第七章發(fā)酵工藝控制

.,第七章發(fā)酵工藝控制,溫度、pH、氧氣、二氧化碳、泡沫發(fā)酵染菌的防治與處理發(fā)酵終點(diǎn)的判斷等,.,發(fā)酵是一種很復(fù)雜的生產(chǎn)過程，其好壞涉及諸多因素，如菌種的生產(chǎn)性能、培養(yǎng)基的配比、原料質(zhì)量、滅菌條件、種子質(zhì)量、發(fā)酵條件和過程控制等。不論是老或新品種，都必須經(jīng)過發(fā)酵研究這一階段，以考察其代謝規(guī)律、影響產(chǎn)物合成的因素，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。高產(chǎn)菌種對工藝條件的波動比低產(chǎn)菌種更敏感，故掌握生產(chǎn)菌種的代謝規(guī)律和發(fā)酵調(diào)控的基本知識對生產(chǎn)的穩(wěn)定和提高具有重要的意義。,.,一、發(fā)酵過程的操作類型,1、分批發(fā)酵2、補(bǔ)料分批發(fā)酵3、連續(xù)發(fā)酵,.,1、分批發(fā)酵,是指在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個(gè)生長周期的微生物培養(yǎng)方法。一次投料，一次接種，一次收獲間歇培養(yǎng),.,分批發(fā)酵過程一般可粗分為四期，即適應(yīng)（停滯）期、對數(shù)生長期、生長穩(wěn)定期和死亡期；也可細(xì)分為六期：即停滯期、加速期、對數(shù)期、減速期、靜止期和死亡期。,.,一、初級代謝的代謝變化：,初級代謝是生命細(xì)胞在生命活動過程中所進(jìn)行的代謝活動，其產(chǎn)物為初級代謝產(chǎn)物。菌體的生長過程顯示生長史的特征。但在發(fā)酵過程中，即使是同一種菌體，由于菌體的生理狀態(tài)和培養(yǎng)條件的不同，各期的生長長短就有所不同。生產(chǎn)中要求在對數(shù)期接種原因就在此。,.,初級代謝沒有明顯的產(chǎn)物形成期，產(chǎn)物隨著菌體生長在不斷的進(jìn)行合成，有的與菌體的生長呈平行關(guān)系。如乳酸、醋酸幾乎在同一時(shí)期出現(xiàn)，而氨基酸、酶、核酸的發(fā)酵過程比前者復(fù)雜，隨培養(yǎng)基成分、碳源、溫度、菌株等不同而變化。,.,二、次級代謝產(chǎn)物變化,次級代謝產(chǎn)物包括大多數(shù)的抗生素、生物堿和微生物毒素等物質(zhì)。它們的發(fā)酵屬于生長與產(chǎn)物非偶聯(lián)的類型，一般分為菌體生長、產(chǎn)物合成和菌體自溶個(gè)階段。,.,菌體生長階段：接種后，菌體開始生長，直達(dá)到菌體的臨界濃度。同時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分解代謝，不斷的消耗，濃度明顯減少，溶氧濃度逐漸降低到一定的水平，其中某一參數(shù)可能成為菌體生長的限制因素，使菌體生長速度減慢，積累了相當(dāng)量的某些代謝中間體，原有的酶活力下降，出現(xiàn)了與次級代謝有關(guān)的酶，其酶解除了控制等原因，導(dǎo)致菌體的生理狀況發(fā)生改變，菌體就從生長階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)物合成階段。這一階段又稱為菌體的生長期或發(fā)酵前期。,.,產(chǎn)物合成階段：產(chǎn)物數(shù)量逐漸增多，直至達(dá)到高峰，生產(chǎn)速率也達(dá)到最大，直至產(chǎn)物合成能力衰減。此階段，營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，產(chǎn)物不斷被合成。環(huán)境因素很重要，發(fā)酵條件應(yīng)嚴(yán)格控制，方有利于產(chǎn)物合成。營養(yǎng)物質(zhì)過多，菌體就進(jìn)行生長繁殖，抑制產(chǎn)物合成，使產(chǎn)物量降低；如果過少，菌體就衰老，產(chǎn)物合成能力就下降，產(chǎn)量減少。這一階段又稱為產(chǎn)物分泌期或發(fā)酵中期。,.,菌體自溶階段：菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，氨氮含量增加，p上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降，此時(shí)應(yīng)必須結(jié)束發(fā)酵，否則，影響產(chǎn)品的提取。這一階段又稱為菌體的自溶期或發(fā)酵后期。,.,分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)：,操作簡單、周期短染菌的機(jī)會減少生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握對基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物，用分批發(fā)酵不合適,.,2、補(bǔ)料分批發(fā)酵,一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的操作方式。在進(jìn)行分批培養(yǎng)的過程中，向反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)基的一種或多種成分，以達(dá)到延長生產(chǎn)期和控制培養(yǎng)過程的目的。沒有輸出或間歇放掉部分發(fā)酵液（半連續(xù)發(fā)酵）,.,補(bǔ)料分批發(fā)酵與傳統(tǒng)分批發(fā)酵相比，優(yōu)點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度。