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第十三章生化藥物和基因工程藥物分析概論,返回主目錄,基本要求,1掌握本類藥物質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法類型。2掌握HPLC法和酶活力測(cè)定法在本類藥物測(cè)定中的應(yīng)用。3熟悉本類藥物的范圍、種類、質(zhì)量控制的要點(diǎn)。4了解本類藥物含量測(cè)定的其他方法。,返回,一、藥物分類,第一節(jié)概述,1生化藥物：例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。,2.基因工程藥物：以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細(xì)胞生長(zhǎng)因子類藥物。,DNA重組技術(shù)（基因工程）：生產(chǎn)過程為,二、種類,氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類,酶類與輔酶類,多糖類,脂質(zhì)類,核酸及其降解物和衍生物類藥物,1生化藥物,2基因工程藥物的種類1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、人胰島素、人生長(zhǎng)激素2）細(xì)胞因子類藥物：人干擾素人白細(xì)胞介素、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素3）酶類及凝血因子類藥物,三、特點(diǎn)1.生物體的基本生化成分2.分子量大:分子量測(cè)定3.結(jié)構(gòu)難確證4.全過程的質(zhì)量控制：原料、生產(chǎn)過程、最終產(chǎn)品5.生物活性檢查,6.安全性檢查7.效價(jià)（含量）測(cè)定：理化法：有效成分的含量效價(jià)測(cè)定和酶活力測(cè)定：有效成分的生物活性,返回,生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項(xiàng)目：來源與種類純度性狀干燥失重或水分鑒別熾灼殘?jiān)彼峤M分分析生物活性肽圖熱源試驗(yàn)糖含量含量分析,第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法,一、鑒別理化鑒別法：化學(xué)鑒別法紫外分光光度法HPLC法生化鑒別法：酶法電泳法等電聚焦法生物鑒別法：家兔驚厥試驗(yàn),（一）理化鑒別法1.化學(xué)鑒別法：例：溶菌酶-CONH-+Cu2+絡(luò)合顯色,2.紫外分光光度法溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20g/ml判斷：max：2571nmA250/A260：0.170.27。3.HPLC法：利用對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。,4.酶法：例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法原理：,方法：取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置370.5恒溫水浴保溫，記時(shí)。反應(yīng)系統(tǒng)在3040秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時(shí)，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時(shí)內(nèi)不溶。,5.電泳法：以肝素鑒別為例。,與國(guó)家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置相應(yīng)。,6.生物法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。,（二）雜質(zhì)檢查一般雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查1.原料藥純度分析：多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質(zhì)酶類藥物-酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。,例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物進(jìn)行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個(gè)胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個(gè)單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%（g/g）。1:1000=x:50 x=0.05（mg）L=0.05/1=5%2.生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查,（三）安全性試驗(yàn)熱源試驗(yàn)異常毒性試驗(yàn):急性毒性物質(zhì)過敏試驗(yàn)：異性蛋白降壓物質(zhì)試驗(yàn)：導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)、組胺、類組胺,無菌試驗(yàn)：活菌基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查來源于宿主細(xì)胞的殘留DNA，外源性雜質(zhì)致突變?cè)囼?yàn)生殖毒性試驗(yàn),（四）含量測(cè)定生化藥物和基因藥物的含量表示方法：百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。生物效價(jià)或酶活力單位：適用于酶類、蛋白質(zhì)類藥物。,含量測(cè)定方法：理化分析法：化學(xué)分析法：重量測(cè)定法、滴定分析法電化學(xué)分析法光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、灌注色譜法、HPCE法酶法：酶活力測(cè)定法、酶分析法電泳法生物檢定法,返回,1電化學(xué)分析法藥物膜電極生物組織膜電極藥物電極微生物電極離子選擇性電極法免疫電極免疫場(chǎng)效應(yīng)管酶電極,第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用,2.HPLC法1）RP-HPLC：柱前衍生化自動(dòng)測(cè)定氨基酸柱：RP18，柱溫：48流動(dòng)相：A-0.05%TFA；B-乙腈-異丙醇（4：1）梯度洗脫熒光檢測(cè)器：ex=280nm340nm,em=430nm,測(cè)定：樣品-肽樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2，110，20h24h。樣品干燥：真空樣品的衍生化：丹酰氯水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/LNaOH進(jìn)樣測(cè)定,2）HPIEC測(cè)定對(duì)象：蛋白質(zhì)，多肽柱：離子交換鍵合相流動(dòng)相：0.3mol/L1.0mol/L的鹽的緩沖液。梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵素類鹽特點(diǎn)：可回收活性蛋白。,3）HPGFC應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測(cè)定。