蓮藕保鮮.doc

嘉興學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 生物與化學(xué)工程學(xué)院蓮藕保鮮技術(shù)的研究 一、選題的背景、意義蓮藕，原產(chǎn)中國和印度，我國湖南、湖北、浙江、江蘇、福建、廣東、山東普遍栽培1 ，其富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素C等成分，其汁多肉嫩、營養(yǎng)豐富，在我國有著悠久的栽培歷史2 。蓮藕是多年生宿根性草本植物3，潔白脆嫩，味微甜。生食能涼血散瘀，熟食可補心益胃，是我國傳統(tǒng)的出口商品。優(yōu)質(zhì)鮮藕外觀品質(zhì)是潔白嫩脆。鮮藕采收后表皮及肉質(zhì)部極易由白變褐色，進而變成黑色，即所謂的褐變,直接影響其感官品質(zhì)和內(nèi)在質(zhì)量，這已成為影響蓮藕出口的主要原因4 。褐變是食品中普遍存在的一種變色現(xiàn)象，尤其是新鮮果蔬原料進行加工時或經(jīng)貯藏或受機械損傷后，食品原來的色澤變暗，這些變化都屬于褐變。褐變是導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降的主要原因之一, 褐變按其發(fā)生的機理分為酶促褐變（生化褐變）和非酶促褐變（非生化褐變）兩大類5。在一些食品加工過程中，適當?shù)暮肿兪怯幸娴?，如醬油、咖啡、紅茶、啤酒的生產(chǎn)和面包、糕點的烘烤。而在另一些食品加工中，特別是水果蔬菜的加工過程，褐變是有害的，它不僅影響風(fēng)味，而且降低營養(yǎng)價值，因此了解食品褐變的反應(yīng)機理，尋找控制褐變的途徑有著重要的實際意義。蓮藕貯期發(fā)生的褐變主要是“酶促褐變”。據(jù)研究，蓮藕貯期促進褐變的酶類主要是多酚氧化酶。蓮藕組織中的大量酚類物質(zhì)，在完整細胞呼吸作用中質(zhì)子H傳遞物質(zhì)的作用下，酚-醌之間保持著動態(tài)平衡，因此，褐變發(fā)生微弱。但當組織細胞受損后氧氣進入，酚類物質(zhì)在酚酶作用下氧化為鄰醌，進而又快速地通過聚合作用形成褐色素或黑色素。醌物質(zhì)的形成需要酶和氧氣，一旦醌形成，以后的聚合與褐變反應(yīng)就能自動地進行6。蓮藕褐變的主要原因是組織中的多酚氧化酶(polyphenol oxidaseEC1. 10. 3. 1. ppo) 將酚類物質(zhì)氧化成醌，醌再聚合成有色物質(zhì)，因此蓮藕的護色關(guān)鍵在于抑制酶促褐變反應(yīng)7。 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布極廣的一種金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘渣上都可以檢測到多酚氧化酶的活性。由于其檢測方便，是被最早研究的幾類酶之一。自1883年Yoghid發(fā)現(xiàn)日本漆樹液汁變硬可能和某種活性物質(zhì)相關(guān)，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和純化，得到多酚氧化酶并將這類酶稱為polyphenol oxidase。多酚氧化酶又稱兒茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，鄰苯二酚氧化還原酶，是六大類酶中的第一大類氧化還原酶。 多酚氧化酶的共同特征是能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：單酚單氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。