低基質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)：（1）可解除底物抑制，產(chǎn)物的反饋抑制和快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧的矛盾；（2）可降低培養(yǎng)基的黏度，并盡可能地延長產(chǎn)物的形成時(shí)間。（3）避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物。與連續(xù)發(fā)酵相比，補(bǔ)料分批發(fā)酵不需要嚴(yán)格的無菌條件，也不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題。,.,2、連續(xù)發(fā)酵,連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)液的液量維持恒定的微生物培養(yǎng)方式。,.,連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)：,（1）可提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時(shí)間；（2）便于自動控制；（3）增加了染菌機(jī)會：長時(shí)間不斷地向發(fā)酵系統(tǒng)供給無菌空氣和培養(yǎng)基；（4）菌種發(fā)生變異的可能性較大。,.,二、發(fā)酵條件的影響及其控制,微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平取決于生產(chǎn)菌種的特性和發(fā)酵條件的控制。了解發(fā)酵工藝條件對過程的影響和掌握反映菌的生理代謝和發(fā)酵過程變化的規(guī)律，可以幫助人們有效地控制微生物的生長和生產(chǎn)。,.,常規(guī)的發(fā)酵條件：,罐溫、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量、罐壓、液位、補(bǔ)料、加糖、油或前體，通氨速率以及補(bǔ)水等。,表征過程性質(zhì)的狀態(tài)參數(shù)：pH、溶氧（DO）、溶解CO2、氧化還原電位、尾氣O2和CO2含量、基質(zhì)或產(chǎn)物濃度、代謝中間物或前體濃度、菌濃等。間接狀態(tài)參數(shù)：比生長速率、攝氧率、釋放速率（CER）、呼吸商（RQ）、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物合成速率等。,.,在分批發(fā)酵中，當(dāng)基質(zhì)過量時(shí)，菌體的生長速率與營養(yǎng)成分的濃度無關(guān)。：菌體的生長比速Ks：半飽和常數(shù)S：限制性基質(zhì)濃度max:最大比生長速度在Sks的情況下，比生長速率與基質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。,1、基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響,.,在S10ks時(shí)，比生長速率就接近最大值。所以營養(yǎng)物質(zhì)均存在一個(gè)上限濃度，在此濃度以內(nèi)，菌體的比生長速率隨濃度增加而增加，但超過此限，濃度繼續(xù)增加，反而會引起生長速率下降，這種效應(yīng)稱基質(zhì)的抑制作用。,.,在正常的情況下，可達(dá)到最大比生長速率，然而，由于代謝產(chǎn)物及其基質(zhì)過濃，而導(dǎo)致抑制作用，出現(xiàn)比生長速率下降的趨勢。e.g.G100150g/l，不出現(xiàn)抑制G350500g/l，多數(shù)微生物不能生長，細(xì)胞脫水。,.,就產(chǎn)物的形成來說，培養(yǎng)基過于豐富，有時(shí)會使菌體生長過旺，黏度增大，傳質(zhì)差，菌體不得不花費(fèi)較多的能量來維持其生存環(huán)境，即用于非生產(chǎn)的能量大大增加，這對產(chǎn)物合成不利。,.,（1）碳源的種類和濃度的影響和控制碳源分為迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源。迅速利用的碳源能較迅速地參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并分解產(chǎn)物（如丙酮酸），有利于菌體的生長。但有的分解代謝產(chǎn)物對產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用。慢速利用的碳源為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成（如抗生素），許多藥物發(fā)酵采用。例如乳糖、蔗糖、麥芽糖、玉米油分別是青霉素、頭孢菌素C、鹽霉素、核黃素及生物堿發(fā)酵的最適碳源。因此選擇最適碳源對提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是很重要的。在工業(yè)上，發(fā)酵培養(yǎng)基中常采用迅速和緩慢利用的混合碳源，來控制菌體的生長和產(chǎn)物的合成。,.,碳源的濃度也對發(fā)酵有影響。由于過于豐富所引起的菌體異常繁殖，對菌體的代謝和產(chǎn)物合成和氧的傳遞會產(chǎn)生不良影響。若產(chǎn)生阻遏作用的碳源用量過大，則產(chǎn)物的合成會受到明顯的抑制?？刂铺荚吹臐舛?，可采用經(jīng)驗(yàn)法和動力學(xué)法，即在發(fā)酵過程中采用中間補(bǔ)科的方法來控制。,.,（2）氮源的種類和濃度的影響和控制氮源象碳源一樣,也有迅速利用的氮源和緩慢利用的氮源。迅速利用的氮源有：氨基態(tài)氮的氨基酸、硫酸銨、玉米漿。慢速利用的氮源有：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等蛋白質(zhì)。