示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量的測(cè)定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流動(dòng)相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4（1:1）0.05%疊氮化鈉,標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線的制備：,醛縮酶血清白蛋白右旋糖苷藍(lán),碳酸酐酶抑蛋白酶肽酪氨酸,T0完全排阻,完全進(jìn)入填料空隙Tt,標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線：Kd-lgM.W.,樣品測(cè)定：,應(yīng)用示例：ChP（2000）重組人胰島素的質(zhì)量控制1）鑒別：法1：在效價(jià)測(cè)定項(xiàng)下，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品的一致。法2：供試品與對(duì)照品分別經(jīng)過酶解后，再分別進(jìn)行梯度洗脫，供試品的肽圖譜與對(duì)照品的肽圖譜一致。,2）檢查：檢查項(xiàng)目：有關(guān)物質(zhì)、高分子蛋白、鋅、氮、干燥失重、無菌、細(xì)菌內(nèi)毒素。有關(guān)物質(zhì)：供試液經(jīng)梯度洗脫，按峰面積歸一化法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量不得超過3.0%。高分子蛋白質(zhì)：,固定相：色譜用親水硅膠，它可以分離分子量為50006000的球狀蛋白。流動(dòng)相：0.4mol/L碳酸氫銨-乙腈（69:31）測(cè)定：分別測(cè)定供試液（1mg/ml）和對(duì)照液（將供試液稀釋成0.01mg/ml），供試液顯示的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，應(yīng)不大于對(duì)照液主峰面積（限量1.0%)。,3）效價(jià)測(cè)定：固定相：ODSC18流動(dòng)相：硫酸鹽緩沖液-乙腈（7426）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定胰島素主峰和A21脫氨胰島素峰之間的分離度與拖尾因子。含量測(cè)定：分別進(jìn)樣供試液和對(duì)照液，按峰面積外標(biāo)法計(jì)算含量。,3.灌注色譜法固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)上構(gòu)成貫穿孔顆粒分離介質(zhì)-POROSR。雙模式孔結(jié)構(gòu)：80150nm大擴(kuò)散孔600800nm貫穿孔,允許液體傳送流經(jīng)過分離介質(zhì)內(nèi)表面，使樣品由流動(dòng)相直接灌注入介質(zhì)顆粒中，擴(kuò)散作用不再是主要的。介質(zhì)顆粒內(nèi)部可利用反應(yīng)的表面積增加，容量和分辨率也隨之增加，可使生物活性大分子快速分離純化。,2酶活力測(cè)定法1）基本原理：酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力測(cè)定實(shí)質(zhì)上是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越高。,酶反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。通常酶活力測(cè)定時(shí)，先制備酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線。通過酶反應(yīng)速度的測(cè)定，求得酶的濃度或含量。,酶反應(yīng)進(jìn)程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時(shí)間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進(jìn)程曲線求得反應(yīng)的初速度。酶濃度曲線縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃度曲線檢驗(yàn)反應(yīng)測(cè)定系統(tǒng)是否適宜。,酶活力測(cè)定的要求：測(cè)得的反應(yīng)速度必須和酶濃度有線性的比例關(guān)系，這也是檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。,2）酶促反應(yīng)的條件及影響因素底物的濃度：一般選用底物的濃度S=100Km。pH：選用一個(gè)適宜的緩沖離子和離子強(qiáng)度、適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)來控制pH。溫度：酶反應(yīng)的溫度通常選用25、30或37，實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在0.1以內(nèi)。輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些需要相應(yīng)的輔酶。,空白和對(duì)照試驗(yàn)：空白試驗(yàn)：是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，它提供的是未知因素的影響?？瞻字悼梢酝ㄟ^不加酶，或不加底物，或二者都加（酶預(yù)先經(jīng)過失效處理）。對(duì)照試驗(yàn)：是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測(cè)得的結(jié)果，主要作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。,3）測(cè)定方法：取樣測(cè)定法：,連續(xù)測(cè)定法：在反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測(cè)。檢測(cè)方法：紫外-可見分光光度法旋光法熒光分光光度法電化學(xué)測(cè)定法酶偶聯(lián)測(cè)定法離子選擇性電極測(cè)定法等。,示例：胰蛋白酶效價(jià)測(cè)定胰蛋白酶肽鍵、酰氨鍵、酯鍵（堿性氨基酸）水解速率：酯鍵酰氨鍵肽鍵供試品溶液：5060單位/ml底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯濃度：A：0.575.0585N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯N-苯甲酰-L-精氨酸,253nm處的A隨酶促反應(yīng)遞增，根據(jù)酶活力單位定義計(jì)算酶活力。,酶活性單位：在最適的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位。測(cè)定：空白：底物溶液+0.001mol/LHCl,每30sA的改變：0.0150.018，呈線性關(guān)系的時(shí)間不得少于3min。,A每分鐘改變0.003，相當(dāng)于1個(gè)胰蛋白酶單位。供試液的A每分鐘改變,相當(dāng)于的單位數(shù)為每mg供試品中含胰蛋白酶單位數(shù)為,重組人白細(xì)胞介素11的胰蛋白酶切肽圖分析肽圖分析是評(píng)價(jià)重組產(chǎn)品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的重要方法,目前常用的方法有裂解-微量肽圖法和胰蛋白酶切肽圖法。,1。酶切條件取濃度為3-1的樣品04對(duì)1%43充分透析,然后取透析樣品250至微量進(jìn)樣瓶,加03-1處理的胰蛋白酶10混勻,于37溫控自動(dòng)進(jìn)樣器酶切,每80進(jìn)樣一針,進(jìn)樣量6,用32色譜軟件選擇214進(jìn)行分析,直至11完全酶解。按此方法摸索最佳酶切時(shí)間,在第14針后11已被完全酶切,酶切時(shí)間在1822范圍內(nèi)肽圖圖譜基本一致,即確定最佳酶切條件為37保溫20。,2。系統(tǒng)測(cè)試系統(tǒng)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣后呈3個(gè)峰,12次重復(fù)進(jìn)樣3個(gè)峰保留時(shí)間的分別為0.4%,0.6%和0.8%,峰面積的分別為0.7%,0.8%和0.8%。11對(duì)照品37酶切20后于4溫