生命科學(xué)專題RNAiPPT課件

-,1,梅洛(CraigMello)生于1960年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國西部尋找化石。從那時(shí)起，他就迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人類生命的起源等問題。高中時(shí)代，梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面。,法爾(AndrewFire)1959年出生在美國加利福尼亞州，本科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué)，僅用3年時(shí)間就拿到學(xué)位。與梅洛類似，他逐漸對涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。,-,2,RNA干擾,RNAinterference，RNAi,南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院譚湘陵,-,3,一、RNA干擾的發(fā)現(xiàn),94年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為基因壓制(quelling)。,90年代初，美國和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組RichJorgensen和同事,在對矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究中有個(gè)奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個(gè)能產(chǎn)生色素的基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。也就是說轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制，Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression),-,4,一、RNA干擾的發(fā)現(xiàn),-,5,一、RNA干擾的發(fā)現(xiàn),-,6,Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.),Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4-cellstageembryos.,-,7,一、RNA干擾的發(fā)現(xiàn),2001年，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494498RNAi技術(shù)被Science評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。,-,8,二、RNA干擾的機(jī)制,dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈Dicer：屬于RNase家族，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶siRNA：smallinterferingRNA，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個(gè)nt大小的雙鏈RNARISC：RNA-inducingsilencingcomplex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，依賴RNA的RNA聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞,預(yù)備知識：,-,9,基因沉默,二、RNA干擾的機(jī)制,轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS),TGS是指轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。對于部分植物來說，轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因沉默可能是因?yàn)榛蛱禺惖募谆鴮?dǎo)致；PTGS則是指轉(zhuǎn)基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA存在這一現(xiàn)象。,基因沉默,-,10,目前普遍認(rèn)為，共抑制、基因壓制和RNAi很可能具有相同的分子機(jī)制，都是通過dsRNA的介導(dǎo)而特異地降解靶mRNA,抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。均屬于PTGS！現(xiàn)已初步闡明dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步：,二、RNA干擾的機(jī)制,第一步（起始階段）是較長dsRNA在ATP參與下被RNase樣的特異核酸酶切割加工成2123nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。,siRNA的兩條單鏈末端為5-磷酸和3-羥基，且3端均有2-3個(gè)突出的核苷酸。果蠅中的RNase樣核酸酶稱為Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動(dòng)物等機(jī)體中被發(fā)現(xiàn)。,-,11,二、RNA干擾的機(jī)制,第二步（效應(yīng)階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。,活化的RISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別互補(bǔ)的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。,RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，在線蟲，果蠅體內(nèi)，RNAi能達(dá)到基因敲除的效果。,-,12,RNAi的放大效應(yīng)機(jī)制,二、RNA干擾的機(jī)制,siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNase樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進(jìn)入合成-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機(jī)降解性PCR（randomdegradativePCR）。,-,13,GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.,-,14,RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；RNAi具有很高的特異性；只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi；只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解；RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，可達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，這是通過催化放大的方式進(jìn)行的；,二、RNA干擾的機(jī)制,RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征：,-,15,二、RNA干擾的機(jī)制,RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳給F1，但F2往往恢復(fù)為野生型。dsRNA不得短于21個(gè)堿基，大于30bp的dsRNA不能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑和凋亡；RNAi作用迅速，mRNA快速降解；RNAi效應(yīng)的依賴性，只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。,RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征：,-,16,三、RNA干擾的應(yīng)用,1.基因功能研究,由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。,-,17,三、RNA干擾的應(yīng)用,2.病毒性疾病的治療,研究人員開發(fā)出使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。這個(gè)研究小組設(shè)計(jì)合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。,艾滋病,-,18,三、RNA干擾的應(yīng)用,2.病毒性疾病的治療,Shlomai和Shaul設(shè)計(jì)了各針對HBV基因19nt的兩種pSUPER載體：pSUPERX-siRNA和pSUPERcore-siRNA。已轉(zhuǎn)染含1.3XwtHBV基因質(zhì)粒載體的Huh7細(xì)胞再被X-siRNA或core-siRNA轉(zhuǎn)染后，core蛋白水平分別降低了89%、63%，轉(zhuǎn)染X-siRNA的細(xì)胞中HBsAg降低60%，但轉(zhuǎn)染core-siRNA對HBsAg表達(dá)無明顯影響（X-siRNA干擾沉默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物，而core-siRNA僅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。,HBV,-,19,三、RNA干擾的應(yīng)用,2.病毒性疾病的治療,Randall等證明了針對HCVRNA的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的HCVRNA降低80倍；將siRNA轉(zhuǎn)染至已有HCV感染、復(fù)制的細(xì)胞，siRNA對98%以上可檢測到HCV抗原、HCV復(fù)制活躍的細(xì)胞有抑制作用；siRNA干擾沉默HCVRNA具有劑量依賴性和序列特異性。Kapadia等也證明了siRNA特異抑制HCVRNA復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。,HCV,-,20,三、RNA干擾的應(yīng)用,2.病毒性疾病的治療,RNAi還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA已證實(shí)介導(dǎo)人類細(xì)胞的細(xì)胞間抗病毒免疫，用siRNA對Magi細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使其對病毒的抵抗能力增強(qiáng)。在最近全世界約30個(gè)國家和地區(qū)散發(fā)或流行的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重視。siRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNAi能勝任許多病毒的治療。,其它病毒,-,21,三、RNA干擾的應(yīng)用,3.腫瘤治療,用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤。