蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)

.,第三章蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá),蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)是蛋白質(zhì)工程的重要研究內(nèi)容和手段。將從蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑、蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行講解。,.,第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑,蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾：凡通過活性基團(tuán)的引入或去除，而使蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程。有些情況下，化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，這些修飾稱為非必需部分的修飾。但多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致生物活性的改變。,.,影響化學(xué)修飾的主要因素有兩方面：1、蛋白質(zhì)功能基的活性反應(yīng)，包括基團(tuán)之間的氫鍵和靜電作用等，基團(tuán)之間的的空間阻力。2、修飾劑的反應(yīng)活性。,.,一、蛋白質(zhì)側(cè)鏈的化學(xué)修飾,在20種天然氨基酸的側(cè)鏈中，大約有一半可以在足夠溫和的條件下產(chǎn)生化學(xué)取代而不使肽鍵受損，其中氨基、巰基和羧基特別容易產(chǎn)生有用的取代。因?yàn)槿魏谓o定的氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子中可能出現(xiàn)不止一次，如果用化學(xué)的方法對氨基酸進(jìn)行修飾時(shí)，正常情況下所有相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈都要被取代。至于談到氨基和羧基基團(tuán)，盡管處在側(cè)鏈上和末端基團(tuán)的pK值有差別，但在化學(xué)上很難將肽鏈的-氨基或-羧基基團(tuán)與側(cè)鏈上的氨基或羧基相區(qū)別。,.,蛋白質(zhì)側(cè)鏈的化學(xué)修飾是通過選擇性試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。,.,（一）巰基的化學(xué)修飾由于巰基有很強(qiáng)的親核性，巰基基團(tuán)一般是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。烷基化試劑是一種重要的巰基修飾試劑，特別是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸測序前，常用碘乙酸來使巰基基團(tuán)羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解。其他一些鹵代酸、鹵代酰胺也可以修飾巰基。N-乙基馬來酰亞胺也是一種有效的巰基修飾試劑，該反應(yīng)具有較強(qiáng)的專一性并伴隨光吸收的變化。,.,5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前最常用的巰基修飾試劑之一，可與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記1個(gè)2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同時(shí)釋放一個(gè)有顏色的TNB陰離子，該離子在412nm有很強(qiáng)的吸收，可以通過光吸收變化來檢測反應(yīng)程度。,.,（二）氨基的化學(xué)修飾賴氨酸的-氨基是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)，是蛋白質(zhì)或多肽分子比較容易與修飾劑發(fā)生作用的位點(diǎn)。常見的修飾劑有三硝基苯磺酸、烷基化試劑、氰酸鹽以及鹽酸吡哆醛等。,.,（三）羧基的化學(xué)修飾谷氨酸、天冬氨酸修飾方法很有限，產(chǎn)物一般是脂類或酰胺類。,.,（四）二硫鍵的化學(xué)修飾一般用變性劑如巰基乙醇，將二硫鍵還原成游離的巰基，再通過巰基修飾的方法對其進(jìn)行修飾，如經(jīng)過羧甲基化處理，以防止重新氧化成二硫鍵。,.,（五）其他側(cè)鏈基團(tuán)的修飾1、組氨酸殘基的咪唑基可以通過氮原子的烷基化或碳原子的親核取代來進(jìn)行修飾。,.,2、酪氨酸殘基的修飾既可以是酚羥基的修飾，也可以是芳香環(huán)上的取代反應(yīng)。,.,3、精氨酸殘基含一個(gè)胍基，精氨酸殘基的強(qiáng)堿性，使其很難與大多數(shù)試劑發(fā)生修飾反應(yīng)，但可以和二羰基化合物發(fā)生反應(yīng)。,.,4、色氨酸吲哚基可以發(fā)生取代反應(yīng)或者被氧化裂解。N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）可以使吲哚基團(tuán)氧化成羥吲哚衍生物，但專一性較差，酪氨酸殘基也可與該試劑發(fā)生反應(yīng)。,.,5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的親核性所引起的，一些氧化劑可以使蛋氨酸氧化。