發(fā)光的大腸桿菌PPT課件

發(fā)光的大腸桿菌,朱靜宇張明石卉,1,.,制備感受態(tài)細胞,質(zhì)粒擴增,質(zhì)粒酶切,目的基因序列擴增,連接,轉(zhuǎn)化,實驗方案概述,2,.,材料,大腸桿菌少量PET28質(zhì)粒（既為原核質(zhì)粒又為真核質(zhì)粒）顯示綠色熒光的PEGFP-N3質(zhì)粒（為真核質(zhì)粒）,3,.,制備大腸桿菌感受態(tài)細胞,挑取E.coil單菌落接種至2mlSOC培養(yǎng)液，37搖床過夜。挑取0.51ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50mlSOB中，18劇烈震蕩，直至A600達到0.6，取出水浴10min44000rpm/min10min.同時冰浴配置TB溶液。棄上清，倒置離心管于濾紙上1mlTB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB溶液冰浴10-15min。44000rpm/min10min去上清，沉淀重懸于4mlTB中，冰浴10min加入280uLDMSO,混合均勻，冰浴10min分裝于EP管中，-80或液氮保存檢測感受態(tài)細胞的質(zhì)量（陰性對照）,4,.,質(zhì)粒擴增,pet28的質(zhì)粒擴增,PEGFP-N3質(zhì)粒擴增,搖菌,轉(zhuǎn)化,提質(zhì)粒,5,.,轉(zhuǎn)化,取100ul感受態(tài)細胞于冰浴上融化加入1ulpet28質(zhì)粒和1ulPEGFP-N3質(zhì)粒，輕輕吹勻，冰浴30min將菌液放入42C水浴熱激90s，立即放入冰浴中2min將菌液2000rmp/min離心3min，留200ul上清液將菌體打散，均勻涂布于含卡那抗性的瓊脂平板，平板于37C倒置培養(yǎng)過夜。同時進行陽性和陰性對照,6,.,搖菌+提質(zhì)粒,將培養(yǎng)過夜的平板取出，用已滅菌的槍尖挑取平板上單個的較大的菌落將移液槍尖打入5ml培養(yǎng)基內(nèi)，放入37C搖床中rpm/min,搖菌16小時左右運用Omega等品牌的試劑盒對菌液進行小提用濃度為1%的膠，120V20min，用10000的marker做對照驗證測濃度,7,.,質(zhì)粒的酶切,尋找pet28和pegfp-n3的酶切位點,8,.,質(zhì)粒的酶切（兩個質(zhì)粒同時酶切）,確定的酶切位點：EcorRI、XbaI,內(nèi)切酶：NotI、BamHI內(nèi)切酶Buffer：cutsmart,37溫育4hours,未酶切的質(zhì)粒作對照，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果,純化,9,.,01,02,03,04,05,06,設計引物,PEGFP-N3目的基因擴增,PCR,電泳,膠回收,純化,測序,10,.,PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物,PEGFPN55TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3PEGFPN35GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3,Primer2Tm68.5CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient181100.0l/(molcm),Primer#1Tm57.6CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient229700.0l/(molcm)SXJ,11,.,PCR體系,premix體系,TakaRaTaqdNTPmixturePCRbuffer,PCR反應條件,循環(huán)35次,12,.,02,01,03,加入樣品與buffer,混勻，短暫離心,孵育223h,連接,13,.,01,02,03,04,05,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,感受態(tài)細胞冰浴融化,加入質(zhì)粒，混勻，冰浴,菌液熱激90s后冰浴2min,加SOD，37搖菌,2000rpm/min3min涂布,14,.,涂布后，