島津LC-10AT型HPLC操作規(guī)程.ppt

1,第一節(jié)島津LC-10AT型HPLC操作規(guī)程,2,目的:規(guī)范島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。范圍:適用于島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。職責(zé):操作員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。,3,一、系統(tǒng)組成,本系統(tǒng)由1個(gè)LC-10ATvp溶劑輸送泵、Rheodyne7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測(cè)器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)。,4,二、準(zhǔn)備,1、準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，用合適的0.45m濾膜過濾，超聲脫氣20min。2、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的色譜柱（注意方向）和定量環(huán)。3、配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，用合適的0.45m濾膜過濾。（注意腐蝕性與有機(jī)系的的溶劑）4、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。,5,接通電源，依次開啟不間斷電源、泵、檢測(cè)器，待泵和檢測(cè)器自檢結(jié)束后，打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜工作站。,三、開機(jī),6,四、參數(shù)設(shè)定,1、波長(zhǎng)設(shè)定：在檢測(cè)器顯示初始屏幕時(shí)，按func鍵1次，波長(zhǎng)數(shù)字鍵閃動(dòng)，輸入所需波長(zhǎng)值，按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出到初始屏幕。2、流速設(shè)定：在泵顯示初始屏幕時(shí)，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（流速一般為超過1ml/min），按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出,7,五、更換流動(dòng)相并排氣泡,1：將管路的吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相的儲(chǔ)液瓶中；2：逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)泵的排液閥180，打開排液閥；3：按泵的purge鍵，pump指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的高流速?zèng)_洗，3min（可設(shè)定）后自動(dòng)停止，一般視管路無氣泡即可。4：將排液閥順時(shí)針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。5：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。6：如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設(shè)流速為5ml/min，按pump鍵，沖洗3min后再按pump鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。,8,六、平衡系統(tǒng),1、查看基線：1.1：按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開“在線色譜工作站”軟件，1.2：輸入實(shí)驗(yàn)信息并設(shè)定各項(xiàng)方法參數(shù)后，1.3：按下“數(shù)據(jù)收集”頁(yè)的按鈕。,9,六、平衡系統(tǒng),2、2.1：按泵的pump鍵，泵啟動(dòng)，pump指示燈亮。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動(dòng)相。2.2：檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。2.3：觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動(dòng)應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。2.4：觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲為25mmol/L的緩沖液4.每天沖洗柱5.穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相6.采用保護(hù)柱,39,二、保留時(shí)間縮短,1.流速增加2.樣品超載3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度增加,1.檢查泵,重新設(shè)定流速2.降低樣品量3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫,40,三、保留時(shí)間延長(zhǎng),1.流速下降2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度降低,1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫,41,四、出現(xiàn)肩峰或分叉,1.樣品體積過大2.樣品溶劑過強(qiáng)3.柱塌陷或形成短路通道4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.進(jìn)樣器損壞,1.用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.采用較弱的樣品溶劑3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子,42,五、鬼峰,1.進(jìn)樣閥殘余峰2.樣品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)5.水污染(反相),1.每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2.處理樣品3.重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑(尤其是離子對(duì)色譜)4.每天新配,用抗氧化劑5.通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水,43,六、基線噪聲,1.氣泡(尖銳峰)2.污染(隨機(jī)噪聲)3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲4.電干擾(偶然噪聲)5.檢測(cè)器中有氣泡,1.流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓2.清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑3.更換氘燈4.采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)5.流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓,44,七、峰拖尾,1.柱超載2.峰干擾3.硅羥基作用4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.柱塌陷或形成短路通道6.死體積或柱外體積過大7.柱效下降,1.降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2.清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相3.加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件6.連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7.用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱,45,八、峰展寬,1.進(jìn)樣體積過大2.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢4.檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過大,1.用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3.設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)4.設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%,46,八、峰展寬,5.流動(dòng)相粘度過高6.檢