,.,二、蛋白質(zhì)的位點(diǎn)專一性修飾,專一性包括兩方面的含義：一是試劑對被修飾基團(tuán)的專一性；二是試劑對蛋白質(zhì)分子中被修飾部位，如膜蛋白質(zhì)上的激素結(jié)合部位、酶的活性部位等位點(diǎn)的專一性，一般這類試劑不僅具有對被作用基團(tuán)的專一性，而且具有對被作用部位的專一性。這類專一性的化學(xué)修飾，稱為親和標(biāo)記或?qū)Ｒ恍缘牟豢赡嬉种谱饔?。這類修飾試劑也被稱為位點(diǎn)專一性抑制劑。,.,（一）親和標(biāo)記親和標(biāo)記是一類位點(diǎn)專一性的化學(xué)修飾，試劑可以專一性標(biāo)記于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活，因此又稱為專一性的不可逆抑制作用。,.,這類抑制劑可分為兩類：一類是Ks型的不可逆抑制劑，它是根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，它具有和底物結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合集團(tuán)，同時(shí)還具有和活性部位氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)的活性基團(tuán)。,.,另一類是Kcat型的不可逆抑制劑，是根據(jù)酶催化過程設(shè)計(jì)的。這類抑制劑具有和底物類似的結(jié)構(gòu)，具有被酶催化和結(jié)合的性質(zhì)。此外還有一個(gè)潛伏反應(yīng)基團(tuán)，在酶對它進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，這個(gè)潛伏基團(tuán)被酶催化而活化，對活性部位起不可逆抑制作用。這類抑制劑的專一性很高，被稱為“自殺性底物”。,.,（二）光親和標(biāo)記這類試劑在結(jié)構(gòu)上除了有一般親和試劑的特點(diǎn)外，還具有一個(gè)光反應(yīng)基團(tuán)。反應(yīng)一般分兩步進(jìn)行：第一步，試劑先與蛋白質(zhì)的活性部位在暗條件下發(fā)生特異性結(jié)合；第二步，光照，試劑被光激活后，產(chǎn)生一個(gè)高度活潑的功能基團(tuán)，與活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。,.,三、蛋白質(zhì)的聚乙二醇修飾,聚乙二醇（PEG）由環(huán)氧乙烷聚合而成，兩端各有一個(gè)羥基，若一端以甲基封閉則得到單甲氧基聚乙二醇（mPEG）。蛋白質(zhì)修飾中應(yīng)用最多的是mPEG的衍生物。,.,PEG與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合時(shí)，可作為一種屏障擋住蛋白質(zhì)分子表面的抗原決定簇，避免抗體產(chǎn)生，或者阻止抗原與抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生。還可以保護(hù)蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解。修飾后，分子量增加，腎小球?yàn)V過減少。這些均有助于蛋白質(zhì)類藥物循環(huán)半衰期的延長。,.,修飾時(shí)，先對PEG進(jìn)行活化，活化的PEG可與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上的各種化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)而與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，蛋白質(zhì)分子上與PEG進(jìn)行偶聯(lián)的基團(tuán)主要是氨基、巰基和羧基。,.,四、蛋白質(zhì)的化學(xué)交聯(lián)和化學(xué)偶聯(lián),化學(xué)交聯(lián)可以發(fā)生于分子內(nèi)的亞基與亞基之間，也可以發(fā)生與蛋白質(zhì)分子與分子之間，也可以發(fā)生于蛋白質(zhì)分子與分子之間，也可發(fā)生于多個(gè)分子之間，而形成網(wǎng)狀交聯(lián)。交聯(lián)劑為含有雙功能基團(tuán)的化學(xué)試劑。如戊二醛蛋白質(zhì)的化學(xué)偶聯(lián)是指將蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到一個(gè)化學(xué)惰性的水不溶性載體上，形成固定化蛋白質(zhì)。,.,蛋白質(zhì)分子的固定化,蛋白質(zhì)分子的固定主要是酶分子的固定。酶的固定化，使用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，酶仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：1、既能保持酶的活性又能克服游離酶的一些不足，提高酶分子的穩(wěn)定性。2、能與產(chǎn)物分開，有效地控制生產(chǎn)過程3、能與產(chǎn)物分開，可省去熱處理使酶失活的步驟，簡化生產(chǎn)工藝4、酶可在生產(chǎn)中重復(fù)利用，提高了酶的利用率。,.,酶的固定化可通過吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法去實(shí)現(xiàn)。1、交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，把酶分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的固定化酶。常用的交聯(lián)劑是戊二醛和雙重氮聯(lián)苯胺-2，2-二磺酸。,.,交聯(lián)法有四種形式：1）酶直接交聯(lián)法：在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。