《生物化學教學課件》rnabiosynth

第十六章RNA的生物合成 轉錄 RNABiosynthesis transcription 定義 在RNA聚合酶的催化下 生物體以DNA為模板合成RNA的過程 轉錄產物 mRNA rRNA tRNA等 轉錄的選擇性 不對稱轉錄 asymmetrictranscription 結構基因 能轉錄出RNA的DNA區(qū)段 不對稱轉錄在特定的生長發(fā)育階段 轉錄只在某些DNA區(qū)段進行DNA雙鏈中僅有一條單鏈可作為模板指導轉錄的進行 且模板鏈并非總在同一條單鏈上 RNA生物合成體系 原料 NTP ATP UTP GTP CTP 模板 DNA酶 RNA聚合酶 RNApolymerase RNA pol 其他蛋白質因子 第一節(jié)轉錄的模板和酶 1 模板 template 模板鏈 templatestrand 編碼鏈 codingstrand 2 RNA聚合酶 DNAdependentRNApolymerase RNA pol a 原核生物的RNA聚合酶 以E coli為例 2 核心酶 coreenzyme 2 全酶 holoenzyme 亞基 辨認轉錄起始點特異抑制劑 利福平 催化NTP按模板的指引合成RNA b 真核生物的RNA聚合酶RNA pol 45S rRNARNA pol hnRNA lncRNA piRNA miRNARNA pol 5S rRNA tRNA snRNA特異抑制劑 鵝膏蕈堿 真核生物RNA聚合酶的亞基組成 各有2個不同的分子量超過100kD的大分子量的亞基都含有多個小分子量的亞基某些小分子量的亞基相同 可同時出現在兩種或三種酶上 3 RNA聚合酶辨認結合DNA模板的啟動子原核生物的轉錄單位 操縱子 operon TTGACA TATAAT PribnowBox 5 3 3 5 RNA pol辨認位點 recognitionsite RNA聚合酶保護法 轉錄過程 起始 initiation 延長 elongation 終止 termination 第二節(jié)原核生物的轉錄過程 轉錄起始 Initiation 需要解決兩個問題 RNA聚合酶必須準確的結合在轉錄模板的啟動序列區(qū)域DNA雙鏈解開 其中的一條單鏈作為轉錄模板 轉錄起始過程 形成閉合轉錄復合體 全酶靠 亞基識別結合啟動序列的 35區(qū) 形成閉合的全酶 DNA復合物DNA雙鏈打開 開放轉錄復合體 全酶隨即滑動至 10區(qū) 在 亞基的作用下 啟動序列區(qū)域的DNA雙鏈迅速打開 形成開放轉錄復合體 轉錄起始復合物形成 在轉錄起始點 RNA聚合酶催化發(fā)生第一次聚合反應 形成轉錄起始復合物 sigmasubunit allowsRNApolymerasetorecognizeandbindspecificallytopromoterregions E coliRNApolymerase subunit 轉錄起始復合物 5 pppGpN OH3 轉錄延長a 轉錄延長的化學反應 RNA聚合酶的反應機制 mRNA mRNA b 轉錄空泡 transcriptionbubble 轉錄終止 termination 1 依賴Rho因子的轉錄終止 2 非依賴Rho因子的轉錄終止 1 依賴Rho因子的轉錄終止 a RhoworksbychasingRNApolymeraseandknockingitoffthetemplateb ThisisanactiveprocessthatrequiresthehydrolysisofATP 依賴Rho因子的轉錄終止模式 1 Rho因子辨認結合新生RNA鏈上的Rho因子識別位點 借助水解ATP獲得的能量推動其沿著RNA鏈由5 3 端移動到達RNA聚合酶區(qū)域 并使RNA聚合酶構象發(fā)生變化而停頓 2 Rho因子利用其解螺旋酶的活性在ATP供能的情況下 使DNA RNA雜化雙鏈解離 從而使RNA鏈和RNA聚合酶從轉錄復合物上脫落下來 轉錄過程隨即終止 2 非依賴Rho因子的轉錄終止 非依賴Rho因子的轉錄終止模式 1 當RNA鏈延長至接近終止區(qū)時 該區(qū)域附近的轉錄產物形成特殊的莖環(huán)結構 阻止RNA聚合酶繼續(xù)向前移動 并促進轉錄復合物的解體 2 莖環(huán)結構末端的一段寡聚U與DNA鏈之間形成的U A配對極不穩(wěn)定 亦有助于RNA鏈從轉錄復合物上脫落 