多酚氧化酶是一種對傷害保護性的酶，在體內(nèi)與體外條件下活力變化有較大差異。 所以通過研究底物濃度、pH、溫度以及抑制劑等對蓮藕多酚氧化酶影響的研究, 來為鮮切蓮藕的防褐及保鮮提供一個理論依據(jù)是十分必要的8。二、相關(guān)研究的最新成果及動態(tài) 2.1 多酚氧化酶提取的研究進展2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。適合需大量制樣時使用）將蓮藕洗凈，去皮，切碎，加4倍量預(yù)冷至18。C的丙酮(wv為1：4)搗碎，攪拌3min，抽濾，冷風(fēng)吹干殘渣后，混勻，得丙酮粉。稱取丙酮粉O5 g，加入02 molL，pH為54的預(yù)冷磷酸二氫鈉檸檬酸緩沖液20ml，攪拌3min，8 000rmin離心10min，所得上層清液即為粗酶液。2.1.2 勻漿法（勻漿法提取的酶液沒有活性）在鐘蘿的研究基礎(chǔ)上稍作修改：將蓮藕洗凈，去皮，切碎，加入005molL，pH54的預(yù)冷磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖溶液(含5的PVPP)，料液比為1：22，搗碎，攪拌，抽濾。向濾渣中加入005molL，pH54磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液(WV為1：1)再次攪拌，抽濾，兩次濾液合并，8 000rmin離心10rain，所得上清液即為粗酶液。2.1.3 勻漿浸提法（勻漿浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作簡便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）將蓮藕洗凈，去皮，切碎，加入005molL，pH54的預(yù)冷磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖溶液(含5的PVPP)，料液比為1：22，搗碎，攪拌，4。C下靜置4h，抽濾，所得濾液即為粗酶液。2.2 PPO的分離純化的最新進展9 取10 下貯藏到第8 天的鮮切蓮藕片組織250 g ,首先采用液氮速凍,按1 2質(zhì)量比例加入經(jīng)過預(yù)冷(4 ) 的011 mol/ L 、pH6.8 的磷酸緩沖液(內(nèi)含5 % 的PVP) ,在高速組織搗碎機上搗碎,然后于4 下浸提2 h ,用4 層脫脂紗布過濾, 濾液于10 000 r/ min 、4 下離心15min ,上清液即為多酚氧化酶粗酶液。向粗酶液中邊攪拌邊加入固體硫酸銨至30 %飽和度,4 下靜置2 h ,于10 000 r/ min 、4 下離心10 min ,棄沉淀,繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨至70 % 飽和度,4 下靜置過夜,然后于10 000 r/min 、4 下離心15 min ,棄上清液,將沉淀用盡量少的011 mol/ L 、p H 值為618 的磷酸緩沖液溶解,得到酶的提取液。然后將酶提取液用011 mol/ L 、p H 618 的磷酸緩沖液透析過夜,中間換透析液2次,然后用amicon 超濾杯濃縮至10 mL 。DEAE-Sepha-rose 層析柱(215 cm 20 cm) 首先用堿、酸和氯化鈉分別清洗以后,用011 mol/ L 、p H 值為6.8 的磷酸緩沖液平衡,將前一步驟所得的多酚氧化酶提取液上柱,首先用011 mol/ L 、p H 值為618 的磷酸緩沖液洗脫至A280保持不變時,然后換用含0015mol/ L NaCl 的上述緩沖液從低濃度到高濃度進行離子強度線形梯度洗脫(315 mL/ 管,70 mL/ h) ,然后收集有活性峰的洗脫液。