2）酶輔助蛋白交聯(lián)法：酶量有限時(shí)，使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。3）吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。4）載體交聯(lián)法：用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能集團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。,.,2、共價(jià)結(jié)合法是酶蛋白分子上功能團(tuán)和固定支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，以固定酶的方法。常用載體為：天然高分子（纖維素、瓊脂糖、淀粉等），合成高聚物（尼龍、多聚氨基酸），無機(jī)支持物（多孔玻璃）,.,影響因素：1）要求載體親水，并且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)2）反應(yīng)必須在溫和pH、中度離子強(qiáng)度和低溫緩沖液中進(jìn)行3）所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)要盡量考慮到對酶的其他功能基團(tuán)副反應(yīng)盡可能少4）要考慮到酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少載體的空間位阻對酶活力的影響。,.,第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造,蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造主要有基因突變、基因融合和摻入非天然氨基酸等方法。,.,一、基因突變技術(shù),基因突變技術(shù)是通過在基因水平上對其編碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。根據(jù)改造策略的不同可以分為定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化兩種，前者屬于理性的設(shè)計(jì)方法，后者屬于非理性的設(shè)計(jì)方法。,.,（一）定點(diǎn)突變對已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入。具有突變率高、簡單易行、重復(fù)性好的特點(diǎn)。野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過對其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點(diǎn)改造，現(xiàn)在的GFP能在可見光的波長范圍被激發(fā)，而且發(fā)光強(qiáng)度比原來強(qiáng)上百倍，甚至還出現(xiàn)了綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白等。,.,1、重疊延伸PCR技術(shù)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。,.,.,為提高葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，用雙引物法對葡萄糖異構(gòu)酶基因進(jìn)行了體外定點(diǎn)突變，以Pro138替代Gly138，突變性葡萄糖異構(gòu)酶的熱半衰期比野生型漲一倍，最是反應(yīng)溫度提高10-12度。,.,2、快速定點(diǎn)突變首先準(zhǔn)備質(zhì)粒：必須是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質(zhì)粒。然后，設(shè)計(jì)一對包含突變位點(diǎn)的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。再用DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎，而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到突變質(zhì)粒的克隆。,.,（二）定向進(jìn)化在實(shí)驗(yàn)室中模仿自然進(jìn)化的關(guān)鍵步驟突變、重組和篩選，在較短的時(shí)間內(nèi)完成漫長的自然進(jìn)化過程，有效的改造蛋白質(zhì)，使之適于人類的需要。，這種策略只針對特定蛋白質(zhì)的特定性質(zhì)，因而被稱為定向進(jìn)化。需要兩項(xiàng)支撐技術(shù)，一是產(chǎn)生大量突變體為進(jìn)一步篩選提供豐富的素材；二是有合適的篩選系統(tǒng)，可迅速從突變題庫中篩選到符合目標(biāo)的蛋白質(zhì)。,.,1、制造突變體,（1）易錯(cuò)PCR基本原理是通過改變正常PCR反應(yīng)體系中某些組分的數(shù)量或質(zhì)量，隨機(jī)引入錯(cuò)誤堿基從而創(chuàng)造序列多樣性的DNA序列文庫。關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率。一般目標(biāo)基因內(nèi)有1.5-5個(gè)堿基發(fā)生堿基替換時(shí)，誘變結(jié)果最理想。由于一輪易錯(cuò)PCR往往很難獲得滿意的結(jié)果，因此常用連續(xù)易錯(cuò)PCR方法。,.,DNAshufflingallowsacceleratedevolutionofgenes,.,2、篩選,（1）表型觀察選擇和篩選菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的瓊脂平板上產(chǎn)生清晰的水解圈。