基因工程技術(shù)ppt課件

基因工程技術(shù),1,Jackson,Symons,andBerg(1972)generatedfirstrecombinantDNAmoleculesCohenandBoyer(1973)producedfirstplasmidvectorcapableofbeingreplicatedwithinabacterialhostvectorscarriersofforeignDNA,TheNobelPrizeinChemistry1980,2,定義：,基因工程（geneengineering）重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）：是指在各種酶的作用下，將細胞外的核酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細菌或其它載體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組DNA分子，將其導入受體細胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和表達，這種有目的的應用分子克隆技術(shù),人為的改造基因,改變生物的遺傳性狀的系列過程,總稱為基因工程,3,基因克隆(genecloning)：是指目的基因與載體DNA連接構(gòu)成的DNA重組體在受體細胞內(nèi)進行復制、擴增的技術(shù)。,基因表達(geneexpression)：是指目的基因在受體細胞內(nèi)表達，研究功能。,4,應用：,克隆感興趣基因進行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)入原核表達載體，進行大規(guī)模蛋白質(zhì)合成,生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。轉(zhuǎn)入真核表達載體，導入細胞，研究其功能，表達調(diào)控機制等,5,基因工程基本步驟：,6,基因工程流程示意圖,7,構(gòu)建重組分子（連接）,原料：,目的基因：研究對象載體：目的基因的運載工具工具酶：連接酶、限制性內(nèi)切酶,8,目的基因片段來源：,基因組DNAPCR方法擴增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表達或克隆構(gòu)建或從商品化的cDNA文庫擴增）通過RT-PCR方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段（價錢昂貴）,9,目的基因來源選擇：,取決于解決什么問題？基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表達調(diào)控的研究,基因組DNA,PCR,10,PCR：,引入合適的酶切位點，一個/兩個。加保護堿基，1-3個。加上想要的標簽，如Flag,Myc,His,HA。啟始及終止密碼子。,高保真聚合酶：HF,Pfu,Probest等。,11,片斷的回收與純化,12,載體：,載體(Vector)是目的基因的運載工具，其作用是將目的基因帶入受體細胞中，并使目的基因擴增和表達。種類：,按來源分：質(zhì)粒載體(plasmidvector)、噬菌體載體(phagevector)、柯氏質(zhì)粒載體(cosmidvector)、病毒載體(virusvector).按作用分：克隆載體(cloningvector)、表達載體(expressionvector)、穿梭載體(shuttlevector),13,克隆載體(cloningvector)用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復制子。主要由細菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建（PBR322）。表達載體(expressionvector)使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體?？蓪⒅亟M體DNA導入適合的受體細胞，使所載荷的目的基因能夠復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（pCDNA3）。,14,穿梭載體(shuttIevector),能在兩種不同的生物體內(nèi)復制和往來穿梭的載體.其可同時具有細菌質(zhì)粒的復制原點和真核生物可識別的復制原點或酵母菌的自主復制序列（ARS），它即能在原核細胞中擴增又能在真核細胞中復制和表達。主要用于原核細胞與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移。,15,質(zhì)粒載體,具有復制起始點，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個松弛型的質(zhì)粒。具有某種選擇性標記以區(qū)別轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細胞。大多是一些抗菌素抗性基因，賦予受體細胞對某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。（Ampr；Tetr）具有若干限制性內(nèi)切酶單一識別位點，便于外源基因插入。,是細菌染色體外能夠自我復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。,16,克隆載體:PBR322,特點：分子量小，4.3kb，便于操作。有兩個抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。有幾個常用的限制性內(nèi)切酶的單一位點，分布在抗性基因上，7種位于四環(huán)素選擇標記上，4種位于Amp抗性基因上。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導致抗性基因插入失活，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。松弛性質(zhì)粒，在大腸桿菌細胞內(nèi)有較高的拷貝數(shù)，當細菌蛋白質(zhì)合成停止時，它仍能繼續(xù)復制。,17,18,19,TA克隆,A,A,20,TOPO-TA,21,原核His-tag:pQE系列(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX系列(Pharmacia),表達載體：帶有調(diào)控基因表達所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟動子等，這些調(diào)控元件應與宿主細胞相適應。,22,pCDNA3系列(Invitrogen)，,真核表達載體：大多是穿梭載體。,23,pFLAG-CMV系列(Sigma),24,Tet-On/Tet-OffExpressionSystems,Tet-Off,pTet-splice(pTet-PTEN)pTet-TAKPSVneo,25,DNA分子的體外連接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配對進行連接,26,兩種情況：,（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體易自身環(huán)化。用堿性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基團，使5端帶一OH)處理載體，可防止載體自環(huán)化。,（b）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶切割后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。