酵母雙雜交原理

1、.酵母雙雜交系統(tǒng)原理酵母雙雜交系統(tǒng)(YeastTwo-hybridSystem)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結構域: DNA結合結構域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結構域(transcription-activating domain)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結構域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結構域可同轉(zhuǎn)錄復合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結構域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍具有各自的功能。而且不同兩結構域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵

2、母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白蛋白的相互作用。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構建融合基因時，測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達，其表達產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株

3、指經(jīng)改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點: 1 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。2具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結合結構域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結構域(如GAL4-ad，VP16)。激活結構域融合基因轉(zhuǎn)入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導致相鄰的報道基因表達(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結合作用。酵

4、母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結合作用，具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物而增強，后者又與啟動子DNA結合，此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩(wěn)定。通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。酵母雙雜交篩選原理雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。 細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工

5、作表明, 轉(zhuǎn)錄激活因子在結構上是組件式的(modular), 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成, 其中有DNA結合結構域(DNA binding domain, 簡稱為DB，？BD)和轉(zhuǎn)錄激活結構域(activation domain, 簡稱為AD), 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的DB雖然能和啟動子結合, 但是不能激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。 如酵母細胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉(zhuǎn)錄。 Fields等人的工作標志雙雜交系統(tǒng)

6、的正式建立。他們以與調(diào)控SUC2基因有關的兩個蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型, 將前者與Gal4的DB結構域融合, 另外一個與Gal4的AD結構域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白(prey or target protein)。 如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用, 那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子, 從而激活相應基因的轉(zhuǎn)錄與表達。 這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因(reporter gene)。 通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測, 反過來可判別作為“誘

7、餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。 在此Fields等人采用編碼-半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因, 并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。 這個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。 而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負調(diào)控因子)被缺失, 從而排除了細胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。 已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。 結果發(fā)現(xiàn)只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達載體的酵母細胞才有-半乳糖苷酶活性, 單獨轉(zhuǎn)化其中任何一個載體都不能檢測出-半乳糖苷酶活性。 目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建

8、立的系統(tǒng)為基礎的。 這些新系統(tǒng)主要對報道基因、“誘餌”表達載體以及“獵物”表達載體等做了一些改進。 其中一個重要改進是引入額外的報道基因, 如廣泛采用的HIS3基因。 經(jīng)過改造帶有HIS3報道基因的酵母細胞, 只有當HIS3被啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。 HIS3報道基因的轉(zhuǎn)錄表達是由“誘餌”和“獵物”的相互作用所啟動的。 大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時使用兩個甚至三個報道基因, 其中之一是 LacZ。 這些改造后的基因在啟動子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激活因子結合位點, 因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。 通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象。

9、其他還有針對“誘餌”或“獵物”表達載體等所作的改進, 這里不一一詳述。 在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化, 這個工作量是相當大的, 特別是尋找新的作用蛋白質(zhì)的時候尤其如此。 而且, 酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率比細菌要低約4個數(shù)量級。 因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術的瓶頸。 Bendixen等人通過酵母接合型的引用, 避免了兩次轉(zhuǎn)化操作, 同時又提高了雙雜交的效率。 在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型： a接合型和接合型, 這兩種單倍體之間接合(mating)能形成二倍體, 但a接合型細胞之間或接合型細胞之間不能接合形成二倍體。 根據(jù)酵母有性生殖的這一特點, 他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化接合型酵母細胞, “誘

10、餌”表達載體轉(zhuǎn)化a接合型細胞。 然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔(lawn), 再將兩種菌苔復印到同一個三重篩選平板上, 原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。 單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。 長出來的克隆進一步通過-半乳糖苷酶活力進行鑒定。 這項改進不僅簡化了實驗操作, 而且也提高了雙雜交的篩選效率。 在研究蛋白質(zhì)的結構功能特點、作用方式過程中, 有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。針對實際工作中的這種需要, Vidal等人發(fā)展了所謂的逆雙雜交系統(tǒng)(reverse two-hybrid syst

11、em)。 這項技術的關鍵是報道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反選擇的作用, 它編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成對細胞有毒的物質(zhì)。Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動子內(nèi)引入Gal4的結合位點。這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。 在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。 然而如果目的蛋白, 即與DB或AD融合的蛋白質(zhì)發(fā)生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用, URA3基因不表達, 則細胞能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長。

12、 通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的突變物, 這些突變物仍然能結合視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白RB, 但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結合能力。 結果得到了體外結合實驗的驗證。 通過對這些突變蛋白基因的測序, 他們發(fā)現(xiàn)了新的E2F1同DP1結合的位點。酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）是在酵母體內(nèi)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基因系統(tǒng)，也是一個基于轉(zhuǎn)錄因子模塊結構的遺傳學方法。該法由Fields等人于1989年首次建立并得到廣泛地應用。酵母雙雜交衍生系如酵母雙雜交的二元誘餌系統(tǒng)、逆向雙雜交系統(tǒng)

13、、非轉(zhuǎn)錄讀出特點的雙雜交系統(tǒng)（如Sos蛋白招募系統(tǒng)、PI3K介導的靶蛋白識別系統(tǒng)和斷裂-泛素為基礎的雙雜交系統(tǒng)）以及轉(zhuǎn)錄激活因子與其相關蛋白之間的相互作用的雙雜交系統(tǒng)（如以pol為基礎的雜交系統(tǒng)和RTA系統(tǒng)）等在很大程度上克服了傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性，擴大了被研究的蛋白質(zhì)的范圍，提高了系統(tǒng)的靈敏度。酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)是鑒定及分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。一、酵母雙雜交系統(tǒng)原理雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結構上是組件式的（mo