在高溫并有藍(lán)色木聚糖底物存在的條件下，根據(jù)菌落周圍地物的顏色變化來篩選耐高溫的木聚糖酶。,.,（2）高通量篩選方法噬菌體展示技術(shù)、細(xì)菌展示技術(shù)、酵母菌展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)等。,.,噬菌體展示技術(shù)是一種將外源肽或蛋白質(zhì)與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面的技術(shù)。,.,Phagedisplaymethod(1),M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).,.,Phagedisplaymethod(2),.,Phagedisplaymethod(2):(contd.),.,核糖體展示技術(shù)和mRNA展示技術(shù)在體外無細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行，用mRNA的可復(fù)制性，使靶基因得到有效富集，不受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的限制。大大提高了篩選通量。,.,二、基因融合和基因剪接,基本原則：將第一個(gè)蛋白基因的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白質(zhì)或多肽基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的融合表達(dá)。,.,1利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由（1）通過與一特異性蛋白質(zhì)或其特意的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，可使表達(dá)產(chǎn)物得到有效的回收、純化。（2）通過與具有不同功能的蛋白質(zhì)融合，產(chǎn)生新的多功能蛋白。（3）與報(bào)告分子的融合蛋白結(jié)合，應(yīng)用于蛋白質(zhì)定位或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。（4.）避免被蛋白水解酶水解（5）改變細(xì)胞溶解性，防止包涵體的形成（6）定向定位在宿主的不同區(qū)位。,.,2基因融合的策略（1）方式A酶切后，直接剪接到適當(dāng)?shù)男盘栯闹驜在目的基因兩端分別加上不同的親和標(biāo)簽，有利于蛋白純化C將目標(biāo)基因插入信號肽序列和一插入序列之間，成為一種可插入到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的蛋白編碼。,.,（2）融合蛋白接頭的設(shè)計(jì)和選擇多個(gè)不同模塊連接成一個(gè)大分子時(shí)，其中起連接作用的氨基酸鏈即為linker。因素：長度在10-15個(gè)氨基酸之間具有一定柔性避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)選擇非疏水性的氨基酸，常用序列為（GGGGS）3。,.,3、融合蛋白標(biāo)簽?zāi)康模簽榱酥亟M蛋白質(zhì)的純化，目的蛋白質(zhì)的監(jiān)測和定向固定，提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，增加可溶性和穩(wěn)定性等。常用片段：多聚精氨酸、多聚組氨酸、FLAG、c-myc等。這些蛋白不會(huì)與融合蛋白發(fā)生干擾。,.,4、融合蛋白報(bào)告分子目的：標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控應(yīng)用：啟動(dòng)子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物的篩選特點(diǎn)：1、報(bào)告基因應(yīng)不存在于宿主中或易于和內(nèi)源性基因相區(qū)別2、應(yīng)當(dāng)有一個(gè)簡單、快速、靈敏及經(jīng)濟(jì)的分析方法來檢測報(bào)告分子3、報(bào)告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線性范圍，以便于分析啟動(dòng)子活性的幅度變化4、報(bào)告基因的表達(dá)必須不改變受體細(xì)胞或生物的生理活動(dòng)。,.,5、蛋白質(zhì)剪接-內(nèi)含肽內(nèi)含肽：在蛋白質(zhì)成熟過程中被剪切掉的一段框內(nèi)融合于前體蛋白的氨基酸序列。表達(dá)蛋白連接（內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接）：通過改變裂解條件以及對內(nèi)含肽進(jìn)行適當(dāng)修飾，可以生物合成C端帶有硫酯鍵或N末端帶有半胱氨酸的蛋白質(zhì)分子。兩種蛋白質(zhì)混合以后，硫酯鍵和半胱氨酸利用自然化學(xué)連接的原理進(jìn)行自發(fā)的連接反應(yīng)，在硫酯鍵和半胱氨酸之間形成肽鍵，從而將兩種蛋白質(zhì)連接起來。,.,6、tRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程在蛋白質(zhì)工程中，借助于校正tRNA定點(diǎn)摻入非天然氨基酸可以提供蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息、改進(jìn)蛋白質(zhì)檢測與分離的方法，甚至賦予蛋白質(zhì)某些新的特征。