將收集的洗脫液首先加固體硫酸銨至115 mol/ L 的飽和度,然后于10 000 r/ min 、4 下離心10 min ,棄沉淀,上清液準備過柱。PhenylSep harose 6 Fast Flow 疏水柱(2 cm 15 cm) 首先用含115 mol/ L 硫酸銨的011 mol/ L 、p H 618 的磷酸緩沖液平衡,然后將上述上清液上柱,首先用含115 mol/ L 硫酸銨的011 mol/ L 、p H 618 的磷酸緩沖液洗脫至A280 保持不變時,然后換用含0115mol/ L 硫酸銨的上述緩沖液從高濃度到低濃度進行離子強度線形梯度洗脫(315 mL/ 管,70 mL/ h) ,然后收集有活性峰的洗脫液,得到純化的酶液。2.3 PPO活性的測定最新進展2.31分光光度法測定PPO活性在l cm比色皿中，加入15 mL pH70的磷酸鹽緩沖溶液，再加入O1 molL鄰苯二酚溶液10mL，迅速加入PPO粗酶液05mL，混勻。在420nm波長處測吸光度，每10 s記錄1次吸光度(0)420)隨時間的變化值。最后確定30 s和l min時檢測，在室溫下測定PPO的活性(27)，測定OD420值。以最初直線段的斜率(ODt，卜時間，min)計算酶 活力。一個相對酶活性單位定義為：該酶液在測定條件下每分鐘引起吸光度值改變0001所需的酶量。PPO相對活性=各處理組吸光度值同組最佳處理組吸光度值10010。2.4 各種影響多酚氧化酶活性的因素研究2.41 PH對PPO活性的影響蓮藕PPO對pH十分敏感，強酸強堿均不利于蓮藕PPO進行催化反應(yīng)。因為蓮藕PPO是一種含銅蛋白質(zhì)，在酸性環(huán)境中，酶中的Cu2+被解離出來，使酶失活，而在堿性環(huán)境中酶蛋白與Cu2+脫離，成為不溶性氫氧化銅，也能使酶失活，中性PH附近為蓮藕PPO活力的最佳保存酸度。汪敏等證實，pH值在68附近時，蓮藕PPO表現(xiàn)最高活力，而pH升高至80時，其活力只有最高活力的87；pH降到56附近時，其活力僅為最高活力的45。王三虎等的試驗得出pH在26時蓮藕的護色效果最佳，這也佐證了前面的結(jié)論。所以，低pH值環(huán)境抑制PPO活性，有利于蓮藕護色。例如，在藕汁加工的前處理時，去皮后的蓮藕放置于pH34的食用檸檬酸溶液中，可以明顯減緩褐變發(fā)生。2.42溫度對PPO活性的影響溫度對蓮藕PPO催化反應(yīng)的影響較大。若將蓮藕切片經(jīng)清水浸漬后，在低溫與常溫兩種溫度條件下貯藏30天，觀察其褐變情況。結(jié)果表明，常溫下褐變度增加了42倍，而低溫下只增加了33倍，可見，低溫有利于抑制蓮藕PPO活力。蓮藕中PPO活力的最適溫度在30左右；60以上PP0變性失活。隨溫度降低，PPO活力下降，PPO的溫度系數(shù)Q10=19。因為蓮藕PPO在最適溫度才處于完全激活狀態(tài)，即在最適溫度以下，隨著溫度的增加蓮藕PPO的活力也增加。直至最適溫度時PPO才表現(xiàn)最大的活力。所以，熱處理溫度不高，處理時間不足，PPO活力不但不會下降，反而會有所升高。但是，也有人認為蓮藕PPO是一種熱不穩(wěn)定酶。在40情況下處理1min即表現(xiàn)出鈍化，其相對活力只為96。隨著溫度的上升，熱鈍化的速度越來越快。在70處理lm血，酶相對活力下降為45；在95下熱處理18s或100下熱處理lOs，酶即全部失活。而且，當溫度大于50時，在同一溫度下，隨著處理時間的延長，酶的相對活力下降得越快。