,.,快速利用氮源容易被菌體所利用，促進(jìn)菌體生長，但對某些代謝產(chǎn)物的合成，特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。如鏈霉菌的竹桃霉素發(fā)酵中，采用促進(jìn)菌體生長的銨鹽，能刺激菌絲生長，但抗生素產(chǎn)量下降。緩慢利用的氮源對延長次級代謝產(chǎn)物的分泌期，提高產(chǎn)物的產(chǎn)量是有好處的。但一次投入，也容易促進(jìn)菌體生長和養(yǎng)分過早耗盡，以致菌體過早衰老而自溶，從而縮短產(chǎn)物的分泌期。,.,發(fā)酵培養(yǎng)基一般是選用含有快速和慢速利用的混合氮源。如氨基酸發(fā)酵用銨鹽和麩皮水解液、玉米漿；鏈霉素發(fā)酵采用硫酸銨和黃豆餅粉。但也有使用單一的銨鹽或有機(jī)氮源(如黃豆餅粉)。為了調(diào)節(jié)菌體生長和防止菌體衰老自溶，在發(fā)酵過程中，補(bǔ)加氮源來控制濃度。,.,（3）磷酸鹽濃度的影響和控制,磷是微生物生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的。微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32-300mmol，但對次級代謝產(chǎn)物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol，提高到10mmol，就明顯影響其合成。,.,磷酸鹽濃度在初級代謝中的要求不如次級代謝嚴(yán)格。對抗生素來說，常常是采用生長亞適量磷酸鹽濃度，其最適濃度取決于菌種特征、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成和來源等因素。,.,2、滅菌情況,隨著滅菌溫度的升高和滅菌時(shí)間的延長，養(yǎng)分的破壞越大。例如葡萄糖氧化酶活性會隨著溫度的升高和滅菌時(shí)間的延長而下降。,.,3、種子質(zhì)量,接種菌齡：一般為對數(shù)生長期后期接種量：一般為5%-10%接種量大小是由菌的生長繁殖速度決定的。種子多，占優(yōu)勢，防止雜菌污染，但過多會使黏度增加，溶氧不足，影響產(chǎn)物合成。,.,4、溫度對發(fā)酵的影響和及其控制,微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵系統(tǒng)中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。,.,(1)溫度對微生物生長的影響,大多數(shù)微生物在20-40的溫度范圍內(nèi)生長。嗜冷菌在溫度低于20下生長速率最大，嗜中溫菌在30-35左右生長，嗜熱菌在50以上生長。,.,(2)溫度對發(fā)酵過程的影響,溫度對青霉菌生長速率、呼吸強(qiáng)度和青霉素生產(chǎn)速率的影響如上圖所示?？梢钥闯?，溫度對參與生長繁殖、呼吸和青霉素形成的各種酶的影響是不同的。,.,青霉菌：生長E=34kJ/mol呼吸E=71kJ/mol產(chǎn)物合成E=112kJ/mol青霉素形成速率對溫度最為敏感，偏離最適溫度引起的生產(chǎn)率下降比其他兩個(gè)參數(shù)的變化更為嚴(yán)重。,活化能E反映溫度變化對酶反應(yīng)速率的影響,.,(3)溫度對發(fā)酵液物理性質(zhì)的影響,影響氧在發(fā)酵液中的溶解度溫度溶氧影響基質(zhì)的分解速率如菌體對硫酸鹽吸收在25時(shí)最小,.,(4)溫度對生物合成方向的影響,金色鏈絲菌,研究發(fā)現(xiàn)，溫度與微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系密切。例如，在20時(shí)，氨基酸末端產(chǎn)物對其合成途徑的第一個(gè)酶的反饋抑制作用，比在其正常生長溫度37時(shí)更大。因此，考慮在抗生素發(fā)酵的后期降低溫度，加強(qiáng)氨基酸的反饋抑制作用，使蛋白質(zhì)和核酸的正常合成途徑關(guān)閉得早些，從而使發(fā)酵代謝轉(zhuǎn)向抗生素的合成。,.,（5）影響發(fā)酵溫度的因素,發(fā)酵熱,發(fā)酵熱指的是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量，以J/(m3h)為單位表示。,.,生物熱：生產(chǎn)菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱叫生物熱。營養(yǎng)基質(zhì)被菌體分解產(chǎn)生大量的熱能，部分用于合成高能化合物ATP，供給合成代謝所需要的能量，多余的熱量則以熱能的形式釋放出來，形成生物熱。攪拌熱：攪拌器轉(zhuǎn)動引起的液體之間和液體與設(shè)備之間的摩擦所產(chǎn)生的熱能。,.,蒸發(fā)熱：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后，進(jìn)行熱交換，必然引起水分的蒸發(fā)，被空氣和蒸發(fā)水分帶走的熱量。Q蒸發(fā)=G（I出-I進(jìn)）輻射熱：由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過罐體向大氣輻射的熱量。顯熱：廢氣因溫度差異所帶走的熱量。,發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過程中是隨時(shí)間變化的。所以，為使發(fā)酵在一定溫度下進(jìn)行，必須采取措施在夾套或蛇管內(nèi)通入冷水加以控制（小型的發(fā)酵罐，在冬季和發(fā)酵初期，散熱量大于產(chǎn)熱量則需用熱水保溫。）,.,（6）最適溫度的選擇,所謂最適溫度是指在該溫度下最適于菌的生長或產(chǎn)物的合成。對不同的菌種、不同的培養(yǎng)條件、不同的酶反應(yīng)以及不同的生長階段，最適溫度有所不同。,.,最適生長溫度與最適生產(chǎn)溫度往往是不一致的。