14、dular）, 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成, 其中有DNA結合結構域（DNA binding domain，簡稱為DB）和轉(zhuǎn)錄激活結構域（activation domain，簡稱為AD），它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結構域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結構域可同轉(zhuǎn)錄復合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結構域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍具有各自的功能，而且不同兩結構域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白-蛋白的相互作用。單獨的DB雖然能和啟動子結合，但是不

15、能激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉(zhuǎn)錄。雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒；具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因；酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA-結合結構域（如GAL4-bd，LexA-bd）；另一個基

16、因融合到轉(zhuǎn)錄激活結構域（如GAL4-ad，VP16）。激活結構域融合基因轉(zhuǎn)入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導致相鄰的報道基因表達，從而可分析蛋白間的結合作用。Fields等人以與調(diào)控SUC2基因有關的兩個蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的DB結構域融合，另外一個與Gal4的AD結構域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌（bait）”和“獵物或靶蛋白（prey or target protein）”。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用，那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，

17、從而激活相應基因的轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因（reporter gene）。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此Fields等人采用編碼-半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因，并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因（Gal80是Gal4的負調(diào)控因子）被缺失，從而排除了細胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結果發(fā)現(xiàn)只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1和

18、Snf2融合表達載體的酵母細胞才有-半乳糖苷酶活性，單獨轉(zhuǎn)化其中任何一個載體都不能檢測出-半乳糖苷酶活性。 酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結合作用，具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物而增強，后者又與啟動子DNA結合，此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩(wěn)定。通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時，酵母表型、X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。二、酵母雙雜交系統(tǒng)的應用

19、酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關系的技術。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領域中有著廣泛的應用。1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能酵母雙雜交技術已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRAR

20、Y載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。例如：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3為操作平臺，從成人腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相

21、關。為了研究兩個蛋白之間的相互作用的結合位點，找到影響或抑制兩個蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個氨基酸殘基和Synphilin-1的349-555個氨基酸殘基之間是相互作用的位點。研究它們之間的相互作用位點有利于基因治療藥物的開發(fā)。2、利用酵母雙雜交在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應則可以通過

22、酵母雙雜交進行檢測。例如：來源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應中，抗體的單鏈的三個可變區(qū)A4、G4、H3與抗原之間作用有強弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術，將DFR作為誘餌蛋白，編碼抗體的三個可變區(qū)的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉(zhuǎn)化改造后的酵母菌株中，并檢測報告基因在克隆的菌落中的表達活性，從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應。3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白互作

23、可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓撲異構酶NS3，以及細胞核轉(zhuǎn)運受體BETA-importin的相互作用有關。研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復制，從而達到治療這種疾病的目的。4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein Linkage Map）眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的。基因組中的編碼蛋

24、白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。三、酵母雙雜交系統(tǒng)方法及其優(yōu)化在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化，這個工作量是相當大的，特別是尋找新的作用蛋白質(zhì)的時候尤其如此。而且，酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率比細菌要低約4個數(shù)量級。因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用，避免了兩次轉(zhuǎn)化操作，同時又提高了雙雜交的效率。

25、在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細胞之間或接合型細胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點，他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化接合型酵母細胞，“誘餌”表達載體轉(zhuǎn)化a接合型細胞。然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔（lawn），再將兩種菌苔復印到同一個三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進一步通過-半乳糖苷酶活力進行鑒定。這項改進不僅簡化了實驗操作，而且也提高了雙雜交的篩選效率。V

26、idal等人發(fā)展了所謂的逆雙雜交系統(tǒng)（reverse two-hybrid system）。這項技術的關鍵是報道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反選擇的作用, 它編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。 該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成對細胞有毒的物質(zhì)。 Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動子內(nèi)引入Gal4的結合位點。 這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。然而如果目的蛋白，即與DB或AD融合的蛋白質(zhì)發(fā)生了突變或者由于外加藥物的干擾

27、不再相互作用，URA3基因不表達，則細胞能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長。通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的突變物，這些突變物仍然能結合視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白RB，但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結合能力。結果得到了體外結合實驗的驗證。通過對這些突變蛋白基因的測序，他們發(fā)現(xiàn)了新的E2F1同DP1結合的位點。在某些情況下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌珠可以在固體培養(yǎng)基上生長得很好。如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，可以通過基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域，然后重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，

28、同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。檢測pGBT對照載體的轉(zhuǎn)化效率，放置于SD/Trp平板上，轉(zhuǎn)化效率應該在 x 0 colonies/mg DNA以上。在雜交中，預轉(zhuǎn)化的誘餌細胞的數(shù)量可能不夠，雜交效率不高。當對誘餌菌株進行液體培養(yǎng)過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養(yǎng)，經(jīng)過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數(shù)。酵母雙雜交系統(tǒng)的原理與優(yōu)點酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）是在酵母體內(nèi)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基因系統(tǒng)，也是一個基于轉(zhuǎn)錄因子模塊結構的遺傳學方法。該法由Fields等人于1989年首次建立并得到廣泛地應用。酵母雙雜交衍生系如酵母雙雜交的二元誘餌系統(tǒng)、逆向雙雜交系統(tǒng)、非轉(zhuǎn)錄讀出特點的雙雜交系統(tǒng)（如Sos蛋白招募系統(tǒng)、PI3K介導的靶蛋白識別系統(tǒng)和斷裂-泛素為基礎的雙雜交系統(tǒng)