,27,堿性磷酸酶處理：,28,平頭末端：,（1）增加連接酶的量（連接酶對平末端DNA的Km約高于粘性末端DNA100倍（2）在末端加上一個人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi)切酶位點，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體連接。如加上一個人工接頭內(nèi)含GAATTC序列，用EcoRI酶切，產(chǎn)生EcoRI粘性末端。,29,30,加同聚物尾：載體與片段沒有共同的粘性末端時，可直接通過末端轉(zhuǎn)移酶分別接上poly（dA）和poly（dT），然后退火，直接轉(zhuǎn)化，分子間空缺部分可以在宿主體內(nèi)修復。同尾酶(xhoI;SalI),其他方法：,BglIIAGATCTTCTAGA,BamHIGGATCCCCTAGG,AGATCTTCTAGA,GGATCCCCTAGG,31,連接策略：,pCMV,32,選擇連接位點：,（1）HindIII粘性末端載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活,方向不確定。（2）EcoRI-SalI-定向，一般不會有載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活（3）XbaI-SalI-反向，不能進行表達。四環(huán)素失活（4）目的基因片段：BglII-SalI，載體：BamHI-SalI反向，不能進行表達。四環(huán)素失活（5）NotI-修平SalI一個粘性末端，一個平端SmaI-修平-SalI正向連接，四環(huán)素失活PstI？SacI？,33,連接濃度：,片段與載體連接機率自身環(huán)化一般計算公式：粘性末端：載體片段含量（ng）/載體長度（kb）1DNA片段含量（ng）/DNA片段長度（kb）3-5平末端1：5-10,34,連接反應：,10ul體系,H2OBufferVectorInsertligase,4/14過夜,連接反應條件連接酶的活性;DNA的純度,載體與目的基因的比例;PH值7.2-7.8適宜;14(不高于16)過夜,35,連接酶：兩種,DNA連接酶：連接雙鏈中兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。需要一條DNA鏈的3-末端具有游離的OH，另一條DNA鏈5-末端的磷酸基團-P，吸能反應，需ATP存在。也可做DNA修復。但不能連接兩條單鏈DNA分子和環(huán)化的單鏈DNA分子。而且只能連接粘性末端。T4DNA連接酶：是從感染T4噬菌體的Ecoli中分離得到的一種連接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。用途比DNA連接酶廣泛，是分子生物學研究及基因克隆中較常用的連接酶。,36,其他酶：末端修飾酶,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。在合適的反應系統(tǒng)中，這種酶使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。堿性磷酸酶根據(jù)DNA重組的需要，為防止兩DNA片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5-P成為5-OH。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來源于大腸桿菌的細菌堿性磷酸酶（BAP）和來源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且對熱敏感，便于加熱使其失活。,37,重組子導入受體細胞：,把重組DNA導入受體細胞進行擴增.根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細胞（原核，真核）及選擇適宜的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。受體細胞的要求：必須具備使外源DNA進行復制的能力（提供復制所需的原料）而且還應該能夠表達由導入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細胞的選擇與鑒定。,38,重組子導入受體細胞：途徑,轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌（感受態(tài)菌）的過程轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒、或以它作為載體構(gòu)建的重組子主動或被動被導入細胞的過程。感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過感染受體細胞，然后整合到受體細胞基因組上。,39,轉(zhuǎn)化,受體細胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細胞轉(zhuǎn)化機理：細菌細胞的生物學特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變。轉(zhuǎn)化效率：只有很少比例的細胞有能力摻入質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化時大約在1000個DNA分子中，只有一個DNA分子獲得成功。一般每微克完整的pBR322DNA產(chǎn)生105-107轉(zhuǎn)化細胞,40,感受態(tài)菌制備,感受態(tài)：細菌細胞處于一個容易吸收外源DNA狀態(tài)，這種狀態(tài)的細菌稱為感受態(tài)菌。氯化鈣法：氯化鎂法：電轉(zhuǎn)法：,41,氯化鈣法：原理,快速生長的細菌用低滲低濃(50100mM)的氯化鈣（CaCl2)處理，使細胞腫脹成球形加入質(zhì)粒后，即于細胞表面形成抗DNAase的羥基-磷酸鈣復合物經(jīng)42熱休克后，復合物被細胞吸收。非選擇性培養(yǎng)基上生長數(shù)小時，球狀細胞復原開始增殖,抗生素基因表達。,42,重組子的篩選：,根據(jù)重組體的表型篩選,抗性基因插入失活：生存或是毀滅？,互補現(xiàn)象：藍白斑篩選,LacZ-受體菌編碼半乳糖苷酶羧基端（C端）片斷,載體編碼一半乳糖苷酶氨基端（N端）的肽,43,插入失活：,44,互補現(xiàn)象：藍白斑篩選,45,4290s,+900ulLB,3745min,Protocol:,3*1ml菌液,沉淀+0.5mlCaCl2,6000rpm5min,冰浴30min,6000rpm5min,沉淀+0.1mlCaCl2,+10ul連接產(chǎn)物,+6ulPBR322,陰性對照,A+T,A+T,陽性對照,Amp,Tet,冰浴30min,46,陽性克隆的鑒定：,挑菌落，小抽質(zhì)粒，電泳,菌落PCR,9410min30s40s1min728min4hold,X30,堿裂解法,47,堿裂解法,原理：pH值介于12.0-12.5范圍內(nèi)，線形的DNA和環(huán)狀的質(zhì)粒DNA變性，中間的氫鍵短裂，線狀DNA變性后互相分開，而環(huán)狀分子雙螺旋主鏈骨架彼此盤繞，互補兩條鏈緊密合在一起。變性處理的質(zhì)粒DNA和染色體DNA通過致冷或恢復中性pH，開始復性。環(huán)狀分子由于本身合在一起，所以復性迅速而準確。線狀DNA變性時彼此分開，復性慢而不準確，互相之間聚集形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，與變性蛋白質(zhì)和RNA一道沉淀下來，上清液中留存下的主要是環(huán)狀DNA分子和少量的可溶性蛋