如乳酸發(fā)酵，乳鏈球菌最適生長溫度是34C，而產(chǎn)酸最多的溫度是30C，但發(fā)酵速度最高的溫度達(dá)40C。青霉素產(chǎn)生菌的最適生長溫度為30，但產(chǎn)生青霉素的最適溫度是24.7。應(yīng)根據(jù)發(fā)酵的不同時(shí)期，選擇不同的培養(yǎng)溫度。生長階段選最適生長溫度，在產(chǎn)物分泌階段選最適生產(chǎn)生產(chǎn)溫度。即變溫控制。e.g青霉素變溫發(fā)酵：起初5小時(shí)，維持在30C，以后降到25C培養(yǎng)5小時(shí)，再降到到20C培養(yǎng)28小時(shí)，最后又提高到25C，培養(yǎng)40小時(shí)，放罐。青霉素的產(chǎn)量比在25C恒溫發(fā)酵條件下提高14.7%。,在不同的發(fā)酵階段選擇不同的溫度,.,考慮培養(yǎng)基成分和濃度,例如，在使用較稀薄或較易利用的培養(yǎng)基時(shí)，提高溫度則養(yǎng)分往往過早耗竭，導(dǎo)致菌絲過早自溶，產(chǎn)量降低。,參考其它發(fā)酵條件,例如，通氣條件較差的情況下，可以適當(dāng)降低溫度，一方面增加溶解氧濃度，另一方面降低菌體的生長速率，以彌補(bǔ)因通氣不足而造成的代謝異常。,.,發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，它對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響。,5、pH對發(fā)酵的影響和及其控制,.,（1）pH對發(fā)酵過程的影響,pH影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成：（1）影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會阻礙菌體的新陳代謝；（2）菌體的形態(tài)：pH值還會影響某些霉菌的形態(tài)，如細(xì)胞壁厚度、菌絲直徑。（3）細(xì)胞膜的電荷狀態(tài)：引起膜滲透性的變化，從而影響菌對養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌（4）產(chǎn)物的穩(wěn)定性（5）對某些生物合成途徑有顯著影響：pH值往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和比例發(fā)生改變。,.,微生物生長和生物合成的最適pH,微生物生長：細(xì)菌（6.37.5),霉菌和酵母菌（36),放線菌（78)微生物生長階段和產(chǎn)物合成階段的最適pH往往不一樣，這不僅與菌種的特性有關(guān)，也取決于產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)。,.,e.g.Clostridiumacetobutylicumfenmentation:pH在中性時(shí)，菌種生長良好，但產(chǎn)物產(chǎn)量很低，實(shí)際發(fā)酵合適的pH值。Streptomycesgrisusfermentation生產(chǎn)鏈霉素（streptomycin）:菌體生長的合適pH值為6.36.9，而合成鏈霉素的pH值為6.77.3。因此，應(yīng)根據(jù)發(fā)酵過程的不同階段分別控制不同的pH值。在生產(chǎn)過程中，及時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制合適的pH值，以滿足不同階段的需要。,.,但同一產(chǎn)品的合適pH值，還因菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。在確定合適的pH值時(shí)，還要考慮培養(yǎng)溫度的影響，若溫度不同合適的pH值也可能發(fā)生變動。,.,幾種抗生素發(fā)酵的最適pH范圍,.,（2）發(fā)酵過程中pH的變化,發(fā)酵過程中，由于菌種在一定溫度及通氣條件下對培養(yǎng)基中碳、氮源等的利用，隨著有機(jī)酸或氨基氮的積累，會使pH產(chǎn)生一定的變化。這種變化的根源是培養(yǎng)基的成分和微生物的代謝特性。,.,引起培養(yǎng)液的pH發(fā)生波動的因素,引起pH下降的因素：1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)，碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補(bǔ)糖過多加之溶解氧不足，致使有機(jī)酸大量積累2）消沫油加得過多3）生理酸性物質(zhì)的存在引起pH上升的因素：1）氮源過多2）生理堿性物質(zhì)存在3）中間補(bǔ)料中氨水或尿素等的堿性物質(zhì)加入過多,.,（3）最適pH的選擇和調(diào)節(jié),選擇最適pH的原則：既有利于菌體的生長繁殖，又要最大限度地使產(chǎn)物合成獲得高的產(chǎn)量。,.,在各種類型的發(fā)酵過程中，實(shí)驗(yàn)所得的最適pH值與微生物的生長和產(chǎn)物的形成中3個(gè)參數(shù)的相互關(guān)系有四種情況：第一種情況是菌體的比生長速率（）和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率（Qp）的最適pH值都在一個(gè)相似的較寬的適宜范圍內(nèi)（a），這種發(fā)酵過程易于控制；第二種情況是（或Qp）的最適pH值范圍很窄，而Qp（或）的范圍較寬（b）；第三種情況是和Qp對pH值都很敏感，它們的最適pH值又是相同的（c），第二和第三模式的發(fā)酵pH值應(yīng)嚴(yán)格控制；第四種情況更復(fù)雜，和Qp有各自的最適pH值(d),應(yīng)分別嚴(yán)格控制各自的最適pH值，才能優(yōu)化發(fā)酵過程。