Termination 6 7 PhasesofRNASynthesis 轉錄過程 起始 initiation 延長 elongation 終止 termination 第三節(jié)真核生物 的生物合成 轉錄延長 RNA Pol RNA Pol RNA Pol 核小體 轉錄延長中的核小體移位 轉錄方向 5 AAUAAA 5 AAUAAA 核酸酶 GUGUGUG RNA pol AATAAAGTGTGTG 轉錄終止的修飾點 5 5 3 3 3 加尾 AAAAAAA 3 mRNA 和轉錄后修飾密切相關 轉錄終止 第四節(jié)真核生物RNA的加工 Eukaryoticpost transcriptionalmodification 幾種主要的修飾方式 1 剪接 splicing 2 剪切 cleavage 3 修飾 modification 4 添加 addition 真核生物mRNA的轉錄后加工1 5 帽子結構2 3 poly A 尾巴3 mRNA剪接 mRNAsplicing 4 mRNA編輯 mRNAediting 1 5 帽子結構 m7GpppG G 7 甲基鳥苷酸 加帽過程需要加帽酶和甲基轉移酶的參與 5 pppGp 帽子結構的生成 帽結構的作用 對mRNA的5 端起保護作用 避免酶解 在蛋白質合成中促進mRNA翻譯 2 3 poly A 尾巴 polyA尾不是模板編碼 基因中沒有相應序列 轉錄生成的mRNA在核內以ATP為底物 在polyA聚合酶催化下逐個加上去 形成polyA尾結構 真核細胞內mRNA的polyA可長達100 200個腺苷酸 5 m7GpppG3 AAAA AAAAAAApolyA尾的作用 增加mRNA自身的穩(wěn)定性 維持mRNA翻譯模板的活性 3 端多聚腺苷酸 polyA 尾的形成 3 mRNA剪接 斷裂基因 splitgene 真核生物結構基因 由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成 這些基因稱為斷裂基因 編碼區(qū) 外顯子 exon 非編碼區(qū) 內含子 intron a 剪接信號 3 mRNA的剪接機制 U1snRNP和U2snRNP分別結合在內含子的3 和5 末端 U4 U5 U6加入 形成剪接體 內含子彎曲形成套索狀 E1 E2距離拉近 U2和U6形成催化中心 發(fā)生轉酯反應 即磷酸二酯鍵的轉移反應 U2 pG OH ppG OH pppG OH 剪接過程的二次轉酯反應 twicetransesterification U1 snRNA U2 snRNA RNA編輯作用說明 基因的編碼序列經過轉錄后加工 是可有多用途分化的 因此也稱為分化加工 differentialRNAprocessing 4 mRNA的編輯 mRNAediting 轉錄后mRNA上的修飾和加工使其攜帶的遺傳信息發(fā)生改變 補 內含子的分類 根據基因的類型和剪接的方式 通常把內含子分為4類 I 主要存在于線粒體 葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因 II 也發(fā)現于線粒體 葉綠體 轉錄產物是mRNA III 是常見的形成套索結構后剪接 大多數mRNA基因有此類內含子 IV 是tRNA基因及其初級轉錄產物中的內含子 剪接過程需酶及ATP 真核生物tRNA的轉錄后加工 tRNA前體 連接酶 tRNA核苷酸轉移酶 ATP ADP 堿基修飾 真核生物rRNA的轉錄后加工 四膜蟲rRNA的二級結構 四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式 5 端核苷酸序列 核酶 ribozyme 具有酶促活性的 分子 一般是指無需蛋白質參與或不與蛋白質結合 就具有催化功能的RNA分子 1968年FrancisCrick在他的論文 基因密碼的起源 一文中提到 可能第一個酶是具有復制能力的RNA 時 沒有人予以注意 20年后 在1987年第52屆冷泉港定量生物學國際討論會上AlanWeiner做會議總結時又重復了20年前FrancisCrick的話 會議注意力已集中到最近發(fā)現的具有酶活性的RNA分子上 核酶的發(fā)現 1981年 Cech發(fā)現四膜蟲rRNA的前體在沒有蛋白質的情況下能專一地催化寡聚核苷酸底物的切割與連接 具有分子內催化的活性 1983年 