增添一個(gè)非天然氨基酸到遺傳密碼中需要?jiǎng)?chuàng)建一套新的組分，包括tRNA、密碼子和氨酰tRNA合成酶。迄今為止超過20個(gè)非天然氨基酸被摻入到遺傳密碼中。,.,例如，含有酮基的對乙酰苯丙氨酸。含有這個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)能夠選擇性的被熒光標(biāo)記用以跟蹤和成像，或是被生物素標(biāo)記用作靈敏度檢出。許多試劑都可以通過酮基這個(gè)化學(xué)手柄選擇的結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。,.,基因融合的用途,上述這些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化以及細(xì)胞定位。作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對蛋白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通過基因剪接來進(jìn)行操作。,.,第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá),重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá),.,一、大腸桿菌中表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn),大腸桿菌(E.coli)表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個(gè)外源基因表達(dá)體系，是外源基因表達(dá)的首選體系。利用大腸桿菌作為表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。,.,大腸桿菌表達(dá)體系的缺點(diǎn),大腸桿菌系統(tǒng)最大的不足之處是不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；而廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。大腸桿菌體系的另一個(gè)不足之處是外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。最后，由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的序列直接在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，有時(shí)不能得到足夠的產(chǎn)物。,.,大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用,當(dāng)外源蛋白質(zhì)的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于34個(gè)，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。,.,1表達(dá)載體的構(gòu)建,(1)復(fù)制起始點(diǎn)大部分載體是基于pBR322或pUC質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)主要決定了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。前者可保持每個(gè)細(xì)胞中20-50個(gè)拷貝，后者為150-200個(gè)質(zhì)粒。,.,選擇性基因載體上至少含有一個(gè)選擇性基因，一方面用于對轉(zhuǎn)化體的確定，另一方面在培養(yǎng)過程中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。一般為抗生素抗性基因或報(bào)道基因。,.,(3)強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子主要作用是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的有效起始。原核細(xì)胞的啟動(dòng)子由-10區(qū)和-35區(qū)兩部分組成。-10區(qū)是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)，-35區(qū)是RNA聚合酶的識別位點(diǎn)。,.,(4)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列高效表達(dá)的載體應(yīng)該含有終止子，因?yàn)楹铣傻膍RNA過長，不僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能量，且易使mRNA形成妨礙翻譯的二級結(jié)構(gòu)。,.,(5)核糖體結(jié)合位點(diǎn)原核微生物的mRNA結(jié)合核糖體的序列稱為SD序列。SD序列對翻譯效率有影響。,.,(6)合適的多克隆位點(diǎn)具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，便于外源基因插入和篩選。,.,2與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素,有效的轉(zhuǎn)錄起始一個(gè)合適的高表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子應(yīng)符合以下幾點(diǎn)：第一，必須是較強(qiáng)的啟動(dòng)子，表達(dá)效率在10-30%。第二，由啟動(dòng)子控制的本底轉(zhuǎn)錄很低。第三，啟動(dòng)子能夠有一些簡單及經(jīng)濟(jì)合算的方式誘導(dǎo)啟動(dòng)。