,.,合適的p值是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定。將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成不同的出發(fā)pH值，進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，定時(shí)測定和調(diào)節(jié)pH，以分別維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液配制培養(yǎng)基以維持之。到時(shí)觀察菌體生長的情況，以菌體生長達(dá)到最高值的pH值為菌體生長的最適pH值。以同樣的方法，可測得產(chǎn)物合成的合適PH值。,.,考慮發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使之有適當(dāng)?shù)谋壤?，使發(fā)酵過程pH的變化在適合的范圍內(nèi)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有代謝產(chǎn)酸如葡萄糖產(chǎn)生酮酸、(NH4)2SO4和產(chǎn)堿如NaNO3、尿素的物質(zhì)以及緩沖劑如CaCO3等成分，它們在發(fā)酵過程中要影響pH的變化，特別是CaCO3能與酮酸等反應(yīng)，而起到緩沖作用，所以它的用量比較重要。在分批發(fā)酵中，常采用這種方法來控制pH的變化。,控制pH的方法,.,利用上述方法調(diào)節(jié)pH值的能力是有限的，如果達(dá)不到要求，可以用在發(fā)酵過程直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)枓的方式來控制，特別是補(bǔ)料的方式，效果比較明顯。過去是直接加入酸或堿來控制，但現(xiàn)在常用的是以生理酸性物質(zhì)(硫酸銨)和堿性物質(zhì)(氨水)來控制。它們不僅可以凋節(jié)pH值，還可以補(bǔ)充氮源。當(dāng)發(fā)酵的pH值和氨氮含量都低時(shí)，補(bǔ)加氨水，就可以達(dá)到調(diào)節(jié)pH和補(bǔ)充氨氮的目的。反之，pH值較高，氨氮含量又低時(shí)，就補(bǔ)加硫酸銨。,.,目前，已比較成功地采用補(bǔ)枓的方法來調(diào)節(jié)pH值，如氨基酸發(fā)酵采用流加尿素的方法，特別是次級代謝產(chǎn)物抗生素發(fā)酵，更常用此法。這種方法，既可以達(dá)到穩(wěn)定pH值的目的，又可以不斷補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，特別是能產(chǎn)生阻遏作用的物質(zhì)。少量多次補(bǔ)加還可解除對產(chǎn)物合成的阻遏作用，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。也就是說，采用補(bǔ)料的方法，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)充營養(yǎng)、延長發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH值和培養(yǎng)液的特性（如菌濃等）等幾個(gè)目的。最成功的例子就是青霉素的補(bǔ)枓工藝，利用控制葡萄糖的補(bǔ)加速率來控制pH值的變化范圍（現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)自動化），其青霉素產(chǎn)量比用恒定的加糖速率和加酸或堿來控制pH值的產(chǎn)量高25%。,.,.,氧是一種難溶于水的氣體。在25，1105Pa條件下，純氧在水中的溶解度為1.26mmol/L，空氣中的氧在純水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。在28氧在在發(fā)酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而發(fā)酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25100mmol/L.h。在好氧深層培養(yǎng)中，氧氣的供應(yīng)往往是發(fā)酵能否成功的重要限制因素之一。,6、溶氧對發(fā)酵的影響和及其控制,.,好氧微生物的生長和代謝活動都需要消耗氧氣，它們只有在氧分子存在的情況下才能完成生物氧化作用。液體中的微生物只能利用溶解氧，氣液界面處的微生物還能利用氣相中的氧。強(qiáng)化氣液界面也將有利于供氧。在微生物的培養(yǎng)過程中，應(yīng)保持供氧與耗氧的平衡，滿足微生物對氧的利用。,.,（1）臨界氧,發(fā)酵生產(chǎn)中用空氣飽和度百分?jǐn)?shù)來表示溶氧濃度。這只能在相似的條件下，在同樣的溫度、罐壓、通氣攪拌下進(jìn)行比較。這種方法能反映菌的生理代謝變化和對產(chǎn)物合成的影響。,臨界氧：不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度，如對產(chǎn)物而言，便是不影響產(chǎn)物合成所允許的最低濃度。,.,當(dāng)不存在其他限制性基質(zhì)時(shí)，溶解氧濃度高于臨界值，細(xì)胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶解氧濃度低于臨界值，細(xì)胞的比耗氧速率就會大大下降，或者是微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降，細(xì)胞處于半?yún)挌鉅顟B(tài)，代謝活動受到阻礙。,.,呼吸臨界氧值可用尾氣O2含量變化和通氣量測定，也可用溶氧電極測定。,各種微生物的臨界氧值：細(xì)菌和酵母：310%放線菌：530%霉菌：1015%,合成的臨界氧值：考察不同溶氧濃度對生產(chǎn)的影響，便可求得合成的臨界氧值。