【畢業(yè)學(xué)位論文】交鏈孢菌激活蛋白抗體制備及免疫檢測碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 交鏈孢菌激活蛋白抗體制備及免疫檢測 研 究 生 ：董健伸 指導(dǎo)教師：邱德文 申請學(xué)位類別 ：理學(xué)碩士 專 業(yè)： 微生物學(xué) 研究方向 ：藥物工程 培養(yǎng)單位 ：植物保護(hù)研究所 農(nóng)科院研究生院 提交日期 2006 年 6 月 F 006 基金來源聲明 本學(xué)位論文是國家“863” 計(jì)劃（項(xiàng)目編號：2003和國家“ 973”計(jì)劃（項(xiàng)目編號：2003的部分內(nèi)容。 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 交鏈孢菌激活蛋白抗體制備及免疫檢測 論文作者 董健伸 指導(dǎo)教師 邱德文 培養(yǎng)單位 植物保護(hù)研究所 姓名 職稱職務(wù) 導(dǎo)師類別 單位 專業(yè) 簡恒 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物防治 裘季燕 研究員 碩導(dǎo) 北京市農(nóng)林科學(xué)院植保環(huán)保所 植物病理學(xué)評 閱 人 答辯 主席 成卓敏 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 生物技術(shù) 譚華榮 研究員 博導(dǎo) 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物 簡恒 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植病生防 楊懷文 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 害蟲生防 朱昌雄 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所 微生物 答 辯 委 員 答辯時(shí)間、地點(diǎn) 2006國農(nóng)科院中日樓 301 室 記 錄 楊秀芬 摘 要 從真菌中提取的植物激活蛋白是一類熱穩(wěn)定蛋白，具有誘導(dǎo)植物抗性和促進(jìn)植物生長的作用。本研究進(jìn)行了交鏈孢菌（激活蛋白（簡稱 雙向電泳鑒定、抗體制備，通過篩選 達(dá)文庫，獲得 白基因，純化了該基因的表達(dá)蛋白，為深入研究激活蛋白結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 首次進(jìn)行了交鏈孢菌激活蛋白的雙向分離。通過比較不同蛋白提取緩沖液，選用 2液成功提取交鏈孢菌激活蛋白；對此蛋白進(jìn)行等電聚焦和雙向電泳，確定其 4。 特異性 體的制備。電泳分離獲得分子量為 35鏈孢菌激活蛋白（簡稱，以此為抗原免疫動物，制備兔多抗血清。本研究對斑點(diǎn)固相親和純化方法進(jìn)行了改進(jìn)，消除抗體和大腸桿菌之間的交叉反應(yīng), 成功制備了大量高特異性 體。 利用獲得的抗體免疫篩選交鏈孢菌 達(dá)文庫。用純化的 白抗體，從交鏈孢菌菌 達(dá)文庫中篩選獲得 9 個(gè)陽性克隆，測序結(jié)果與激活蛋白 譜鑒定肽段序列比較，獲得一個(gè)相似性較高的克隆。將此克隆所含基因（簡稱 2）進(jìn)行表達(dá)，利用鰲合有鎳離子的親和層析柱成功分離、純化表達(dá)蛋白。 首次利用抗體免疫雜交技術(shù)研究交鏈菌激活蛋白和植物蛋白的互作蛋白。用 體親和純化的方法研究發(fā)現(xiàn)，證明 白的抗體能夠特異性識別擬南芥中1,5二磷酸核酮糖羧化氧化酶，表明兩蛋白可能有相同或相似的氨基酸序列。為激活蛋白作用機(jī)理研究提供證據(jù)。 關(guān)鍵詞：激活蛋白，多克隆抗體，親和純化，免疫篩選，雙向電泳， is is a of In we of by of pI . of 55kD is so it is to In of t It is a to 9 of of is is by in by We a of it is 錄 英文縮略表 .