2.43 金屬離子對PPO活性的影響PPO是一種含銅酶。Richard等認為PP0中的銅是以Cu2+的形式存在，離子間距為3610-8cm，氧是通過與Cu2+形成橋式鍵結(jié)合到酶上，兒茶酚上兩個氧基與Cu2+對上的兩個Cu2+分別鍵合，因被活化而發(fā)生氧化反應(yīng)，Cu2+對起活化作用。從理論上說，添加Fe2+等還原性金屬離子可將Cu2+還原成Cu+，從而降低PPO活性。有試驗表明1.3mg/ml的Fe2+即對馬鈴薯PPO產(chǎn)生抑制。王三虎等采用1mg/ml的CaCl2溶液對蓮藕進行浸泡護色，也取得了很好的效果。向蓮藕PPO溶液中加入抑制劑，可使酶中的Cu2+失去活化作用，致使蓮藕PP0活力下降。當加入半胱氨酸時，它的巰基與PPO中的Cu2+產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移作用而形成新的配位體，使原來復(fù)合物的幾何平面變形，阻礙了其它基團進攻Cu2+，從而降低了PPO的活性11。2.44二氧化氯對PPO活性的影響ClO2 具有消毒、殺菌、防腐、漂白、除臭等多種功效，是世界衛(wèi)生組織（WHO）和世界糧農(nóng)組織（FAO）向全世界推薦的A1 級廣譜、高效、安全化學(xué)消毒劑12。用50 mg/L、100 mg/L 濃度的ClO2 處理鮮切藕片5min、10 min、15 min 后，在貯藏期間能抑制PPO 的活性，減輕褐變，保持較好品質(zhì)。而10 mg/L 則不起抑制PPO 活性作用。100 mg/L ClO2 處理鮮切藕片10min 抑制PPO 的活性效果最好，能使藕片在4 下一周的時間里保持最佳的感官品質(zhì)和最輕的褐變度13。2.45磁場和抑制劑對蓮藕多酚氧化酶反應(yīng)動力學(xué)的影響抑制劑Vc 與磁場對蓮藕PPO 抑制作用的機理不同。Vc 能抑制酶活性是因為其具有還原性,可使酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物醌還原為酚,起到了間接抑制PPO 活性的作用;磁場引起酶活性的變化是因為磁場引起了酶構(gòu)象的改變。Vc 對蓮藕PPO 的抑制表現(xiàn)為滯后時間隨Vc 質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)S 型趨勢;磁場對蓮藕PPO 的抑制表現(xiàn)為反應(yīng)動力學(xué)曲線呈S 型,與別構(gòu)酶正協(xié)同效應(yīng)所表現(xiàn)的動力學(xué)曲線相近14。2.5 蓮藕的保鮮研究進展2.5.1 泥土埋藏先用磚塊或木板等封圍成埋藏坑, 然后一層蓮藕一層泥土地堆起56 層后, 再覆蓋深10 厘米左右細軟帶潮、手捏不成團的細泥, 并去掉碎石等雜物。埋藏時, 蓮藕要按順序一排排放齊, 避免折斷。如用水泥地板的房室儲藏, 需先用木板或竹片墊起10 厘米高的坑底, 形成一個隔層, 底上鋪1 層10 厘米厚的細泥土, 再按上法堆碼蓮藕和覆土, 儲藏室每隔15 天消毒1 次。如利用室外露地埋藏時, 應(yīng)選擇地勢高而背陽避光的地方, 將泥、 藕相間分層堆成斜坡式或?qū)毸? 最后用泥全部覆沒,周圍挖好排水溝, 遇雨天應(yīng)及時遮蓋。儲藏期間應(yīng)每隔2030 天翻檢1 次。2.5.2 泥漿涂藕儲藏選用黃土,打碎并去除砂土等雜物, 加水調(diào)制成糊狀, 然后將整支藕放入其中浸漬, 待藕身均勻裹上泥漿后取出, 裝入箱內(nèi)或草包內(nèi), 捆好即可。若泥漿干燥脫落, 可再依上法浸漬1 次。這種方法適于短期儲藏和運輸銷售。