葡萄糖對(duì)人肝細(xì)胞血管生成素樣蛋白3表達(dá)的影響.doc

KKME-專業(yè)醫(yī)學(xué)搜索引擎/葡萄糖對(duì)人肝細(xì)胞血管生成素樣蛋白3表達(dá)的影響作者:李倩,王繼紅,程梅,王欣 【摘要】 目的：觀察高濃度葡萄糖對(duì)人肝細(xì)胞株（L02）及胰島素抵抗細(xì)胞模型（IRL02）的血管生成素樣蛋白3（ANGPTL3）表達(dá)的影響，探討ANGPTL3與糖尿?。―M）并發(fā)高脂血癥的關(guān)系，在細(xì)胞水平分析DM并發(fā)高脂血癥的分子機(jī)制. 方法：以L02為研究對(duì)象，并建立胰島素抵抗模型（IRL02）. L02和IRL02兩組細(xì)胞分別在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，5.6 mmol/L組作為對(duì)照組. 用RTPCR方法檢測(cè)ANGPTL3的mRNA表達(dá)量，并用Western Blot方法檢測(cè)ANGPTL3蛋白質(zhì)表達(dá)水平，分析ANGPTL3與DM并發(fā)高脂血癥的關(guān)系. 結(jié)果：高濃度葡萄糖可促進(jìn)L02和IRL02兩組細(xì)胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，并呈一定的量效關(guān)系，變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0001）；IRL02細(xì)胞對(duì)葡萄糖的刺激尤為敏感（P0.0001）. 結(jié)論：高濃度葡萄糖可上調(diào)ANGPTL3的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，其在DM并發(fā)高脂血癥中可能起重要作用. 【關(guān)鍵詞】 血管生成素樣蛋白3；糖尿病；高脂血癥；葡萄糖；胰島素抗藥性 0引言 人血管生成素樣蛋白3（angiopoientinlike protein 3，ANGPTL3）是Mr約為70 ku的分泌蛋白，由460個(gè)氨基酸組成，其氨基端的螺旋樣結(jié)構(gòu)域與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能相關(guān)，主要在肝臟中表達(dá)1. ANGPTL3可通過抑制脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的活性導(dǎo)致以極低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）三酰甘油升高為主的高脂血癥. 脂代謝與糖代謝在多個(gè)環(huán)節(jié)相互作用，共同影響糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的發(fā)生與發(fā)展. 血脂異常是DM的危險(xiǎn)因素，而有關(guān)ANGPTL3與DM相關(guān)性的研究目前國內(nèi)外都極少報(bào)道. 本實(shí)驗(yàn)通過研究高糖環(huán)境下人肝細(xì)胞株（L02）及其胰島素抵抗細(xì)胞模型（insulin resistant L02，IRL02）ANGPTL3的mRNA和蛋白表達(dá)量變化，分析葡萄糖對(duì)該基因表達(dá)的影響，擬從分子水平探討ANGPTL3在DM并發(fā)高脂血癥中的病理生理作用. 1材料和方法 1.1材料L02（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所）；RPMI 1640培養(yǎng)基，1125胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；RTPCR試劑盒（寶生物大連有限公司）；ANGPTL3 基因引物和Actin引物，胰島素（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和Actin小鼠mAb（英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎國生物制品公司）；免疫印跡（Western Blot）試劑盒（Santa Cruz公司）. PCR儀，微型電轉(zhuǎn)移裝置，GelDoc 100凝膠成像儀（美國BioRad公司）. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和胰島素抵抗模型的建立L02細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在50 mL/L CO2, 37條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn). 用含510-7 mol/L胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h的L02細(xì)胞代替胰島素抵抗模型，稱為IRL02細(xì)胞，以在不含胰島素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h的L02細(xì)胞為對(duì)照. 細(xì)胞計(jì)數(shù),接種后隨機(jī)分為L02細(xì)胞組和IRL02細(xì)胞組. 其中L02細(xì)胞組在上述條件培養(yǎng)16 h，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，又分為G1G5五個(gè)亞組，分別用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，設(shè)G1為對(duì)照組. IRL02細(xì)胞組：除用含510-7 mol/L胰島素的培養(yǎng)液替換胎牛血清培養(yǎng)L02細(xì)胞外，其它培養(yǎng)條件和時(shí)間與L02細(xì)胞組完全相同，同樣分為IRG1G5五個(gè)亞組，設(shè)IRG1為對(duì)照組. 1.2.2RTPCR檢測(cè)ANGPTL3的mRNA表達(dá)量按總RNA抽提試劑盒說明操作提取細(xì)胞總RNA，用UV法定量分析RNA得率和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性. cDNA合成（10 L反應(yīng)體系）：取MgCl2 2 L，10RT緩沖液1 L，無核酸酶蒸餾水3.75 L，dNTP混合液1 L，RNA酶抑制劑0.25 L，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 L，隨機(jī)引物0.5 L，總RNA(300 ng) 1 L. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30 10 min，42 30 min，99 5 min，5 5 min，所得產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增. PCR反應(yīng)：采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ANGPTL3引物和Actin引物. ANGPTL3上游引物序列：5 TCC AGA ACA CCC AGA AGT AAC 3，下游引物序列: 5 CCA GCC TCC TGA ATA ACC CT 3；Actin上游引物序列:5 TCC TCC CTG GAGAAG AGC TA 3，下游引物序列：5 TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3. ANGPTL3和Actin反應(yīng)同管進(jìn)行，終體積50 L. PCR反應(yīng)條件：94 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 30 s，55 30 s，72 1 min，共35個(gè)循環(huán). 取8 L反應(yīng)液進(jìn)行25 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，Quantity One軟件分析，將ANGPTL3與Actin面積灰度值的比值作為ANGPTL 3的mRNA表達(dá)量參數(shù). 1.2.3Western Blot檢測(cè)細(xì)胞ANGPTL3的蛋白質(zhì)表達(dá)量提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，Lowry法測(cè)定總蛋白濃度. Western Blot：蛋白質(zhì)提取液（含60 g總蛋白）與5SDS上樣緩沖液按體積比41混合，常規(guī)處理后進(jìn)行100 g/L SDS聚丙烯酰胺電泳，電轉(zhuǎn)過夜，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜. 常規(guī)Western Blot方法操作，ANGPTL3 mAb 11000稀釋，Actin mAb 15000稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠mAb 15000稀釋. 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One軟件分析，ANGPTL3與Actin的面積灰度值比值作為ANGPTL3的蛋白質(zhì)表達(dá)參數(shù). 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用xs表示，用SAS 9.1軟件分析，采用析因設(shè)計(jì)方差分析，P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1實(shí)驗(yàn)整體統(tǒng)計(jì)結(jié)果由表1可見，隨著葡萄糖濃度增加， L02細(xì)胞及IRL02細(xì)胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量也隨之增加，對(duì)mRNA表達(dá)影響的析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果為F=84.14, P0.0001；對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)影響分析結(jié)果為F=115.93, P0.0001，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 在mRNA水平，葡萄糖濃度的影響：F=178.67，P0.0001；細(xì)胞組間比較：F=6.33，P0.05；葡萄糖濃度與細(xì)胞組比較：F=9.07，P=0.0002. 即葡萄糖對(duì)ANGPTL3的mRNA表達(dá)有明顯影響，在葡萄糖不同濃度組、不同細(xì)胞組和兩者的交互作用方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 在ANGPTL3蛋白質(zhì)表達(dá)方面，葡萄糖濃度變化對(duì)ANGPTL3表達(dá)影響的F=181.05；細(xì)胞組間比較F=194.72；濃度與細(xì)胞組間比較F=31.11，三者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）. 說明ANGPTL3的基因表達(dá)對(duì)低葡萄糖濃度刺激不太敏感；而G3G5組與G1組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0001）. 5個(gè)亞組間任意兩組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），即當(dāng)葡萄糖濃度升至11.133.3 mmol/L時(shí)，L02細(xì)胞ANGPTL3的mRNA表達(dá)升高（表1, 圖1）. 在蛋白質(zhì)表達(dá)水平， G2G5組與G1組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）外， 其它各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）， 顯示高濃度葡萄糖可促進(jìn)L02細(xì)胞ANGPTL3蛋白質(zhì)的表達(dá)（表1，圖2）. 2.3不同濃度葡萄糖對(duì)IRL02細(xì)胞ANGPTL3表達(dá)的影響在IRG1 IRG5五個(gè)亞組細(xì)胞間ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量比較（表1，圖3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0001，）. 在mRNA水平，IRG2 IRG5各組與IRG1組間比較，以及各亞組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0001），顯示高糖可明顯刺激IRL02細(xì)胞ANGPTL3的mRNA表達(dá)，使其顯著升高. 