例如：T7啟動(dòng)子,.,轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)錄終止有兩種機(jī)制，一種是依賴六聚體蛋白rho的rho依賴性轉(zhuǎn)錄終止，rho蛋白能使新生RNA轉(zhuǎn)錄本從模板脫離。另一種是rho非依賴性轉(zhuǎn)錄終止，它特異性依賴與模板上編碼的信號。貫穿啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動(dòng)子的功能，造成啟動(dòng)子的封堵。,.,（3）mRNA穩(wěn)定性的影響mRNA的快速降解勢必影響蛋白質(zhì)的合成。通常用非常強(qiáng)的啟動(dòng)子來彌補(bǔ)不穩(wěn)定的mRNA的轉(zhuǎn)錄物。,.,(4)密碼子偏好性遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用其中一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。富含E.coli不常用密碼子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表達(dá)。精氨酸t(yī)RNA是多種哺乳動(dòng)物基因在細(xì)菌中表達(dá)的限制因子。,.,5、表達(dá)定位外源蛋白可能定位于：胞內(nèi)、胞質(zhì)膜、胞周質(zhì)、外膜和胞外培養(yǎng)基。（1）表達(dá)的外源蛋白定位于胞外小分子蛋白較易表達(dá)，產(chǎn)物接近天然蛋白；但表達(dá)大分子時(shí)，則易在胞內(nèi)形成包涵體。蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中被降解的可能性比其他的定位要大得多。從細(xì)胞質(zhì)蛋白混合物中純化目的蛋白相對比較困難。,.,（2）細(xì)胞外周質(zhì)表達(dá)有利于目的蛋白的純化；有利于蛋白質(zhì)的正確折疊；信號肽在細(xì)胞內(nèi)剪切更有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然N末端；蛋白質(zhì)降解也少。許多原核和真核細(xì)胞來源地信號肽已成功用于蛋白質(zhì)從內(nèi)膜到外周質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。如：E.coli的PhoA信號、人生長激素信號肽等。,.,（3）細(xì)胞外分泌易于純化，減少降解方法：a、利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途徑，b、利用信號肽序列、融合伴侶和具有穿透能力的因子。,.,（4）外源蛋白表達(dá)定位在胞質(zhì)膜上形成具生物活性的膜蛋白，大腸桿菌內(nèi)膜上表達(dá)定位的G蛋白偶聯(lián)受體，已用于受體與配基的結(jié)合、G蛋白與效應(yīng)物的偶聯(lián)、受體自身的結(jié)構(gòu)等。,.,（5）表達(dá)外源蛋白定位于菌體表面定位方式：a、將外源肽插入大腸桿菌外膜蛋白的膜外區(qū)，使一些短肽在細(xì)菌表面呈現(xiàn)。B、將外源蛋白序列插入菌體表面的結(jié)構(gòu)，如鞭毛和菌毛的蛋白中。C、以菌體表面脂蛋白或Lpp-OmpA融合體作為靶向載體蛋白，將外源蛋白或肽序列與脂蛋白或Lpp-OmpA的N端或C端序列融合，表達(dá)定位于菌體表面。,.,6、宿主選擇對表達(dá)的影響宿主菌對外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一定的影響。例如，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。Rosetta2系列可以補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，提高了外源基因的表達(dá)水平。Origami2系列是硫氧化還原蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。,.,7、培養(yǎng)條件的控制對表達(dá)效率的影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以通過高細(xì)胞密度培養(yǎng)系統(tǒng)獲得提高。高密度培養(yǎng)系統(tǒng)可以分為：分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)參數(shù)會(huì)影響蛋白酶的活性、分泌和產(chǎn)量。培養(yǎng)基的特殊操作能顯著提高蛋白質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中。如培養(yǎng)基中添加甘氨酸能增強(qiáng)外周質(zhì)蛋白釋放到培養(yǎng)基中。,.,（三）真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控需注意：1、基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的，因此要用切除內(nèi)含子的cDNA。2、基因必須置于原核細(xì)胞的啟動(dòng)子、終止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)有效識別。3、產(chǎn)生的mRNA必須相對穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)折疊。