2.5.3清水保鮮用清水將藕洗凈,再放進容器內(nèi), 加滿清水, 使藕浸沒于水中, 每隔12 天換1 次涼水, 冬季保持水不結(jié)冰。此法可保鮮12 個月15。2.5.4 濃鹽水儲藏取27 份食鹽, 加73 份水, 配制成濃鹽溶液。將待儲的蓮藕洗凈泥土, 去除藕節(jié), 放入此鹽水中, 使蓮藕全部浸沒在水面以下, 即可長時間保藏。用此法儲藏蓮藕時, 可保持蓮藕潔白, 具有實用、儲藏期長的優(yōu)點, 但存在運輸費用高, 食用前需脫鹽等弊端。出口蓮藕多采用此法。2.5.5 塑料薄膜袋儲藏將蓮藕清洗干凈, 用特克多防腐劑( 500 毫克/ 千克) 浸泡處理1 分鐘后取出, 晾干, 裝于長110 厘米、寬30 厘米、厚0.03 毫米的聚乙烯塑料袋內(nèi), 扎緊袋口16。2.5.6 塑料薄膜真空包裝儲藏稱取定量的保鮮劑, 用定量的水溶解后, 將清洗干凈的節(jié)藕放入此溶液中浸漬60分鐘, 取出晾干明水之后, 裝入膜厚0.08 毫米的聚乙烯真空包裝袋中, 每袋15 千克不等, 在常溫下儲藏。儲藏期間, 只要包裝袋不松動漏氣就不需倒動和換袋。兩個月后, 儲藏的蓮藕色澤似新鮮藕。此法操作方便, 經(jīng)濟實用, 適合于超市和對外出口, 若結(jié)合低溫儲藏, 可保鮮45 個月。2.5.7保鮮劑儲藏使用的保鮮劑為60 毫克/ 升的焦亞硫酸鈉溶液+ 0.15%檸檬酸溶液+ 0.06%氯化鈣溶液+ 0.03%明礬液的混合液。儲藏時, 將洗凈的藕裝于有蓋的聚乙烯桶內(nèi), 加入合液, 將藕淹沒, 排氣密封, 可保鮮兩個月17。2.5.8氣調(diào)氣調(diào)包裝被認為是當前國際上最有效最先進的果蔬保鮮方法之一4-5，多年來國內(nèi)外一些學(xué)者對鮮切果蔬產(chǎn)品的氣調(diào)保鮮包裝進行研究18。氣調(diào)是通過調(diào)節(jié)控制氣調(diào)貯藏環(huán)境中的氣體濃度，抑制乙烯等有害氣體的積累，有效地抑制呼吸、蒸發(fā)、激素作用及微生物的活動延緩生理代謝，推遲后熟、衰老進程和防止腐敗變質(zhì)，從而減少貯藏損失，延長保鮮期，使果蔬更長久地保持新鮮和優(yōu)質(zhì)的食用狀態(tài)19。這就是氣調(diào)貯藏的原理。這種保鮮技術(shù)在國外使用比較多，在其他的蔬菜保鮮技術(shù)中，商業(yè)氣調(diào)已經(jīng)達到40到50，在蓮藕保鮮中大部分使用于鮮切藕片中，氣調(diào)不僅與氣體的比例有一定的關(guān)系，而且與包裝材料也有一定的關(guān)系(王清章和李潔，2002)。大部分使用的都是02、C02、N2三種氣體。目前不僅有氣調(diào)包裝，還有氣調(diào)室，這種方法成本比較高，比較難以控制氣體的比例，因為在貯藏過程中氣體的比例會由于蓮藕的呼吸左右而產(chǎn)生變化20。2.5.9沙藏法選擇地勢高、背風(fēng)、避雨處, 用細沙鋪襯底面, 濕度以手捏成團松開即散為宜, 并在四周挖好排水溝, 碼放一層蓮藕鋪上一層細沙。如此沙、藕相間, 疊放5層6層, 最上面蓋厚約10厘米的濕沙即可。此法一般可保鮮60天左右。另外, 也可在室內(nèi)用磚或木板圍成埋藏坑, 坑內(nèi)鋪上5厘米厚的濕沙, 將挖出帶泥的蓮藕按順序排放, 然后層藕層沙, 碼5層6層高, 最上面蓋厚約5厘米的濕沙即可21。3、 課題的研究內(nèi)容及擬采取的研究方法（技術(shù)路線）、難點及預(yù)期達到的目標3.1 研究內(nèi)容及其目標由于蓮藕中富含酚類、碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其制品在加工過程中容易褐變，造成品質(zhì)變化，貯藏期縮短，嚴重影響蓮藕產(chǎn)品的感官質(zhì)量，因而，開展蓮藕的護色保鮮開發(fā)是儲存、加工和銷售等環(huán)節(jié)的核心問題。 