E玫瑰花環(huán)形成實驗PPT課件

-,1,E玫瑰花環(huán)形成實驗,中山醫(yī)學(xué)院免疫教研室2011-04,ERosetteFormingCellTest,-,2,掌握E花環(huán)形成的原理熟悉E花環(huán)形成實驗的步驟及光鏡下E花環(huán)的形態(tài)熟悉磁珠分離的原理,實驗?zāi)康?T細(xì)胞的表面分子是T細(xì)胞與其它細(xì)胞和分子間相互識別及作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。它們在T細(xì)胞活化、增殖和分化等過程中起重要作用。TCR-CD3復(fù)合物參與T細(xì)胞的抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L等膜蛋白參與T細(xì)胞活化及T細(xì)胞與其它細(xì)胞間相互作用。CD4/CD8分子輔助TCR識別結(jié)合抗原，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；根據(jù)CD4和CD8分子的表達(dá)將其分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞。,T細(xì)胞表面分子,-,4,依靠表面標(biāo)記的分離方法,流式細(xì)胞術(shù)分離法：利用各種熒光素標(biāo)記的表面標(biāo)記特異性抗體，使不同表面標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)合上不同的熒光素，借助熒光活化細(xì)胞分選儀將各種細(xì)胞分離開來。,*,-,5,*免疫磁珠分離法：將針對細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞，然后用強(qiáng)磁場可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來。,磁珠(microbead),標(biāo)記細(xì)胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到,-,6,磁珠分離策略：,一.陽性分選,磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞,未標(biāo)記細(xì)胞先行流出,移出磁場后收集目的細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞,分離柱,CD4-T細(xì)胞,-,7,磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞,目的細(xì)胞先行流出,二.陰性分選,-,8,成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（即CD2分子），能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，可在光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)。本法可用于分離外周血T細(xì)胞及檢測T細(xì)胞的數(shù)量和比例。,E花環(huán)分離法原理,*,-,9,實驗方案,取外周血,綿羊紅細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,分離,顯微鏡下觀察,+,-,10,實驗材料,1.肝素抗凝血2.Hanks液3.淋巴細(xì)胞分離液4.綿羊紅細(xì)胞懸液5.滅活小牛血清6.水平離心機(jī)、37溫箱、顯微鏡等,-,11,實驗步驟,用Hanks液配成106細(xì)胞/0.1ml,-,12,加等量滅活小牛血清(0.1ml),取0.1ml,加入0.5綿羊紅細(xì)胞0.2ml,混勻，37溫箱放置5分鐘,1000rpm離心5min,-,13,加1小滴1美藍(lán)，用毛細(xì)吸管輕輕混勻,取1滴于玻片上，加上蓋玻片,高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞,置4冰箱,5min,30-45min,-,14,結(jié)果判斷,凡能結(jié)合三個以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花形成陽性細(xì)胞。正常人的花環(huán)形成率50-70%，大致可以代表周圍血中T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。,-,15,左:（甲紫染色，800）：可見2個被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細(xì)胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個染成橙黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍。,T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán),-,16,T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，6500,-,18,測定外周血中的T細(xì)胞數(shù)，觀察受檢者的細(xì)胞免疫功能及免疫增強(qiáng)劑的療效。觀察免疫抑制劑的效果，協(xié)助進(jìn)行惡性腫瘤療效的觀察及預(yù)后判斷等。,臨床應(yīng)用,-,19,注意事項