基因工程技術(shù)ppt課件

基因工程技術(shù),1,Jackson,Symons,andBerg(1972)generatedfirstrecombinantDNAmoleculesCohenandBoyer(1973)producedfirstplasmidvectorcapableofbeingreplicatedwithinabacterialhostvectorscarriersofforeignDNA,TheNobelPrizeinChemistry1980,2,定義：,基因工程（geneengineering）重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）：是指在各種酶的作用下，將細(xì)胞外的核酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細(xì)菌或其它載體通過(guò)入工剪切、連接構(gòu)成重組DNA分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無(wú)性繁殖（稱(chēng)之為“克隆”）和表達(dá)，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù),人為的改造基因,改變生物的遺傳性狀的系列過(guò)程,總稱(chēng)為基因工程,3,基因克隆(genecloning)：是指目的基因與載體DNA連接構(gòu)成的DNA重組體在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)。,基因表達(dá)(geneexpression)：是指目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，研究功能。,4,應(yīng)用：,克隆感興趣基因進(jìn)行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體，進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)合成,生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞，研究其功能，表達(dá)調(diào)控機(jī)制等,5,基因工程基本步驟：,6,基因工程流程示意圖,7,構(gòu)建重組分子（連接）,原料：,目的基因：研究對(duì)象載體：目的基因的運(yùn)載工具工具酶：連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶,8,目的基因片段來(lái)源：,基因組DNAPCR方法擴(kuò)增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表達(dá)或克隆構(gòu)建或從商品化的cDNA文庫(kù)擴(kuò)增）通過(guò)RT-PCR方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段（價(jià)錢(qián)昂貴）,9,目的基因來(lái)源選擇：,取決于解決什么問(wèn)題？基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表達(dá)調(diào)控的研究,基因組DNA,PCR,10,PCR：,引入合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè)/兩個(gè)。加保護(hù)堿基，1-3個(gè)。加上想要的標(biāo)簽，如Flag,Myc,His,HA。啟始及終止密碼子。,高保真聚合酶：HF,Pfu,Probest等。,11,片斷的回收與純化,12,載體：,載體(Vector)是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)。種類(lèi)：,按來(lái)源分：質(zhì)粒載體(plasmidvector)、噬菌體載體(phagevector)、柯氏質(zhì)粒載體(cosmidvector)、病毒載體(virusvector).按作用分：克隆載體(cloningvector)、表達(dá)載體(expressionvector)、穿梭載體(shuttlevector),13,克隆載體(cloningvector)用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。主要由細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建（PBR322）。表達(dá)載體(expressionvector)使目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體?？蓪⒅亟M體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（pCDNA3）。,14,穿梭載體(shuttIevector),能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來(lái)穿梭的載體.其可同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（ARS），它即能在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。,15,質(zhì)粒載體,具有復(fù)制起始點(diǎn)，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個(gè)松弛型的質(zhì)粒。具有某種選擇性標(biāo)記以區(qū)別轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。大多是一些抗菌素抗性基因，賦予受體細(xì)胞對(duì)某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。（Ampr；Tetr）具有若干限制性?xún)?nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)，便于外源基因插入。,是細(xì)菌染色體外能夠自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。,16,克隆載體:PBR322,特點(diǎn)：分子量小，4.3kb，便于操作。有兩個(gè)抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。有幾個(gè)常用的限制性?xún)?nèi)切酶的單一位點(diǎn)，分布在抗性基因上，7種位于四環(huán)素選擇標(biāo)記上，4種位于A(yíng)mp抗性基因上。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導(dǎo)致抗性基因插入失活，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。松弛性質(zhì)粒，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有較高的拷貝數(shù)，當(dāng)細(xì)菌蛋白質(zhì)合成停止時(shí)，它仍能繼續(xù)復(fù)制。,17,18,19,TA克隆,A,A,20,TOPO-TA,21,原核His-tag:pQE系列(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX系列(Pharmacia),表達(dá)載體：帶有調(diào)控基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟動(dòng)子等，這些調(diào)控元件應(yīng)與宿主細(xì)胞相適應(yīng)。,22,pCDNA3系列(Invitrogen)，,真核表達(dá)載體：大多是穿梭載體。,23,pFLAG-CMV系列(Sigma),24,Tet-On/Tet-OffExpressionSystems,Tet-Off,pTet-splice(pTet-PTEN)pTet-TAKPSVneo,25,DNA分子的體外連接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配對(duì)進(jìn)行連接,26,兩種情況：,（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體易自身環(huán)化。用堿性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基團(tuán)，使5端帶一OH)處理載體，可防止載體自環(huán)化。,（b）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶切割后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。