PCR技術(shù)的原理與方法ppt課件

PCR技術(shù)的原理與方法 鐘召迪 PCR定義 聚合酶鏈反應(yīng) PolymeraseChainReaction 簡(jiǎn)稱 是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的 片段的分子生物學(xué)技術(shù) 是指在DNA聚合酶的催化下 以母鏈DNA為模板 一特定引物為延伸起點(diǎn) 經(jīng)過(guò)變性 退火 延伸等步驟 體外復(fù)制出于母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程 可用于基因分離克隆 序列分析 基因表達(dá)調(diào)控 基因多態(tài)性研究等 PCR反應(yīng)特點(diǎn) 特異性強(qiáng)靈敏度高簡(jiǎn)便 快速對(duì)標(biāo)本的純度要求低 PCR技術(shù)的基本原理 PCR的反應(yīng)成分PCR的反應(yīng)基本步驟PCR的反應(yīng)體系 PCR的反應(yīng)成分 模板DNA引物四種脫氧核糖核苷酸DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液 Mg2 PCR的反應(yīng)基本步驟 PCR的反應(yīng)基本步驟變性 高溫使雙鏈DNA解離成單鏈 94 30s 退火 低溫下 引物與DNA模板互補(bǔ)區(qū)結(jié)合 55 30s 延伸 中溫延伸 DNA聚合酶催化以引物為起點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng) 70 72 30 60s PCR的反應(yīng)體系 10 擴(kuò)增緩沖液1 10體積4種dNTP混合物各200umol L引物 2個(gè) 0 2umol L模板DNA102 105TaqDNA聚合酶1 2 5單位 反應(yīng)體系Mg2 1 5 2 5mmol L加雙或三蒸水至25 50ul PCR反應(yīng)五要素 引物 primer 酶 TaqDNApolymerase dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 模板 template Mg2 magnesium 引物 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上 只要知道任何一段模板DNA序列 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物 用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)的原則 引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度一般在15 30堿基之間引物GC含量在40 60 之間 Tm值最好接近72 引物3 端要避開(kāi)密碼子的第3位引物3 端不能選擇A 最好選擇T堿基要隨機(jī)分布引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列 引物設(shè)計(jì)的原則 引物5 端和中間 G值應(yīng)該相對(duì)較高 而3 端 G值較低引物的5 端可以修飾 而3 端不可修飾擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)引物應(yīng)具有特異性 酶及其濃度 目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶 從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶 大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2 5U 指總反應(yīng)體積為100ul時(shí) 濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增 濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少 DNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀 保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性 使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后 以1MNaOH或1MTris HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7 0 7 5 小量分裝 20 冰凍保存 多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中 dNTP應(yīng)為50 200umol L 尤其是注意4種dNTP的濃度要相等 等摩爾配制 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) 偏高或偏低 就會(huì)引起錯(cuò)配 濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2 結(jié)合 使游離的Mg2 濃度降低 模板 靶基因 TARGETGENE 模板核酸的量與純化程度 是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本SDS的主要功能是 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì) 因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜 并解離細(xì)胞中的核蛋白 SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì) 特別是與DNA結(jié)合的組蛋白 再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份 用乙醇或異丙醇沉淀核酸 MG2 濃度 Mg2 對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中 各種NTP濃度為200umol L時(shí) Mg2 濃度為1 5 2 0mmol L為宜Mg2 濃度過(guò)高 反應(yīng)特異性降低 出現(xiàn)非特異擴(kuò)增 濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性 使反應(yīng)產(chǎn)物減少 PCR反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件 溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù) 溫度與時(shí)間的設(shè)置 設(shè)置變性 退火 延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法 雙鏈DNA在90 95 變性 再迅速冷卻至40 60 引物退火并結(jié)合到靶序列上 然后快速升溫至70 75 在TaqDNA聚合酶的作用下 使引物鏈沿模板延伸對(duì)于較短靶基因 長(zhǎng)度為100 300bp時(shí) 可采用二溫度點(diǎn)法 將退火與延伸溫度合二為一 一般采用94 變性 65 左右退火與延伸 變性溫度與時(shí)間 變性溫度低 解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93 94 lmin足以使模板DNA變性若低于93 則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過(guò)高 因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響 此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性 就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗 退火 復(fù)性 溫度與時(shí)間 退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40 60 可使引物和模板發(fā)生結(jié)合 由于模板DNA比引物復(fù)雜得多 引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞退火溫度與時(shí)間 取決于引物的長(zhǎng)度 堿基組成及其濃度 還有靶基序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸 G C含量約50 的引物 55 為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想 延伸溫度與時(shí)間 延伸溫度 一般選擇在70 75 之間常用溫度為72 過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合 延伸反應(yīng)時(shí)間 根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段 延伸時(shí)間1min 足夠 3 4kb的靶序列需3 4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增 延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度