本課題擬從抑制多酚氧化酶活性著手，對蓮藕保鮮技術(shù)進行開發(fā)研究，找出較好的蓮藕保鮮技術(shù)。3.2 采取的研究方法通過各種因素如溫度、PH等對PPO活性的影響的實驗，來確定能抑制PPO活性的一些方法，從而找出較好的蓮藕保鮮技術(shù)。3.3 課題的研究難點影響多酚氧化酶活性的因素有很多，能抑制多酚氧化酶活性的方法也很多，要通過實驗找出最好的既能最大程度抑制多酚氧化酶活性，又能保證最經(jīng)濟且無害健康的方法是本課題難點所在。3.4 實驗方案3.4.1 材料 蓮藕3.4.2 提取溶劑 交聯(lián)聚維酮3.4.3 提取方法勻漿浸提法稱取蓮藕 切碎 加入005molL、pH54的預(yù)冷磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖溶液(含5的PVPP) 在高速組織搗碎機上搗碎 4下浸提2 h 用4層脫脂紗布過濾 濾液于10 000 rmin、4下離心15rain 上清液即為多酚氧化酶粗酶液3.4.4 PPO活性的測定分光光度法測定PPO活性依次向試管中加入005molL，pH70磷酸二氫鉀氫氧化鈉緩沖溶液15ml和0030molL鄰苯三酚10ml，50。C水浴3min，立刻加入05ml PPO粗酶液，搖勻，在420nm波長下進行比色測定，酶液加入后開始計時，每30s記錄一次吸光度A值，共記錄3min(鮑金勇等，2005)。1個活力單位)定義為在測定條件下lmin引起吸光值改變0001所需的酶量。3.4.5 各因素對PPO活性的影響 通過不同的溫度、PH等條件來測PPO的活性，然后得出能抑制PPO活性的條件，從而找出較好的蓮藕保鮮技術(shù)。3.5 實驗試劑及相關(guān)儀器高速組織搗碎機，722型分光光度計，高速離心機，01 molL、pH68的磷酸緩沖液，聚維酮等。四、論文詳細工作進度和安排五、主要參考文獻1徐莉,王慶國.蓮藕采后生理生化特性研究J.FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES,2007;33(5):1662 藍碧鋒,張金云. 蓮藕采后生理及保鮮技術(shù)研究進展A;中國園藝學(xué)會第五屆學(xué)術(shù)研討會C;2002年3 王向陽,姜麗佳,王忠英. 蓮藕的酶促褐變及其貯藏中褐變的控制J.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009,25（4）：2764閆瑞香,張華云,高海燕等. 蓮藕保鮮技術(shù)研究J.STORAGE&PROCESS,2001;1(6):85 羅金國,李潔,王清章. 鮮切蓮藕片的防褐變研究J. 食品研究與開發(fā),2006,27(6):75-766張有林,朱芬.蓮藕貯期褐變機理與防褐變技術(shù)研究J. 食品工業(yè)科技,2003,24(1):87-897 黃建韶,田宏現(xiàn). 蓮藕中多酚氧化酶的性質(zhì)J. 吉首大學(xué)學(xué)報,2002,23(2):82-848 高愿軍,郝亞勤,南海娟等. 蓮藕多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究J. 食品研究與開發(fā),2006,27(7):17-199 潘永貴,陳維信. 鮮切蓮藕組織中多酚氧化酶的分離純化J. 食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008,27(3):55-6010 王清章,彭光華,金悠等. 蓮藕中酚類物質(zhì)