形式存在，須將包涵體與細(xì)胞碎片分離，經(jīng)過變性、復(fù)性后進(jìn)行分離純化。生物分離工藝的基本流程如圖13-4所示。 由于產(chǎn)物及種類不同，生化產(chǎn)品的分離純化工藝也是不同的。但工業(yè)生產(chǎn)工藝中的分離純化步驟的安排順序還是有一些共同點，總是將最容易分離的物質(zhì)放在前面，而將難以分離的物質(zhì)留在后面進(jìn)行分離。一般