,注意：實(shí)際上，呼吸臨界氧值不一定與產(chǎn)物合成臨界氧值相同。生物合成臨界氧濃度并不等于其最適氧濃度。在培養(yǎng)過程中并不是維持溶氧越高越好。過高的溶氧對生長可能不利。,.,（2）溶氧作為發(fā)酵異常的指標(biāo),生長過程從培養(yǎng)液中溶氧濃度的變化可以反映菌的生長生理狀況。發(fā)酵溶氧變化異常，可及時(shí)預(yù)告生產(chǎn)可能出現(xiàn)的問題。操作故障或事故中間補(bǔ)料是否得當(dāng)污染雜菌：溶氧會反常地迅速（一般25h)跌到零，并長時(shí)間不回升。這比無菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染菌要提前幾個(gè)小時(shí)。但有時(shí)會出現(xiàn)染菌后溶氧反而升高的現(xiàn)象。,.,微生物的“需氧”可用耗氧速率或呼吸強(qiáng)度來表示：耗氧速率（oxygenuptakerate)：指單位體積的培養(yǎng)液在單位時(shí)間的耗氧量。單位為mmolO2/(Lh)，用r表示呼吸強(qiáng)度（respiratorystrength)：單位質(zhì)量的細(xì)胞干重在單位時(shí)間的耗氧量。單位為mmolO2/(g干細(xì)胞h)，用o2表示兩者的關(guān)系：,（3）溶氧的控制,需氧方面,.,式中，r攝氧率，mmolO2/(Lh)；QO2呼吸強(qiáng)度，mmolO2/(g菌h)；X菌濃，g/L。,若發(fā)酵液中溶氧保持不變，即供氧=需氧，則,使供需失去平衡的因子也會改變?nèi)苎鯘舛取?.,在發(fā)酵工業(yè)中，耗氧對于菌體生長和產(chǎn)物生成之間的關(guān)系有三種類型：產(chǎn)物生成期的耗氧與菌體生長期的耗氧一致。產(chǎn)物生成期的耗氧超過菌體生長期的耗氧量。產(chǎn)物生成期的最適耗氧量低于菌體生長期的耗氧量。,.,影響需氧的工藝條件,.,在發(fā)酵過程中，影響耗氧的因素有以下幾方面：培養(yǎng)基成分和補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧；培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，菌體生長快，耗氧量大；發(fā)酵濃度高，耗氧量大；發(fā)酵過程補(bǔ)料或補(bǔ)糖，微生物對氧的攝取量隨著增大。,.,菌齡影響耗氧：呼吸旺盛，耗氧力強(qiáng)，發(fā)酵后期菌體處于衰老狀態(tài)，耗氧能力自然減弱。發(fā)酵條件影響耗氧：在最適條件下發(fā)酵，耗氧量大。發(fā)酵過程中，排除有毒代謝產(chǎn)物如二氧化碳、揮發(fā)性的有機(jī)酸和過量的氨，也有利于提高菌體的攝氧量。,.,式中，dc/dt單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液溶氧濃度的變化mmol/(Lh)KL氧傳質(zhì)系數(shù)，m/h；a比表面積（m2/m3)c*氧在水中的飽和濃度，mmol/L；cL發(fā)酵液中的溶氧濃度，mmol/L。,在穩(wěn)定情況下，氧分子從氣體主體擴(kuò)散到液體主體的傳遞速率即氧的傳質(zhì)方程式為：,凡是使KLa和c*增加的因素都能使發(fā)酵供氧改善。,供氧方面,.,增加C*的辦法：,在通氣中摻入純氧，提高氧分壓；提高罐壓,.,提高KLa(提高設(shè)備的供氧能力）的辦法：,與氧傳質(zhì)有關(guān)的工程參數(shù),.,影響KLa的因素?cái)嚢瑁海?）增加氣液接觸面積（打碎氣泡），增加氧傳遞面積。（2）使液體形成渦流，從而延長氣泡在液體中的停留時(shí)間。（3）增加液體的湍流程度，降低氣泡周圍的液膜阻力、液體主流中液體阻力、從而增加KLa值。（4）減少菌絲結(jié)團(tuán)，降低細(xì)胞壁表面的液膜阻力。改善細(xì)胞對氧和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)降低細(xì)胞周圍的“廢物”和“廢氣“的濃度，有利于微生物代謝。,.,空氣的流速KLa隨空氣流速的增加而增大，但空氣速度過大，則可使葉輪發(fā)生過載，即葉輪不能分散空氣，氣體不經(jīng)分散而沿?cái)嚢杵骶徛\(yùn)動的中心迅速上升而逸出。,.,培養(yǎng)液的物理性質(zhì)發(fā)酵液的表面張力、粘度、離子濃度等都會影響氣體的溶解度，還影響液體的湍動以及界面和液膜的阻力，因而影響傳遞效率。發(fā)酵液中菌絲濃度增大，表觀粘度增大，通氣效率下降。發(fā)酵過程中添加糖、花生餅粉等營養(yǎng)物質(zhì)、前體或無菌水、消泡劑等均可改變培養(yǎng)液的理化性質(zhì)。,.,空氣分布器對通氣效率的影響發(fā)酵罐中裝有多孔分布器和單孔分布器，在氣流速度很低時(shí)，多孔分布器有較高的通氣效率。但兩者的區(qū)別隨著氣流速度的增加而逐漸減少?？赡苁堑蜌饬鲿r(shí)多孔分布器可形成更大的傳遞面積，而當(dāng)通氣量增大時(shí)，單孔分布器能更大的增加發(fā)酵液的湍動程度。,.,控制溶氧的工藝手段,改變通氣速率（增大通風(fēng)量）：增大KLa值。注意，過分增大通氣速率會產(chǎn)生副作用，如泡沫生成、罐溫增高等。改變攪拌速度：轉(zhuǎn)速較低時(shí)，增大攪拌速度對提高溶氧濃度有明顯作用；當(dāng)轉(zhuǎn)速很高時(shí)，再增大攪拌速度起不到調(diào)節(jié)作用，反而打碎菌絲體，使菌體自溶并減少產(chǎn)量。改變氣體組成中的氧分壓改變罐壓：提高C*。不是十分有效改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)：如加消沫劑、補(bǔ)加無菌水、改變培養(yǎng)基的成分等加入傳氧中間介質(zhì)：一般是不溶于培養(yǎng)液的液體，呈乳化狀態(tài)來提高氣液相之間的傳遞。