維生素D2產(chǎn)品開發(fā)

維生素D2產(chǎn)品開發(fā)VD2是VD的一種活化形式，由存在植物、真菌體內(nèi)的VD2前體-麥角固醇(又稱麥角甾醇)經(jīng)紫外線照射轉(zhuǎn)變而來，它的化學(xué)名稱為9,10- 開環(huán)麥角甾- 5,7,10(19),22- 四烯-3- 醇。分子式C28H44O，分子量396.66，其分子結(jié)構(gòu)式為：圖1 維生素D2的分子結(jié)構(gòu)式維生素D2促進(jìn)小腸黏膜刷狀緣對鈣的吸收及腎小管重吸收磷，提高血鈣、血磷濃度，協(xié)同甲狀旁腺激素（PTH）、降鈣素（CT），促進(jìn)舊骨釋放磷酸鈣，維持及調(diào)節(jié)血漿鈣、磷正常濃度。維生素D2促使鈣沉著于新骨形成部位，使枸櫞酸鹽在骨中沉積，促進(jìn)骨鈣化及成骨細(xì)胞功能和骨樣組織成熟。維生素D2攝入后，在細(xì)胞微粒體中受25-羥化酶系統(tǒng)催化生成骨化二醇(25-OHD3)，經(jīng)腎近曲小管細(xì)胞1-羥化酶系統(tǒng)催化，生成具有生物活性的骨化三醇1-25-(OH)2D3。VD2是一種具有廣泛效應(yīng)的激素載體，與人體鈣、磷的吸收有關(guān)，具有明顯的抗癌功效1。此外有研究認(rèn)為VD2可刺激某些植物根系的生成。1.1 維生素D2的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝維生素D2傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)方法是以麥角甾醇為原料，在加溫的特定條件下，于乙醇溶液中在波長為280nm左右的紫外線照射，然后除去溶劑，殘留物中的麥角骨化醇經(jīng)過馬來酐，檸糠酐處理后轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗衔?，使其形成堿金屬鹽，轉(zhuǎn)移至水溶液內(nèi)分離，再用有機溶劑提取維生素D2，制成3，5-二硝基苯甲酸酯，反復(fù)結(jié)晶，皂化后用丙酮使維生素D2再結(jié)晶，即可得到維生素D2成品，其生產(chǎn)工藝中的主要副產(chǎn)物是速甾醇，它經(jīng)光照射可轉(zhuǎn)化為光甾醇。 1.2 我國維生素D2生產(chǎn)工藝研究的新進(jìn)展目前，中國的維生素D2生產(chǎn)水平低，成本高，得率只有2022，與發(fā)達(dá)國家生產(chǎn)水平（得率30-33%）相差很大，因此提高麥角固醇的發(fā)酵水平，已成為中國維生素D2發(fā)展的迫切要求。合成VD2的原料麥角固醇，主要來自酵母發(fā)酵、從生產(chǎn)青霉素等藥物的廢菌絲或植物油、香菇等產(chǎn)品中提取。最近，我們得知，我國南方有從糖蜜提取麥角固醇，價格可接受，來源充足，我們檢測的結(jié)果表明質(zhì)量合格。1.3 本研究所采用的生產(chǎn)工藝流程麥角固醇（或麥角甾醇）是生產(chǎn)維生素D2、激素黃體酮、可的松的原料。本研究所用的麥角固醇的來源是從酵母菌中提取。生產(chǎn)工藝大體為：高產(chǎn)量的麥角固醇酵母菌種種子培養(yǎng)擴大培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵高產(chǎn)酵母、高產(chǎn)麥角固醇麥角固醇酵母菌壓濾或離心干燥經(jīng)光化學(xué)方法維生素D2。1.3.1 菌種篩選本研究通過酵母菌發(fā)酵來生產(chǎn)麥角固醇，然后通過光化學(xué)方法轉(zhuǎn)化為維生素D2。選育高產(chǎn)麥角固醇的菌種是VD2生產(chǎn)的第一步，也是最重要的一步。Eugene選育生產(chǎn)麥角固醇的酵母菌，麥角固醇產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞干重的2%3%2。Savard3采用青霉菌生產(chǎn)麥角固醇，產(chǎn)量達(dá)細(xì)胞干重的1.8%。國內(nèi)在麥角固醇產(chǎn)生菌的自然篩選上，也開展了積極的研究。莫湘筠等4測定了33株酵母菌的麥角固醇含量，其中2株釀酒酵母的麥角固醇含量分別高達(dá)4.33%和3.3%。張博潤等人5分析了231株不同種、屬酵母菌的麥角固醇含量，發(fā)現(xiàn)不同種屬之間差異很大，最高可達(dá)細(xì)胞干重的3%，最低的只有0.7%。自然選育是一種簡單易行的選育方法，但是它的缺點是效率低、進(jìn)展慢。因此，把自然選育和誘變育種（紫外線、EMS復(fù)合誘變等），雜交育種，原生質(zhì)體融合等其他育種方法結(jié)合使用，可以收到較好效果。1.3.2 改善發(fā)酵工藝控制微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，還要賦予它合適的環(huán)境條件才能使它的生產(chǎn)能力充分表達(dá)出來。因此優(yōu)化發(fā)酵條件，控制發(fā)酵工藝是進(jìn)一步提高麥角固醇產(chǎn)量的重要手段。