大腸桿菌計數(shù)

1、大腸桿菌計數(shù),嚴(yán)紀(jì)文,廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、 IMViC生化試驗 (靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽)為+ + - -或- + - -的革蘭陰性桿菌。,大腸桿菌的定義,大腸桿菌的某些菌株對人有致病性。 相對于大腸菌群和糞大腸菌群，大腸桿菌與糞便污染的相關(guān)性最好，應(yīng)用也最悠久。自1892年被提議作為糞便污染的指示菌以來，已被應(yīng)用了100多年 。 為什么后來又有了大腸菌群和糞大腸菌群的應(yīng)用？主要的原因是因為大腸桿菌的檢驗過于復(fù)雜。 大腸桿菌是用于評價食品近期受到糞便污染的指標(biāo)。 隨著食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的日益科學(xué)和細(xì)化，以及對大腸桿菌檢驗方法的不斷改進(jìn)，對特定食

2、品的大腸桿菌的檢驗需求肯定會越來越多，因此在本次標(biāo)準(zhǔn)修訂時增加了大腸桿菌計數(shù)方法。,衛(wèi)生學(xué)意義,大腸桿菌計數(shù),第一法：MPN法 第二法： VRBA-MUG平板計數(shù)法 第三法：Petrifilm測試片法,第一法 大腸桿菌計數(shù)MPN法,大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì),10倍稀釋,選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST,482h,361,不產(chǎn)氣,產(chǎn)氣,EC肉湯,450.2,242h,不產(chǎn)氣,產(chǎn)氣,EMB瓊脂平板,361,242h,營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng),I M Vi C生化試驗，革蘭染色,查MPN表，報告,初發(fā)酵,選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇

3、原液）。每個稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1mL（如接種量需要超過1 mL，則用雙料LST肉湯）。361培養(yǎng)48h2h，如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸桿菌MPN結(jié)果。,復(fù)發(fā)酵,如有產(chǎn)氣者，則轉(zhuǎn)接到已提前預(yù)溫至45的EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管放于帶蓋的44.50.2水浴箱內(nèi)，水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h2h，如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸桿菌MPN結(jié)果。,分離培養(yǎng)與純化,如有產(chǎn)氣者，則分別劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB）平板，361培養(yǎng)24h2h后檢驗平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。 挑選典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌

4、落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，進(jìn)行進(jìn)一步的純化分離。,生化鑒定,取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗。只要有1個菌落鑒定為大腸桿菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸桿菌陽性。 查MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸桿菌MPN值。,大腸桿菌與非大腸桿菌 的生化鑒別,注：如果是出現(xiàn)了這個表以外的生化反應(yīng)類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)該重新劃線分離，必要時需要重復(fù)試驗。,EMB瓊脂,主要成分：乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng)：伊紅和美監(jiān)。 原理：大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅與美藍(lán)結(jié)合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍(lán)二者的比例有關(guān)。 不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細(xì)

5、菌，在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍(lán)結(jié)合，因而形成無色的菌落。 部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。（應(yīng)注意非典型的菌落）。,EMB瓊脂上大腸桿菌的典型菌與可疑菌落,典型菌落：具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。 非典型的可疑菌落：粉紅色，無黑心,生化鑒定的注意要點,靛基質(zhì)試驗：361，24h 2h； 甲基紅試驗：361，4d；滴加甲基紅試劑，出現(xiàn)紅色為陽性；出現(xiàn)黃色為陰性結(jié)果。 V-P試驗： 361，48h 2h；滴加試劑后若未出現(xiàn)伊紅色，應(yīng)再培養(yǎng)2h后再觀察結(jié)果。 檸檬酸鹽試驗： 361，96h 2h；觀察有無細(xì)菌生長。有細(xì)菌生長培養(yǎng)基可變?yōu)樗{(lán)色。,第二法 VRBA-MUG平板計

6、數(shù)法,制訂依據(jù),美國食品藥品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria,基本原理,4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷，英文縮寫 MUG。是一種不產(chǎn)生熒光的底物。由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基傘形酮游離出來，在366nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。觀察到藍(lán)色熒光即可認(rèn)為是大腸桿菌陽性。MUG對大腸桿菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進(jìn)作用，對菌落形態(tài)也沒有影響。,VRBA-

7、MUG平板計數(shù)法檢驗程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì),10倍系列稀釋,選擇23個適宜稀釋度的樣液， 接種VRBA-MUG平板,紫外光下，計數(shù)發(fā)熒光的菌落,報告結(jié)果,361,1824h,檢驗,選取23個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別取1mL注入兩個無菌平皿。 另取1mL樣品稀釋液注入一無菌平皿中，作空白對照。 將預(yù)熱至45士0.5的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂10 mL15mL傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。 待瓊脂凝固后，再加3 mL4mL VRB-MUG覆蓋平板表層。 凝固后翻轉(zhuǎn)平板，361培養(yǎng)18 h24h。 注：空白對照不加VRB-MUG覆

8、蓋。,大腸桿菌平板計數(shù)與報告,選擇菌落數(shù)為10100的平板，暗室中360nm366nm波長紫外燈照射下，計數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。 兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報告每克(或毫升)樣品中大腸桿菌數(shù)，以cfu/g(mL)表示。,注意事項,在實驗時要用已知MUG陽性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC13048）做陽性和陰性對照。 在選擇計數(shù)平板時，選擇的菌落數(shù)不要太多太密，50個左右效果比較好些。原因是游離的4-甲基傘形酮有水溶性，能從菌落向培養(yǎng)基中擴散，菌落太多的話，尤其是陽性菌落太多時，很可能因熒光擴散，造成較大的誤差。 紫外燈的功率不要太大。功率大

9、了需要做好個人防護。,第三法 PetrifilmTM測試片法,基本原理,PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑，可增強菌落計數(shù)效果。E .coli能產(chǎn)生-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)藍(lán)點帶氣泡的菌落即為大腸桿菌數(shù)，紅點帶氣泡和藍(lán)點帶氣泡的菌落之和為大腸菌群數(shù)。,大腸桿菌PetrifilmTM測試片檢驗程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì),10倍系列稀釋,選擇23個適宜稀釋度的樣液， 接種

10、PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片,計數(shù)藍(lán)色帶氣泡菌落,報告結(jié)果,361,242h或482h,操作要點,合理稀釋度的選擇，每稀釋度接種2張測試片； 接種時將紙片置于平坦在實驗臺，接種后將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生； 培養(yǎng)基未凝固時勿挪動； 對于肉、家禽和水產(chǎn)品，培養(yǎng)時間為24h2h,對于其它產(chǎn)品，培養(yǎng)時間為48h2h。 培養(yǎng)時紙片堆疊不要超過20片。,結(jié)果判讀,大腸桿菌為藍(lán)點帶氣泡的菌落； 不論藍(lán)色深淺，部分藍(lán)色帶氣泡的菌落均為大腸桿菌； 圓形邊緣上及邊緣外的菌落不計數(shù)； 注意樣液菌量高的幾種情況； 藍(lán)點帶氣泡菌落和紅點帶氣泡菌落之和為大腸菌群數(shù)。,大腸桿菌測試片的計數(shù)與結(jié)果報告,選取菌落數(shù)在15150之間的測試片作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。 選擇菌落數(shù)在15150之間的稀釋度，平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15，則計數(shù)稀釋度最低的測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，則以()1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。,如果最高稀