,.,二、目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá),優(yōu)點(diǎn)：1、既有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)2、對外源蛋白的翻譯后修飾,.,常用表達(dá)系統(tǒng)：甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)：1、具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。2、對表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，從而使其表達(dá)的蛋白具有生物活性。3、表達(dá)量高。4、表達(dá)的蛋白既可以存在于胞內(nèi)，也可以存在于胞外。酵母自身分泌的背景蛋白很少。5、整合有外源基因的重組子表達(dá)系統(tǒng)十分穩(wěn)定。6、糖基化程度低，使得他的蛋白抗原性較低。7、對營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成分簡單廉價(jià)，可進(jìn)行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。,.,（一）表達(dá)菌株常用菌株有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等，均為甲醇誘導(dǎo)型，以甲醇為唯一碳源時(shí)，宿主菌中AOX1啟動(dòng)子被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，是外源蛋白大量表達(dá)。蛋白酶缺陷株，如SMD1168，可以減少分泌蛋白的酶解消化，為外源蛋白的成功表達(dá)創(chuàng)造了條件。,.,（二）表達(dá)載體一般用整合型載體作為外源基因的表達(dá)載體。特點(diǎn)：載體與酵母宿主細(xì)胞基因組DNA整合，因此穩(wěn)定性高，但基因的拷貝數(shù)量低這種載體被設(shè)計(jì)為穿梭載體，即它可以在大腸桿菌中保存、擴(kuò)增和構(gòu)建，線性化后又可轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。,.,1、啟動(dòng)子AOX1啟動(dòng)子，僅受甲醇誘導(dǎo)，可產(chǎn)生較高水平的表達(dá)，但不適于食品生產(chǎn)，又有火災(zāi)隱患。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)不以甲醇為唯一誘導(dǎo)物的啟動(dòng)子：GAP、FLD1、DAS、AOX2等。GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶基因）的啟動(dòng)子可以利用多種碳源如葡萄糖、甘油等。,.,2、選擇標(biāo)記一般有兩種：營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記，如His4、Arg4等抗性選擇標(biāo)記，G418抗性基因,.,3、信號肽序列可以選擇外源蛋白自身的信號肽和酵母本身的信號肽。,.,4、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及與畢赤酵母的整合載體首先以質(zhì)粒的形式轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在其內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)酶切和測序證明表達(dá)載體構(gòu)建正確后，經(jīng)DNA內(nèi)切酶線性化后，轉(zhuǎn)入巴斯得畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。整合方式：a、單交換，外源基因通過重組插入到畢赤酵母染色體基因組his4位點(diǎn)或AOX1基因的上游和下游，b、雙交換，酵母染色體AOX1基因被載體外源基因表達(dá)元件和標(biāo)記基因所代替，該方法對甲醇的利用率低，但它表達(dá)外源基因的效率高。,.,（三）外源基因在畢赤酵母中的表達(dá),1、異源蛋白在酵母中表達(dá)的一般步驟A、將編碼異源蛋白的DNA序列克隆進(jìn)含有酵母啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列的表達(dá)框中。B、轉(zhuǎn)化及在宿主中穩(wěn)定維持此DNA融合產(chǎn)物C、異源蛋白在特定培養(yǎng)條件下合成D、異源蛋白的純化及其與天然產(chǎn)物的比較,.,2、外源蛋白的表達(dá)方式分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外兩種胞內(nèi)表達(dá)適于在胞漿中表達(dá)或不含二硫鍵的非糖基化蛋白。分泌表達(dá)一般為優(yōu)先原則方式，因?yàn)楫叧嘟湍钢环置诤艿退降膬?nèi)源蛋白，外源蛋白的純化非常簡便。,.,3、表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工、修飾畢赤酵母可以對蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，包括信號肽加工、蛋白折疊、二硫鍵形成、O-連接和N-連接糖基化修飾、磷酸化修飾等。,.,4、影響外源蛋白在畢赤酵母中高效表達(dá)的因素（1）目的基因的特性A、特定的A+T富含區(qū)可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號，導(dǎo)致只產(chǎn)生低水平或截短的mRNA。B、外源序列中的mRNA5非編碼區(qū)的核苷酸序列和長度會(huì)影響核糖體40S亞單位識別的障礙。C、某些稀有密碼子是制約翻譯速率的因素。