一章 引言 . 1 生物蛋白農(nóng)藥研究進(jìn)展 . 1 敏蛋白 . 隱地蛋白 . 植物激活蛋白 .體親和純化技術(shù) . 5 克隆抗體和多克隆抗體的不同純化策略 . 蛋白 A，G 和 L 作為親和層析的配體 . 抗原作為親和層析的配體 . 寡聚蛋白作為親和層析的配體 . 分離抗體 段 . 固定抗原 . 洗脫抗體和增加抗體產(chǎn)量的方法 .究的目的和意義 . 11 第二章 交鏈孢菌激活蛋白的理化分析 . 12 料和儀器 . 12 料 . 試驗(yàn)儀器 . 試劑 .驗(yàn)方法 . 13 品制備方法 . 激活蛋白 雙向電泳 .果與分析 . 15 同提取方法比較 . 水平等電聚焦 . 雙向電泳 .論 . 18 第三章 交鏈孢菌激活蛋白多克隆抗體的制備及特異性純化 . 20 料和儀器 . 20 料 . 儀器 . 試劑 .驗(yàn)方法 . 20 體制備 . 抗體的特異性純化 . 抗體特異性檢測 . 間接 定抗體 .果及分析 . 24 體制備結(jié)果 . 特異性純化抗體 .論 . 27 第四章 交鏈孢菌 庫免疫篩選和目的基因蛋白的純化 . 29 料和儀器 . 29 料 . 儀器 . 試劑 .驗(yàn)方法 . 30 達(dá)文庫免疫篩選 . 表達(dá)蛋白的親和層析純化 .果與分析 . 32 疫篩選 達(dá)文庫 . 基因表達(dá)蛋白的純化 .論 . 34 第五章 利用抗體免疫雜交技術(shù)研究交鏈孢菌激活蛋白與植物蛋白的互作 . 36 料和儀器 . 36 料 . 儀器 . 試劑 .驗(yàn)方法 . 36 南芥葉片蛋白提取 . 測 . 擬南芥結(jié)合抗體的分離 . 抗體鑒定 .果及分析 . 37 南芥葉片蛋白提取 . 測 . 質(zhì)譜鑒定雜交條帶 . 擬南芥蛋白純化抗體的鑒定 .論 . 41 第六章 結(jié)論 . 42 參考文獻(xiàn) . 43 附錄 . 49 謝 . 52 作者簡歷 . 53 V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 硫酸銨 bp 基對 血清白蛋白 2DE 維凝膠電泳 硫蘇糖醇 補(bǔ) 蒸水 P 性磷酸酶標(biāo)的羊抗兔 電聚焦 堿基 kD 道爾頓 藍(lán)四唑 編碼區(qū) 基苯基聚乙二醇 OD 光值 酸鈉緩沖液 硝基苯磷酸酯 乙烯比咯烷酮 二烷基硫酸鈉 ，N ，N ， N一四甲基乙二胺羥甲基氨基甲烷 第一章 引言 第一章 引言 生物蛋白農(nóng)藥研究進(jìn)展 微生物農(nóng)藥是指用細(xì)菌、真菌、病毒等微生物有機(jī)體及其代謝產(chǎn)物制成的防治作物病害、蟲害、雜草的制劑，也包括保護(hù)生物活體的保護(hù)劑、輔助劑和增效劑，以及模擬某些殺蟲毒素和抗生素的人工合成的制劑（喻子牛 et 2000）。生物農(nóng)藥多為直接作用于目標(biāo)生物，起到殺蟲防病效果。除此以外，人們還發(fā)現(xiàn)一些小分子物質(zhì)，如：水楊酸、脫落酸等和一些來自細(xì)菌、真菌中的蛋白可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，這為植物病害的防治提供了新的思路。 微生物蛋白農(nóng)藥是對多種農(nóng)作物具有很強(qiáng)生物活性的一類蛋白質(zhì)藥物。主要包括 蟲晶體蛋白( 蛋白激發(fā)子類物質(zhì)，蛋白激發(fā)子與一般生物農(nóng)藥最大的區(qū)別在于其不直接殺滅害蟲和病原物，而是激發(fā)植物自身的抗病防蟲基因表達(dá)，促進(jìn)植物生長。其中具代表性的有過敏蛋白(、隱地蛋白(和植物激活蛋白( 表 類新型微生物蛋白農(nóng)藥的對比 型 來源 專利情況 過敏反應(yīng) （在煙草上）過敏蛋白（ 細(xì)菌（ 美國專利 1992 年 有 隱地蛋白（ 卵菌（ 法國專業(yè) 1985 年 有 植物激活蛋白（ 真菌（ 中國專利 2000 年 無 敏蛋白 敏性反應(yīng)(是植物基本的抗病反應(yīng)，指植物受病原侵染后，病原侵染點(diǎn)周圍細(xì)胞迅速壞死的一種現(xiàn)象，是在植物病原互作系統(tǒng)中認(rèn)識到的一種最強(qiáng)的抗病反應(yīng)(et 1994) 。