在蛋白質(zhì)表達(dá)水平（表1，圖4），IRG2 IRG5各組與IRG1組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0001），即隨培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增加，ANGPTL3蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯升高. IRG2，IRG3和IRG5組組間兩兩比較顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）. 顯示在極高濃度葡萄糖環(huán)境中，ANGPTL3蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)量的增加已受到限制. 2.4同濃度葡萄糖對(duì)L02和IRL02兩組細(xì)胞ANGPTL3表達(dá)的影響兩組細(xì)胞ANGPTL3的mRNA表達(dá)，除葡萄糖濃度5.6 mmol/L組IRL02細(xì)胞的表達(dá)量低于L02細(xì)胞外；其它各組均呈現(xiàn)IRL02細(xì)胞表達(dá)量明顯高于L02細(xì)胞(表1). 比較同葡萄糖濃度兩組細(xì)胞mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，除7.0 mmol/L和11.1 mmol/L組IRL02細(xì)胞的表達(dá)雖比L02細(xì)胞增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）外；其余三組葡萄糖濃度對(duì)任意兩組細(xì)胞的影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）. 在ANGPTL3蛋白質(zhì)表達(dá)水平，IRL02細(xì)胞的表達(dá)量除葡萄糖5.6 mmol/L組低于L02細(xì)胞外，其它各組ANGPTL3的表達(dá)均明顯高于L02細(xì)胞組（表1），且各濃度葡萄糖對(duì)兩組細(xì)胞ANGPTL3 表達(dá)的影響除葡萄糖5.6 mmol/L組外，其它組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.0001）. 3討論 DM導(dǎo)致患者死亡的最常見原因是心血管并發(fā)癥，2型DM患者約有58%死于動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病，其特征是胰島素（相對(duì)）缺乏和胰島素抵抗，而胰島素抵抗常引起內(nèi)源性胰島素過渡分泌，嚴(yán)重的高胰島素血癥因?qū)PL的激活作用明顯減弱可引起三酰甘油水平升高2，并與血糖控制不滿意密切相關(guān). 本研究結(jié)果顯示，高糖可明顯刺激L02細(xì)胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，在IRL02細(xì)胞高糖對(duì)該基因的上調(diào)作用更加明顯，說明ANGPTL3基因的表達(dá)在體內(nèi)極可能受血糖的調(diào)控，提示高血糖可以通過上調(diào)ANGPTL3的表達(dá)促進(jìn)高脂血癥的發(fā)生與發(fā)展，ANGPTL3與DM及其相關(guān)高脂血癥密切相關(guān). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)環(huán)境葡萄糖濃度升高到7.033.0 mmol/L時(shí)，IRL02的ANGPTL3基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量都顯著增加，并有劑量依賴性，但當(dāng)細(xì)胞處于葡萄糖濃度為5.6 mmol/L時(shí)，ANGPTL3的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)反而降低，說明良好地控制血糖對(duì)預(yù)防DM脂代謝紊亂有重要意義. 有關(guān)胰島素抵抗血糖異常狀態(tài)下，胰島素信號(hào)通路可能通過上調(diào)ANGPTL3的表達(dá)導(dǎo)致血脂升高的具體機(jī)制我們正在進(jìn)一步研究. ANGPTL3大量表達(dá)可引發(fā)三酰甘油升高為主的高脂血癥3. 而高三酰甘油血癥參與了一系列代謝性疾病的發(fā)病過程4-5. ANGPTL3的大量表達(dá)還可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂解作用，釋放大量FFA6，而FFA是肥胖導(dǎo)致IR的一項(xiàng)重要因素7；攝入高脂飲食和循環(huán)中的游離脂肪酸濃度增高可導(dǎo)致外周組織和肝臟的胰島素抵抗，進(jìn)而產(chǎn)生2型DM和代謝綜合征8. 我們的研究結(jié)果提示，胰島素抵抗引發(fā)的高血糖狀態(tài)可通過上調(diào)ANGPTL3的表達(dá)，導(dǎo)致循環(huán)中三酰甘油和FFA增高，發(fā)生高脂血癥，而增高的三酰甘油和FFA又加重了肝臟及外周組織的胰島素抵抗，形成惡性循環(huán)，互為因果. 有研究還發(fā)現(xiàn)ANGPTL3基因是LXR的直接靶點(diǎn)9-11. 對(duì)LXR的研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖是其內(nèi)源性配基12，提示葡萄糖上調(diào)ANGPTL3的表達(dá)機(jī)制可能與LXR有關(guān). 綜上所述，ANGPTL3可能是DM和高脂血癥發(fā)生、發(fā)展和橋接的關(guān)鍵點(diǎn)，對(duì)于ANGPTL3的基礎(chǔ)研究有助于DM，高脂血癥等代謝性疾病的病因?qū)W的發(fā)展，而針對(duì)ANGPTL3表達(dá)的調(diào)控和干預(yù)有望成為治療這類疾病的新型治療手段和途徑. 【參考文獻(xiàn)】 1 Ono M, Shimizugawa T, Mitsuru S, et al. Protein region important for regulation of lipid metabolism in angiopoietinlike 3(ANGPTL3):Angptl3 is cleaved and activated in vivoJ. Biol Chem, 2003,278(43)：41804-41809. 2 Shimamura M，Matsuda M，Ando Y，et al. 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