通過實驗來綜合研究碳源、氮源、無機鹽、通氣條件、初始pH值、溫度等條件對麥角固醇產(chǎn)量的影響，并對這些因素進(jìn)行優(yōu)化組合，找出麥角固醇產(chǎn)量最高時的發(fā)酵條件。1.3.3 光化學(xué)合成維生素D2麥角固醇紫外光轉(zhuǎn)化過程中主要產(chǎn)物的相互關(guān)系見圖2。注：Ergosterol為麥角固醇，Tachysterol為速固醇，Pre- ergocalciferol為VD2前體，Lumisterol為光固醇。傳統(tǒng)的光化學(xué)反應(yīng)生產(chǎn)工藝，是利用多個低功率汞燈進(jìn)行長時間連續(xù)光照，在這樣的光化學(xué)反應(yīng)條件下會有大量副產(chǎn)物生成，限制了VD2的收率，并給產(chǎn)品的提純帶來極大難度，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此，國內(nèi)原有的幾家VD2生產(chǎn)企業(yè)被迫停產(chǎn)。有鑒于此，在本項目中我們提出了一條生產(chǎn)VD 2的新工藝路線。我們以麥角固醇為起始原料，分離鑒定了所有光化學(xué)反應(yīng)的主要產(chǎn)物并測定了它們的克分子消光系數(shù)，建立了指導(dǎo)生產(chǎn)的檢測方法；仔細(xì)進(jìn)行了光化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)分析，確定了最佳反應(yīng)條件，包括反應(yīng)用的光源、反應(yīng)器、溶劑、濃度以及合適的反應(yīng)時間。光化學(xué)反應(yīng)結(jié)束后，很方便地將光化學(xué)反應(yīng)混合物與麥角固醇分開。麥角固醇可再用；光化學(xué)反應(yīng)混合物熱異構(gòu)化反應(yīng)后直接制備結(jié)晶，整個過程無需柱層析，生產(chǎn)路線大大縮短。在VD2結(jié)晶過程中，我們的工藝盡量從環(huán)境友好考慮，避開了慣用的毒性和氣味較大的溶劑。1.4 市場需求VD2不僅是維持人類健康和家畜正常生長、繁殖的重要維生素，而且是一些貴重藥物的中間體，在國內(nèi)外均有廣闊的市場。中國每年食用、藥用維生素D2的年需求量可達(dá)到100噸，再加上飼料業(yè)對VD2 的需求，中國的VD2年需求量可達(dá)到200噸，而年產(chǎn)量遠(yuǎn)達(dá)不到要求。國際上，生產(chǎn)VD2的企業(yè)主要有巴斯夫公司、羅氏公司、日清化學(xué)公司等主要供應(yīng)歐洲和日本市場。在國內(nèi)，目前生產(chǎn)VD2的廠家主要有廣州第三制藥廠、江西贛南制藥廠、四川省內(nèi)江匯鑫實業(yè)總公司、山東東辰集團(tuán)、上海第六制藥廠和東北制藥總廠。1.5 生產(chǎn)成本估算光化學(xué)生產(chǎn)VD2新工藝的成本估算如下：（1）原材料成本：每生產(chǎn)1公斤結(jié)晶VD2的費用：原材料 消耗量(公斤) 原材料價格(元/公斤) 原材料成本(元)麥角固醇 3.3 2500 8250乙醇 50 4 200石油醚 100 4 400乙酸乙酯 80 5 400總計 9250在國內(nèi)現(xiàn)在每公斤VD2的市場價格為1600017000元，而其成本為9250元，收益可觀，因此該工藝路線在經(jīng)濟上是可行的。（2）以建設(shè)一個年產(chǎn)3噸VD2的企業(yè)需投資：進(jìn)口光化學(xué)反應(yīng)裝置： 150萬元光化學(xué)生產(chǎn)、后處理與精烘包廠房： 150萬元反應(yīng)釜、附屬設(shè)備與安裝費等： 300萬元總經(jīng)費： 600萬元（3）以建設(shè)一個年產(chǎn)3噸VD2的企業(yè)的其它消耗：項目名稱 年消耗（元） 每公斤VD2消耗（元）人工費 180,000 60（15人，1000元/月）設(shè)備折舊費 533333 178(總投資800萬元，按15年折舊)電消耗 384000 128（按1920元/天，年工作日200天）設(shè)備維修費 40000 13(總投資的5%)總計 379綜上，生產(chǎn)每公斤VD2的總成本為9250元+379元=9629元1.6 投資效益分析目前，國產(chǎn)VD2每公斤售價約為16000元。因關(guān)稅等因素，進(jìn)口VD2每公斤售價約為4800美元。以建設(shè)一個年產(chǎn)為3噸VD2的企業(yè)計，需要固定資產(chǎn)投資800萬元（包括廠房和設(shè)備等），需要流動資金投入650萬元/年，年銷售收入4800萬元，減去總成本，可實現(xiàn)銷售毛利3381.3萬元/年，扣除銷售稅金（17%）、教育附加（0.45%）、城市建設(shè)維護(hù)費（0.79%）、社會事業(yè)發(fā)展費（0.2%），稅前利潤為2757.8萬元，因高新技術(shù)企業(yè)享受2減3免的稅收優(yōu)惠，因此該企業(yè)當(dāng)年即可收回投資。參考文獻(xiàn)1 張博潤,蔡金科. 麥角固醇高產(chǎn)菌株的選育. 微生物學(xué)通報,1993 ,20 (6) :3353382 陳思蕓,蕭