過敏性反應(yīng)現(xiàn)象最早在 902)研究的雀麥冠銹病(就已發(fā)現(xiàn)。二十世紀(jì)三十至五十年代，人們在研究病毒鑒別寄主和研究專性寄生菌致病性分化的鑒別品種上發(fā)現(xiàn)有枯斑反應(yīng)(。1964 年， 970間，人提出 現(xiàn)稱為系統(tǒng)獲得抗性( 寄主植物感染病原物后，引起感染部位組織壞死，限制病原物的擴(kuò)展( 1996)。其表現(xiàn)形式可從單細(xì)胞壞死到明顯的組織大面積死亡(. 1994) ，這主要1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 取決于植物病原互作系統(tǒng)，有時(shí)也受環(huán)境條件的影響。過敏性反應(yīng)(引起植物組織細(xì)胞的死亡類似于動物程序性細(xì)胞死亡 ( 1996; et 2001)。 抗病作用不僅僅是表現(xiàn)在對病原菌擴(kuò)展的限制，而且能誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)獲得抗性，抵抗多種病原的侵染（李汝剛 et 1998）。 特點(diǎn)是病原菌感染部位附近的細(xì)胞快速壞死，緊接著聚集植物抗毒素以及其它因子（章元壽，1996 ）。 1992 年， 美國 學(xué)韋忠民( 博士等人報(bào)道了植物病原歐氏桿菌 因，從梨火疫病的病原細(xì)菌中分離到一種由 因編碼的約 44激發(fā) 蛋白類激發(fā)子 用 示) ，并首次提出 發(fā)植物 抗病性的關(guān)系，文章提出了過敏蛋白具有誘導(dǎo)抗病性功能，從而促進(jìn)了新型微生物蛋白農(nóng)藥的研究(et 1992)。 誘導(dǎo) 細(xì)菌激發(fā)子范例，這一發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了寄主病原物相互作用的研究（王金生，1999; 梁元存 et 2001; . 1992）。 從現(xiàn)有分離到的 白來看，均具有親水性，富含甘氨酸，缺少半胱氨酸，無四級結(jié)構(gòu)，熱穩(wěn)定性，子經(jīng) 100處理 10 導(dǎo)非寄主產(chǎn)生 能力不會喪失，但對蛋白酶及紫外線敏感(et 1992; et 1995; . Y. et 1993; . et 1999; et 2001)。 同一屬的病原細(xì)菌產(chǎn)生的 白在核酸和蛋白質(zhì)序列上具有一定的同源性，如 相似性、同一性， a 具有 相似性和 同一性，特別是靠近 C 端約 50%的部分，具有 90%以上的相似性和同一性(et 1995) 。 白并不直接作用于靶標(biāo)作物，而是刺激作物產(chǎn)生自然的免疫機(jī)制，使得植物能抵抗一系列的細(xì)菌、真菌和病毒病害。其作用機(jī)理是激發(fā)子與受體識別后，通過構(gòu)型變化激活胞內(nèi)有關(guān)酶的活性和蛋白質(zhì)磷酸化，形成第二信使，信號得到放大，最終通過對特殊基因的調(diào)節(jié)而激發(fā)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)（梁元存 et 2001）。 2001 年美國學(xué)和 白的 表達(dá)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)而獲得的。該產(chǎn)品是 2001 年生物農(nóng)藥中最具代表性的新產(chǎn)品之一，也是當(dāng)前國際上利用高技術(shù)手段開發(fā)生物農(nóng)藥最成功的例子。在多種大田作物、經(jīng)濟(jì)作物上應(yīng)用后，有促進(jìn)作物生長與發(fā)育、增加作物生物量、增加凈光合效率以及激活多途徑的防衛(wèi)反應(yīng)等作用?？共≡霎a(chǎn)效果十分顯著，對多種病蟲害防治效果達(dá) 50增產(chǎn)效果 10化學(xué)農(nóng)藥用量可減少 71%（譚放軍et 2003 ）。 