,(1)RNAi可應(yīng)用于敲除點(diǎn)突變激活的癌基因，(2)RNAi可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因的表達(dá)，(3)RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴(kuò)增。,Li等在3個(gè)肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、SNU449中對cyclinE的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA組48h后生長抑制均達(dá)到90，而對照組無作用，3天后凋亡率分別為16、44和3l，而對照組僅為l。,-,22,三、RNA干擾的應(yīng)用,3.腫瘤治療,Survivin基因是迄今為止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成員，可通過抑制caspase級鏈反應(yīng)下游的caspase3，caspase7發(fā)揮其抗凋亡作用?，F(xiàn)在研究已證實(shí)survivin基因參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展，并且還與化療的耐藥性相關(guān)。降低survivin基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)不僅可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡、抑制肝癌細(xì)胞的生長，還可增強(qiáng)其對化療的敏感性，從而提高肝癌治療的整體療效。CHENG等通過RNAi抑制肝癌細(xì)胞SMMC7721中survivin基因的表達(dá)，使細(xì)胞株中survivin基因表達(dá)幾乎缺失，凋亡指數(shù)增加156，肝癌細(xì)胞生長被抑制。,-,23,三、RNA干擾的應(yīng)用,3.腫瘤治療,MDR(Muhidrugresistance)是腫瘤化療失敗的主要原因，形成MDR的最常見的因素是腫瘤細(xì)胞MDR基因編碼的糖蛋白過度表達(dá)，其中，MDR1對于細(xì)胞的多重耐藥性起著重要的作用。Nieth等表明，特異siRNA可以抑制MDR1基因的表達(dá)，從而顯著降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。,PLK1基因在很多種癌癥時(shí)都呈高度表達(dá)，當(dāng)使用RNAi技術(shù)減少其表達(dá)后，所有癌細(xì)胞的PLKlmRNA和蛋白水平都有顯著降低，如MCF-7乳腺癌細(xì)胞的PLKlmRNA下降了7O，蛋白水平下降了90，而且細(xì)胞凋亡率提高了百分之幾至50不等。所以，PLK1的siRNA具有抵抗癌細(xì)胞的增殖作用，是一種治療癌癥的新途徑。,-,24,三、RNA干擾的應(yīng)用,4.藥物開發(fā),利用RNAi技術(shù)來研究藥物作用的特異性和機(jī)制對于加快藥物開發(fā)的研制速度大有益處，因?yàn)榛蚪M研究成果和高通量的篩選技術(shù)，為更好更快發(fā)現(xiàn)藥靶和候選藥物提供了重要基礎(chǔ)。在藥物開發(fā)過程中，用RNAi技術(shù)可以對靶基因的功能進(jìn)行分析，有助于搞清藥物的作用機(jī)制以及與基因編碼產(chǎn)物，及與相應(yīng)化合物的相互作用，從而更正確地發(fā)現(xiàn)藥靶，開發(fā)更有效的候選藥物。,-,25,四、RNA干擾的研究方法,一般技術(shù)路線,-,26,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的設(shè)計(jì),1.從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。2.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST3.選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。,-,27,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的設(shè)計(jì),4.一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對照。作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。,5.計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)，如Rational_siRNA_design.xls等。,6.Internet資源的應(yīng)用：目前已證實(shí)的siRNA序列,-,28,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的制備,1.化學(xué)合成siRNA是最貴的方法，但是卻是最方便的許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成34對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究；不適用于：篩選siRNA等長時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素。,-,29,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的制備,2.體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA相對化學(xué)合成法而言成本比較低，是一種性價(jià)比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是能夠更快的得到siRNAs。體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果。不足之處：實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長期研究。,-,30,四、RNA干擾的研究方法,3.用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。這種方法制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”就可以避免這個(gè)缺陷。這個(gè)方法是選擇通常是200-1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。,siRNA的制備,-,31,四、RNA干擾的研究方法,dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢。不過這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因，雖然現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常沒有發(fā)生。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型不適用于：長時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療。,siRNA的制備,-,32,四、RNA干擾的研究方法,4.利用質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)siRNA多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴3種RNA聚合酶III啟動(dòng)子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。包括的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNApolIII啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個(gè)）U來終止轉(zhuǎn)錄的。使用這類載體，需要2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動(dòng)子下游。,siRNA的制備,-,33,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的制備,siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建,-,34,四、RNA干擾的研究方法,由于涉及到克隆，這個(gè)過程需要幾天的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴(kuò)增，這個(gè)優(yōu)點(diǎn)足以彌補(bǔ)所有缺陷，特別是當(dāng)載體在實(shí)驗(yàn)中確實(shí)有效的時(shí)候。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于這是眾多方法中唯一可以進(jìn)行長期研究的方法帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題。,siRNA的制備,-,35,四、RNA干擾的研究方法,開始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便。最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長時(shí)間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。適用于長期研究。不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。,siRNA的制備,除質(zhì)粒載體外，科研人員已經(jīng)成功地采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和慢病毒載體將表達(dá)siRNA的DNA模板序列轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞?，F(xiàn)在許多學(xué)者正在加緊腺病毒載體的siRNA轉(zhuǎn)移研究。,-,36,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的制備,5.PCR方法制備siRNA的表達(dá)框架siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。這個(gè)方法最早是由Castanotto采用，包括一個(gè)RNApolIII啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNApolIII終止位點(diǎn)。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。,-,37,四、RNA干擾的研究方法,如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長期研究。主要缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子；不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）。,siRNA的制備,-,38,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的制備,5種siRNA制備方法的比較,-,39,四、RNA干擾的研究方法,siRNA的制備,5種siRNA制備方法的比較,-,40,四、RNA干擾的研