,.,（2）啟動(dòng)子的影響常用的強(qiáng)啟動(dòng)子有AOX1、GAP、FLD1這些強(qiáng)啟動(dòng)子有時(shí)會(huì)引起外源蛋白高水平表達(dá)，超過宿主細(xì)胞翻譯后處理加工能力所能承擔(dān)的最大負(fù)荷量，引起蛋白的錯(cuò)誤折疊、不加工或錯(cuò)誤定位?？蛇x擇較溫和的啟動(dòng)子，如PPEX8、PYPT1。,.,（3）基因劑量有些單拷貝的表達(dá)盒就可得到較理想的表達(dá)產(chǎn)量，有些提高拷貝數(shù)可大大增加表達(dá)水平，還有些增加拷貝數(shù)反而降低了表達(dá)水平。因此，高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn)，基因劑量與表達(dá)水平的關(guān)系取決于特定的外源蛋白。,.,（4）宿主、整合方式及轉(zhuǎn)化子的類型AOX1位點(diǎn)的雙交換，可產(chǎn)生表型為Muts（甲醇利用慢）的菌落，單交換引起的基因插入，菌落表型為Mut+。一般情況下，胞內(nèi)表達(dá)最好選擇Muts，分泌表達(dá)，應(yīng)盡量選用表型Mut+。但是，對整合位點(diǎn)、整合方式、轉(zhuǎn)化子表型的選擇應(yīng)根據(jù)外源基因的特點(diǎn)和研究目的設(shè)計(jì)合理的技術(shù)路線。,.,（5）影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素蛋白酶是一個(gè)重要因素。提高外源目的蛋白穩(wěn)定性的方法：降低培養(yǎng)基的pH和培養(yǎng)溫度，破壞蛋白酶作用的最適條件培養(yǎng)基中添加蛋白胨和酵母提取物以增加蛋白酶作用的底物選用蛋白酶缺陷型菌株做宿主菌進(jìn)行表達(dá),.,（6）發(fā)酵條件的影響通氣量碳源，常用甘油做碳源，但是碳源會(huì)抑制AOX啟動(dòng)子。一般采用甘油培養(yǎng)基使細(xì)胞達(dá)到一定濃度，再加甲醇誘導(dǎo)的，兩步法來表達(dá)外源蛋白。誘導(dǎo)時(shí)間起始pH添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì),.,三、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),核型多角體病毒的多角體蛋白基因是病毒感染晚期高效表達(dá)的基因。1、其缺失對病毒復(fù)制增殖毫無影響，可以作為外源基因理想的插入位點(diǎn)。2、多角體蛋白被外源基因取代后，不形成多角體，在顯微鏡下可以與野生型相區(qū)別。,.,（一）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理首先建立一個(gè)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，在這個(gè)轉(zhuǎn)移載體上含有多角體蛋白基因的啟動(dòng)子及多角體蛋白基因的旁側(cè)序列；然后將外源基因克隆至轉(zhuǎn)移載體的多接頭的合適酶切位點(diǎn)處，使其處于多角蛋白基因啟動(dòng)子的控制之下；再將重組轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒DNA一起共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，外源基因通過細(xì)胞內(nèi)同源重組而插入病毒基因組中。最后利用空斑形態(tài)形態(tài)的差異進(jìn)行篩選、純化重組病毒，再以純化的重組病毒感染宿主細(xì)胞或幼蟲，即可獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。,.,（二）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)1、重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能2、能進(jìn)行翻譯后的加工修飾3、表達(dá)水平高4、能容納大分子的插入片段5、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因6、適合表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白7、安全,.,不足之處：1、非連續(xù)性表達(dá)。重組桿狀病毒能導(dǎo)致宿主死亡，所以每一輪外源蛋白的表達(dá)必須重新感染新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞或宿主2、其表達(dá)產(chǎn)物的糖基化相對簡單，多不分支，糖側(cè)鏈甘露糖成分高，缺乏符合寡糖。,.,三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá),.,1哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn),哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的種類和數(shù)目已經(jīng)發(fā)展很快。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系有很多其他體系不能與之相比的優(yōu)勢。它具有復(fù)雜的翻譯后加工系統(tǒng)，糖基化以及二硫鍵在合成和分泌過程中自然而然的正確形成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有產(chǎn)生正確折疊和完全生物活性的蛋白質(zhì)。實(shí)例：組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大腸桿菌中表達(dá)tPA時(shí)，產(chǎn)生錯(cuò)折疊和非糖基化