存在促進(jìn)有害生物種群抗性發(fā)展的選擇壓（譚放軍et 2003 ）。 在國內(nèi)，趙立平博士等進(jìn)行了 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系和產(chǎn) 成團(tuán)泛菌工程菌的構(gòu)建等方面的研究（趙立平 et 1999）；李艷琴等完成了 固氮工程菌的構(gòu)建（李2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 艷琴 et 2000）；李汝剛、范云六等人進(jìn)行了表達(dá) 白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯降低晚疫病斑生長率方面的研究（李汝剛 et 1999）。 聞偉剛等對水稻黃單胞菌的 因簇進(jìn)行了全序列測定，發(fā)現(xiàn)其中含有 23 個(gè) 節(jié)基因和 因簇（24 個(gè)基因）；從水稻黃單胞條斑病菌(X. o. 的型泌出系統(tǒng)突變體 分離、純化到激發(fā)煙草過敏性反應(yīng)的活性蛋白；對來源于水稻白葉枯病菌中編碼植物 應(yīng)激發(fā)子 白的基因 行了功能域分析，已從水稻中克隆到了 12 種信號調(diào)控基因；并進(jìn)行了水稻黃單胞菌兩個(gè)致病變種( 白的比較遺傳學(xué)研究，發(fā)掘出編碼 功能基因，并通過轉(zhuǎn)基因手段實(shí)現(xiàn)了基因在植物中的高效表達(dá)，具有顯著的防病效果（聞偉剛 et 2001, 2003）。 地蛋白 疫霉屬( 腐霉屬( 生的、在煙草上引起過敏反應(yīng)(和系統(tǒng)獲得抗病性(的一類胞外蛋白類激發(fā)子的總稱。雖然這類激發(fā)子在化學(xué)性質(zhì)上不同，但是都具有引發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的特性(. et 1994)。自 1977 年觀察到( P. 菌體提取物和培養(yǎng)濾液能引起煙草葉片壞死性反應(yīng)以來，從 P. P. P. c a p s i c i 中已純化了分子量約 10多種蛋白類激發(fā)子(. et 1989) 。其中最有代表性的是由隱地疫霉( 分泌的隱地蛋白( 基酸序列高度相似和保守，蛋白質(zhì)前體含 19 或 20 個(gè)氨基酸的信號肽，成熟蛋白質(zhì)一般含 98 個(gè)氨基酸, 分子量一般為 10 少數(shù) 有不同。迄今已發(fā)現(xiàn) 17 種疫霉菌中存在 性蛋白，根據(jù)等電點(diǎn)和對煙草的激活反應(yīng)可分為 性） 性） 7類。多數(shù)卵菌產(chǎn)生的 有 或 一種類型, 但致病疫霉( 7 種卵菌分別產(chǎn)生 與 兩種類型的 了致病疫霉產(chǎn)生的兩種 與 型誘導(dǎo) 能力相同, 其他所有 型 生物活性都高于 型。 極低濃度(100 下就能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生 使植株獲得廣譜抗病性，同時(shí)產(chǎn)生與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的物質(zhì)如乙稀、植保素(、病程相關(guān)蛋白(. et 1999) 。 用 理煙草、番茄、萵苣、甘藍(lán)、黃瓜、茄子、辣椒和擬南芥等 61 種植物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種 煙草、蘿卜和蕪菁植物上產(chǎn)生 在其它植物上則不能，表明 一種特異性激發(fā)子（. et 1993）。研究證明， 通過水楊酸介導(dǎo)抗病信號途徑，激發(fā)植物獲得對真菌、細(xì)菌等病原物的系統(tǒng)抗性(，同時(shí)產(chǎn)生活性氧自由基、脂過氧化物 、植保素(病程相關(guān)蛋白(等防御反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)( . et 1999)。 國內(nèi)對研