傳氧中間介質(zhì)有：血紅蛋白、烴類碳?xì)浠衔铮河?、石蠟等）、含氟碳化物?.,各種溶氧控制方法的比較,.,7、二氧化碳對發(fā)酵的影響及其控制,CO2是微生物的代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是某些合成代謝的一種基質(zhì)，它是細(xì)胞代謝的重要指標(biāo)。CO2的抑制作用影響菌體生長、形態(tài)及產(chǎn)物合成高濃度的CO2會影響產(chǎn)黃青霉的菌絲形態(tài)。大多數(shù)微生物適應(yīng)低CO2濃度（0.020.04%體積分?jǐn)?shù)）。當(dāng)尾氣CO2濃度高于4%時(shí)微生物的糖代謝與呼吸速率下降。,.,.,.,（1）CO2對細(xì)胞的作用機(jī)制：CO2主要作用在細(xì)胞膜的脂肪酸核心部位影響磷脂的親水頭部帶電荷的表面及細(xì)胞膜表面上的蛋白質(zhì),當(dāng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)相中CO2濃度達(dá)到一臨界值時(shí)，膜的流動性及表面電荷密度發(fā)生變化。這將導(dǎo)致膜對許多基質(zhì)的運(yùn)輸受阻，影響了細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，使細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài)，生長受抑制，形態(tài)發(fā)生變化。,.,（2）呼吸商與發(fā)酵的關(guān)系,呼吸商：,RQ值可以反映菌體的代謝情況，例如酵母培養(yǎng)過程：RQ=1糖代謝走有氧分解代謝途徑，僅供生長、無產(chǎn)物形成；RQ1.1走EMP途徑，生成乙醇；RQ=0.93生成檸檬酸；RQ0.7生成的乙醇被當(dāng)作基質(zhì)再利用。,.,菌體在利用不同基質(zhì)時(shí)，其RQ值也不同；在抗生素發(fā)酵中在生長、維持和產(chǎn)物形成階段的RQ值也不一樣。,.,（3）二氧化碳濃度的控制,發(fā)酵液中CO2濃度受到許多因素的影響，如細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液的流變學(xué)特性、通氣攪拌程度、罐壓大小和設(shè)備規(guī)模等。值得注意的是，罐內(nèi)的CO2分壓是液體深度的函數(shù)。CO2濃度的控制：根據(jù)其對發(fā)酵的促進(jìn)或抑制作用，通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速率，提高或降低其濃度。,.,8、加糖、補(bǔ)料對發(fā)酵的影響及其控制,分批發(fā)酵常因配方中的糖量過多造成細(xì)胞生長過旺，供氧不足。解決這個(gè)問題可在發(fā)酵過程中加糖和補(bǔ)料。補(bǔ)料的作用是及時(shí)供給菌合成產(chǎn)物的需要。通過補(bǔ)料控制可解除抑制：基質(zhì)過濃的抑制、產(chǎn)物的反饋抑制以及分解代謝物的抑制。從而調(diào)節(jié)菌體的呼吸，以免培養(yǎng)過程受氧的限制。,.,（1）補(bǔ)料的策略：,一次性大量：操作簡便，但會造成發(fā)酵液瞬時(shí)大量稀釋，擾亂菌的生理代謝，難于將過程控制在最適合于生產(chǎn)的狀態(tài)；多次少量：麻煩些，但更合理；連續(xù)流加：快速、恒速、指數(shù)和變速流加。,.,流加操作控制系統(tǒng)又分為有反饋控制和無反饋控制兩類在反饋控制操作中：非直接法：溶氧、呼吸商、排氣中的CO2、代謝產(chǎn)物的濃度；直接法：限制性營養(yǎng)物的濃度（氮源、碳源、碳氮比）（由于缺乏直接測量的傳感器，此法受限制）,.,補(bǔ)料應(yīng)注意的問題,料液配比要適當(dāng)加強(qiáng)無菌觀念經(jīng)濟(jì)核算，節(jié)約糧食培養(yǎng)基的碳、氮要平衡,.,必須選擇恰當(dāng)?shù)姆答伩刂茀?shù)，以及了解這些參數(shù)對微生物代謝、菌體生長、基質(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關(guān)系。采用最優(yōu)的補(bǔ)料程序也是依賴于比生長曲線、形態(tài)、產(chǎn)物形成速率及發(fā)酵的初始條件等情況。,.,優(yōu)化補(bǔ)料速度也是補(bǔ)料控制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。因?yàn)轲B(yǎng)分和前體需要維持適當(dāng)?shù)臐舛?，而它們則以不同速被消耗，所以，補(bǔ)料速度要根據(jù)微生物對營養(yǎng)等的消耗速度及所設(shè)定的培養(yǎng)液中最低維持濃度而定。,.,補(bǔ)料的原則：就在于控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。補(bǔ)料的內(nèi)容和補(bǔ)料時(shí)機(jī)，都是根據(jù)菌的生長代謝、生物合成規(guī)律進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，但大多數(shù)都根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行。經(jīng)驗(yàn)表明，在最適補(bǔ)料條件下，能正確控制菌體量的增加和糖的消耗，獲得較好的效果。,.,9、泡沫對發(fā)酵的影響及控制,（1）由外界引進(jìn)的氣流被機(jī)械地分散形成（2）由發(fā)酵過程產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成的發(fā)酵泡沫（3）發(fā)酵液中糖、蛋白質(zhì)和代謝物等的存在起到加強(qiáng)或穩(wěn)定泡沫的作用,泡沫產(chǎn)生的原因,.,（1）通氣、攪拌的劇烈程度（2）培養(yǎng)基所用原材料性質(zhì)：蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、花生餅粉、黃豆餅干粉、酵母粉和糖蜜等是主要的發(fā)泡物質(zhì)。