,27,堿性磷酸酶處理：,28,平頭末端：,（1）增加連接酶的量（連接酶對(duì)平末端DNA的Km約高于粘性末端DNA100倍（2）在末端加上一個(gè)人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體連接。如加上一個(gè)人工接頭內(nèi)含GAATTC序列，用EcoRI酶切，產(chǎn)生EcoRI粘性末端。,29,30,加同聚物尾：載體與片段沒(méi)有共同的粘性末端時(shí)，可直接通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶分別接上poly（dA）和poly（dT），然后退火，直接轉(zhuǎn)化，分子間空缺部分可以在宿主體內(nèi)修復(fù)。同尾酶(xhoI;SalI),其他方法：,BglIIAGATCTTCTAGA,BamHIGGATCCCCTAGG,AGATCTTCTAGA,GGATCCCCTAGG,31,連接策略：,pCMV,32,選擇連接位點(diǎn)：,（1）HindIII粘性末端載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活,方向不確定。（2）EcoRI-SalI-定向，一般不會(huì)有載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活（3）XbaI-SalI-反向，不能進(jìn)行表達(dá)。四環(huán)素失活（4）目的基因片段：BglII-SalI，載體：BamHI-SalI反向，不能進(jìn)行表達(dá)。四環(huán)素失活（5）NotI-修平SalI一個(gè)粘性末端，一個(gè)平端SmaI-修平-SalI正向連接，四環(huán)素失活PstI？SacI？,33,連接濃度：,片段與載體連接機(jī)率自身環(huán)化一般計(jì)算公式：粘性末端：載體片段含量（ng）/載體長(zhǎng)度（kb）1DNA片段含量（ng）/DNA片段長(zhǎng)度（kb）3-5平末端1：5-10,34,連接反應(yīng)：,10ul體系,H2OBufferVectorInsertligase,4/14過(guò)夜,連接反應(yīng)條件連接酶的活性;DNA的純度,載體與目的基因的比例;PH值7.2-7.8適宜;14(不高于16)過(guò)夜,35,連接酶：兩種,DNA連接酶：連接雙鏈中兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。需要一條DNA鏈的3-末端具有游離的OH，另一條DNA鏈5-末端的磷酸基團(tuán)-P，吸能反應(yīng)，需ATP存在。也可做DNA修復(fù)。但不能連接兩條單鏈DNA分子和環(huán)化的單鏈DNA分子。而且只能連接粘性末端。T4DNA連接酶：是從感染T4噬菌體的Ecoli中分離得到的一種連接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。用途比DNA連接酶廣泛，是分子生物學(xué)研究及基因克隆中較常用的連接酶。,36,其他酶：末端修飾酶,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）簡(jiǎn)稱(chēng)末端轉(zhuǎn)移酶。在合適的反應(yīng)系統(tǒng)中，這種酶使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。堿性磷酸酶根據(jù)DNA重組的需要，為防止兩DNA片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5-P成為5-OH。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來(lái)源于大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和來(lái)源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且對(duì)熱敏感，便于加熱使其失活。,37,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：,把重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增.根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細(xì)胞（原核，真核）及選擇適宜的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。受體細(xì)胞的要求：必須具備使外源DNA進(jìn)行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達(dá)由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的選擇與鑒定。,38,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：途徑,轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌（感受態(tài)菌）的過(guò)程轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒、或以它作為載體構(gòu)建的重組子主動(dòng)或被動(dòng)被導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程。感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過(guò)感染受體細(xì)胞，然后整合到受體細(xì)胞基因組上。,39,轉(zhuǎn)化,受體細(xì)胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)理：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變。轉(zhuǎn)化效率：只有很少比例的細(xì)胞有能力摻入質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化時(shí)大約在1000個(gè)DNA分子中，只有一個(gè)DNA分子獲得成功。一般每微克完整的pBR322DNA產(chǎn)生105-107轉(zhuǎn)化細(xì)胞,40,感受態(tài)菌制備,感受態(tài)：細(xì)菌細(xì)胞處于一個(gè)容易吸收外源DNA狀態(tài)，這種狀態(tài)的細(xì)菌稱(chēng)為感受態(tài)菌。氯化鈣法：氯化鎂法：電轉(zhuǎn)法：,41,氯化鈣法：原理,快速生長(zhǎng)的細(xì)菌用低滲低濃(50100mM)的氯化鈣（CaCl2)處理，使細(xì)胞腫脹成球形加入質(zhì)粒后，即于細(xì)胞表面形成抗DNAase的羥基-磷酸鈣復(fù)合物經(jīng)42熱休克后，復(fù)合物被細(xì)胞吸收。非選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)，球狀細(xì)胞復(fù)原開(kāi)始增殖,抗生素基因表達(dá)。,42,重組子的篩選：,根據(jù)重組體的表型篩選,抗性基因插入失活：生存或是毀滅？,互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選,LacZ-受體菌編碼半乳糖苷酶羧基端（C端）片斷,載體編碼一半乳糖苷酶氨基端（N端）的肽,43,插入失活：,44,互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選,45,4290s,+900ulLB,3745min,Protocol:,3*1ml菌液,沉淀+0.5mlCaCl2,6000rpm5min,冰浴30min,6000rpm5min,沉淀+0.1mlCaCl2,+10ul連接產(chǎn)物,+6ulPBR322,陰性對(duì)照,A+T,A+T,陽(yáng)性對(duì)照,Amp,Tet,冰浴30min,46,陽(yáng)性克隆的鑒定：,挑菌落，小抽質(zhì)粒，電泳,菌落PCR,9410min30s40s1min728min4hold,X30,堿裂解法,47,堿裂解法,原理：pH值介于12.0-12.5范圍內(nèi)，線(xiàn)形的DNA和環(huán)狀的質(zhì)粒DNA變性，中間的氫鍵短裂，線(xiàn)狀DNA變性后互相分開(kāi)，而環(huán)狀分子雙螺旋主鏈骨架彼此盤(pán)繞，互補(bǔ)兩條鏈緊密合在一起。變性處理的質(zhì)粒DNA和染色體DNA通過(guò)致冷或恢復(fù)中性pH，開(kāi)始復(fù)性。環(huán)狀分子由于本身合在一起，所以復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。線(xiàn)狀DNA變性時(shí)彼此分開(kāi)，復(fù)性慢而不準(zhǔn)確，互相之間聚集形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，與變性蛋白質(zhì)和RNA一道沉淀下來(lái)，上清液中留存下的主要是環(huán)狀DNA分子和少量的可溶性蛋