Altman等發(fā)現大腸桿菌RNaseP的蛋白質部分除去后 在體外高濃度Mg2 存在下 留下的RNA部分 M1RNA 具有與全酶相同的催化活性 1986年 Cech又證實rRNA前體的內含子能催化分子間反應 1995年6月 Cuenoud等設計了具有連接酶活性的DNA分子 它能夠催化兩個DNA片段的連接 同年10月 Usman等人化學合成了一個由14個脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA片段 能夠較弱地水解RNA磷酸二酯鍵 利用體外分子進化技術獲得的一種具有高效催化活性和結構識別能力的單鏈DNA片段 稱為酶性DNA 又稱脫氧核酶 T Cech的研究工作 研究目的 細胞中DNA轉錄成rRNA后 rRNA中一些無意義的序列 或 內含子 intron 如何從RNA分子中剪切下來的 根據過去傳統的概念 這一過程必須要有蛋白質酶來完成 研究對象 四膜蟲 其含有一種rRNA前體 其組成中除了核糖體RNA的固有序列外還有一個由413個核苷酸組成的插入序列 interveningsequence IVS 重要發(fā)現開始于1981年 研究發(fā)現 a 轉錄產物rRNA前體很不穩(wěn)定 在鳥苷和Mg2 存在下切除自身的413個核苷酸的內含子 IVS 使兩個外顯子拼接起來 變成成熟的rRNA分子 催化反應是在沒有任何蛋白質酶的存在下發(fā)生的 稱為自我剪接 b IVS具有類似蛋白酶的功能 能夠打斷及重建磷酸二脂鍵 rRNA前體能靠自己完成剪接過程 在一定條件下rRNA前體可以按一定方式盤繞 進而自己切割自己 然后把保留的rRNA部分的末端連接起來 即它是可以催化自有底物切割的具有酶活性的RNA RNA分子具有自身斷裂的催化作用 以及酶活性的另一個重要方面即催化其他分子的反應 研究目的 t RNA分子的剪接過程研究發(fā)現 在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下 核糖核酸酶P RNaseP 中的RNA能夠切割tRNA前體的5 端 S Altman的研究工作 核糖核酸酶P是一種核糖核蛋白 含有一個單鏈RNA分子 長度為375個堿基 結合一個相對分子質量為20kDa的多肽 119個氨基酸殘基 過去都認為核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白質共同完成的 而該實驗證明 核酸酶P的催化作用是由RNA完成的 而其中的蛋白質在細胞內僅僅起穩(wěn)定構象的作用 ThomasRobertCech SidneyAltman 核酶的發(fā)現對于所有酶都是蛋白質的傳統觀念提出了挑戰(zhàn) 1989年 核酶的發(fā)現者T Cech和S Ahman被授予諾貝爾化學獎 最簡單的核酶二級結構 槌頭狀結構 hammerheadstructure 底物部分 通常為60個核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份組成錘頭結構 人工設計的核酶 粗線表示合成的核酸分子細線表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點 一 應用于生命起源的研究 核酶的應用 生命的起源 新的觀點 生命從RNA開始目前已經找到了一些催化基本生化反應 如RNA剪切 連接 合成以及肽鍵合成等 的核酶 這些結果支持了在蛋白質產生以前核酶可能參與催化最初的新陳代謝的設想 二 在醫(yī)學領域中的應用 經過基因工程改造的核酶 可以位點特異性地切割任意給定的RNA分子 從而抑制目標基因的表達 抑制效率高 專一性強 利用核酶的剪接能力 可引入新的基因功能或修復已有的基因缺陷 免疫源性低 很少引起免疫反應 針對錘頭核酶而言 催化結構域小 既可作為轉基因表達產物 也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在體內轉運 核酶技術面臨的問題 核酶催化切割反應的可逆性問題提高催化效率尋找合適載體將核酶高效 特異地導入靶細胞使核酶在細胞內有調控地高效表達增強核酶在細胞內的穩(wěn)定性對宿主的損傷問題有待進一步考察 轉錄是基因表達的重要環(huán)節(jié) 轉錄產物進一步參與和調控基因表達 翻譯環(huán)節(jié) DNA RNA Protein 轉錄 翻譯 轉錄具有十分重