培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量越多，發(fā)酵液的粘度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久穩(wěn)定。另外，培養(yǎng)基的滅菌方法、滅菌溫度和時(shí)間也會影響到培養(yǎng)基成分的變化，從而影響培養(yǎng)基的起泡能力。,泡沫消長的影響因素：,.,泡沫對發(fā)酵的危害,（1）使發(fā)酵罐的裝填系數(shù)減少（2）造成大量逃液，導(dǎo)致產(chǎn)物損失（3）增加了染菌的機(jī)會（4）增加了菌群的非均一性（5）消泡劑的加入給提取工序帶來困難,.,發(fā)酵過程中泡沫的控制,機(jī)械消沫化學(xué)消沫（消沫劑消沫）,.,（1）機(jī)械消沫,原理：利用物理作用，靠機(jī)械的強(qiáng)烈振動或壓力的變化促使泡沫破碎。優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省原材料，不會增加下游工段的負(fù)擔(dān)，減少染雜菌。缺點(diǎn)：效率不高（作為消沫的輔助方法），不能從根本上消除泡沫成因。,.,例如：耙式消泡槳裝在發(fā)酵罐的攪拌軸上，槳上的齒面略高于液面，靠軸的旋轉(zhuǎn)帶動來打碎泡沫，起到消泡的作用。,罐內(nèi)機(jī)械消沫,.,罐內(nèi)機(jī)械消沫,.,通過噴頭將含氣泡的培養(yǎng)液噴向轉(zhuǎn)向板，使其破裂，然后再流回發(fā)酵罐。,罐外機(jī)械消沫,.,（2）化學(xué)消沫,化學(xué)消沫的機(jī)理：化學(xué)消沫劑是表面活性劑。一般好的消沫劑應(yīng)同時(shí)具備降低液膜的機(jī)械強(qiáng)度和表面粘度這兩種性能。常用的消沫劑（溶解度較小、分散性較差的高分子化合物）：a)天然油脂類：玉米油、豆油、菜油及豬油等b)高級醇類：十八醇、聚二醇等c)聚醚類：聚氧丙烯甘油(GP)、聚氧乙烯氧丙烯甘油（“泡敵”）(GPE)等P187d)硅酮類：聚二甲基硅氧烷及其衍生物e)氟化烷烴,.,消泡劑多數(shù)是溶解度小、分散性不十分好的高分子化合物，所以在使用時(shí)，要考慮如何降低它的黏度和提高它的分散性，來增強(qiáng)它們的消泡效果。使用的增效方法有:a機(jī)械分散、或借助分散劑b與載體一起使用c多種消沫劑并用d利用乳化劑增強(qiáng)消沫劑的消沫作用,.,染菌是發(fā)酵生產(chǎn)中的一個(gè)致命弱點(diǎn)，輕者影響了生產(chǎn)產(chǎn)品的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，重者會導(dǎo)致“倒罐”，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。,目前：提高生產(chǎn)技術(shù)水平，盡可能防止發(fā)酵染菌的發(fā)生，而且一旦發(fā)生染菌，要能盡快找出其污染的原因，并采取相應(yīng)的有效措施，把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最小。,三、發(fā)酵染菌的防治及處理,.,1、染菌的途徑分析,種子包括進(jìn)罐前菌種室階段出問題培養(yǎng)基的配制和滅菌不徹底設(shè)備上特別是空氣除菌不徹底和過程控制操作上的疏漏連續(xù)攪拌供給無菌空氣、排放多余空氣多次添加消沫劑、補(bǔ)充培養(yǎng)基定時(shí)取樣分析,.,2、染菌的判斷和防治,鏡檢無菌試驗(yàn)一些狀態(tài)參數(shù)，如溶氧變化、排氣中的CO2含量等異?，F(xiàn)象，如菌體生長不良、耗糖慢、pH值異常變化、發(fā)酵過程中泡沫的異常增多、發(fā)酵液的顏色異常變化、代謝產(chǎn)物含量的異常下跌、發(fā)酵周期的異常延長、發(fā)酵液的粘度異常增加等,.,造成發(fā)酵染菌的原因有很多，且常因工廠不同而有所不同，但設(shè)備滲漏、空氣中有雜菌、種子帶菌、滅菌不徹底和技術(shù)管理不善等是造成各廠污染雜菌的普遍原因。一般，從染菌的種類可大致判斷其來源P208從發(fā)酵染菌的規(guī)模分析不同染菌時(shí)間分析對抗生素發(fā)酵染菌：前期原則上可適當(dāng)改變生長參數(shù)，使有利于生產(chǎn)菌而不利于雜菌的生長，或加入某些抑制雜菌的化合物。中后期除非是噬菌體通常后果不會那么嚴(yán)重。,.,3、染菌的挽救或處理,（1）種子培養(yǎng)期染菌的處理種子受到雜菌污染后，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄之，并對種子罐、管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。同時(shí)采用備用種子。（2）發(fā)酵前期染菌的處理如培養(yǎng)基中的碳、氮源含量還比較高時(shí)，終止發(fā)酵，將培養(yǎng)基重新進(jìn)行滅菌處理后再用；否則，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，再進(jìn)行滅菌處理。也可采取降溫培養(yǎng)、調(diào)節(jié)pH值、調(diào)整補(bǔ)料量、補(bǔ)加培養(yǎng)基等措施。,.,（3）發(fā)酵中、后期染菌的處理加入適當(dāng)?shù)臍⒕鷦┗蚩股?，以抑制雜菌的生長，也可采取降低培養(yǎng)溫度、降低通風(fēng)量、停止攪拌、少量補(bǔ)糖等