2009CB941500-植物重要器官形成的遺傳和表觀遺傳調(diào)控機理研究.doc

項目名稱：植物重要器官形成的遺傳和表觀遺傳調(diào)控機理研究首席科學(xué)家：曹曉風 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所起止年限：2009.1至2013.8依托部門：教育部 中國科學(xué)院一、研究內(nèi)容作為植物發(fā)育生物學(xué)中的最重要領(lǐng)域，植物器官形成的研究已成為植物科學(xué)中的重要前沿和新的增長點。本項目瞄準這一科學(xué)前沿，以保證我國糧食安全的重大需求為導(dǎo)向，采用分子遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等多學(xué)科綜合研究手段，解析高等植物重要器官形成和大小決定的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機制和網(wǎng)絡(luò)，重點闡明器官形成過程中形態(tài)建成關(guān)鍵因子的作用機理和信號網(wǎng)絡(luò)。針對要解決的科學(xué)問題，我們將從植物器官特征決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、植物重要器官形態(tài)建成的調(diào)控機制和模型以及重要植物器官大小控制的分子基礎(chǔ)三個方面系統(tǒng)研究器官形態(tài)建成的分子機制，為實現(xiàn)對植物生長發(fā)育調(diào)控的遺傳改良提供理論依據(jù)。其中，這三個課題之間具有內(nèi)在的聯(lián)系，花器官決定是花器官發(fā)育的前提，而兩者均對器官和種子的大小有一定的影響。1、植物器官特征決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)植物器官特征決定受一些關(guān)鍵基因控制，這些基因受到轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后等多種水平精細調(diào)節(jié)?；ㄆ鞴贈Q定是植物從營養(yǎng)生長向生殖發(fā)育轉(zhuǎn)變的重要發(fā)育過程，并產(chǎn)生花器官。長期以來調(diào)控植物開花的分子機制一直是植物發(fā)育生物學(xué)研究的熱點。植物開花時間不僅影響作物的穗數(shù)和粒數(shù)，還影響生長周期和環(huán)境適應(yīng)性等，是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。赤霉素和自主途徑因子是植物自身發(fā)育進程調(diào)控開花的關(guān)鍵因素，但是對赤霉素如何啟動植物開花的了解卻非常有限，而表觀遺傳調(diào)控因子在哪些通路、通過哪些靶位點調(diào)控開花關(guān)鍵基因還不清楚。赤霉素和自主途徑因子如何接受環(huán)境信號通過植物自身發(fā)育進程來協(xié)調(diào)開花調(diào)控的目前還知之甚少。本項目將從花器官決定入手，綜合利用遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、蛋白組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)等手段，通過鑒定參與赤霉素和自主途徑的遺傳和表觀遺傳調(diào)控因子、解析這些遺傳因子之間在各自的途徑和與其它途徑間相互作用的分子機制、研究表觀遺傳調(diào)控因子通過哪些靶位點調(diào)控各種遺傳因子，解析各種激素和環(huán)境因素如何參與調(diào)控植物器官特征決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們將開展以下三個方面的研究：1) 赤霉素調(diào)控植物開花的分子機制研究。揭示短日照條件下早花突變體的作用機理，初步建立赤霉素促進開花的遺傳途徑。赤霉素在植物開花調(diào)控中起著重要的作用，擬南芥赤霉素生物合成途徑缺失突變體ga1，在短日照條件下不能開花，在擬南芥ga1-3突變體的背景下，敲除赤霉素信號傳導(dǎo)重要元件DELLA蛋白，如：ga1-3 gai-t6 rga-t2 三缺失突變體在短日照條件下可以正常開花，表明赤霉素可以通過依賴于DELLA蛋白的GA信號傳導(dǎo)途徑參與擬南芥短日照開花的調(diào)控?；瘜W(xué)抑制劑Paclobutrazol（PAC）處理植物能夠阻遏赤霉素合成。spy是在含PAC培養(yǎng)基上篩選出的擬南芥突變體。rga spy gal-3三突變體表型分析表明SPY能夠增強DELLA蛋白的作用。spy編碼的SPINDY蛋白與動物的O連的N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc）高度同源，同野生型相比，敲除SPINDY，植物開花的關(guān)鍵調(diào)控因子，如：CO，SOC1和FT等基因轉(zhuǎn)錄水平都提高。表明赤霉素還可以通過依賴于SPINDY蛋白途徑參與擬南芥短日照開花的調(diào)控。赤霉素是通過哪些重要因子和途徑啟動植物開花的？赤霉素與自主通路因子是如何接受環(huán)境信號，并通過植物自身發(fā)育進程來協(xié)調(diào)開花調(diào)控的？SPINDY是否是整合赤霉素和光信號（光周期和節(jié)律）網(wǎng)路調(diào)控植物由營養(yǎng)生長到生殖發(fā)育轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵節(jié)點也有待進一步深入探討。本項目將重點鑒定SPINDY參與的開花調(diào)控的遺傳途徑中的新成員，并通過這些新成員的互作蛋白研究它們對植物花器官決定的作用機制以及赤霉素與植物環(huán)境信號互作調(diào)控花器官分化的機理。具體內(nèi)容包括：(1) 利用pSPY:SPY-GFP的擬南芥轉(zhuǎn)基因材料，通過EMS化學(xué)誘變和遺傳篩選，獲得Paclobutrazol抗性并抑制ga1-t表型的早花pef 突變體和抑制spy3表型的晚花ros突變體。比較ga1-t ros，ga1-t和ga1-t pef突變體間開花時間及開花相關(guān)基因的表達差異，進而推測ROS和PEF在調(diào)控開花機制中的可能功能。(2) ROS和PEF基因克隆，分析基因表達模式和抗體制備。分析ROS和PEF對SPINDY或者DELLA蛋白功能的影響。(3) 通過酵母雜交和免疫共沉淀分析可能與DELLA蛋白質(zhì)相互作用的蛋白DIP（或基因），深入探討DIF在植物開花調(diào)控中的功能，重點分析這些新成分在控制植物開花中的功能，揭示赤霉素調(diào)控植物開花的分子機制。2) 蛋白質(zhì)復(fù)合體對開花關(guān)鍵基因表達調(diào)控的分子機制研究。鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合體組分，重點闡述蛋白質(zhì)復(fù)合體對開花關(guān)鍵基因表達調(diào)控的分子機制。 前期研究已經(jīng)表明SPINDY基因可以調(diào)控CO基因的表達。進一步的CHIP實驗分析表明CO位點染色質(zhì)區(qū)域被修飾，而且這種修飾與SPINDY蛋白相關(guān)。酵母雙雜交的研究結(jié)果也表明SPINDY蛋白可與GI蛋白質(zhì)相互作用，那么是否SPINDY蛋白通過影響開花關(guān)鍵基因的染色質(zhì)區(qū)域修飾相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合體形成或組成，進而調(diào)控植物由營養(yǎng)生長到生殖發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄？擬南芥PICKLE（PKL）基因可能編碼一種CHD3染色質(zhì)重塑因子，該基因突變具有晚花表型，而PKL如何通過蛋白質(zhì)互作、或者通過染色質(zhì)水平調(diào)控重要開花基因的啟動子來影響其中某個位點的組蛋白的修飾，需要進一步的實驗證據(jù)。在這里我們將重點鑒定SPINDY和PICKLE的互作蛋白及蛋白復(fù)合體，并研究它們是否通過影響蛋白修飾或者染色質(zhì)重塑在染色質(zhì)層面調(diào)控開花的分子機理。具體內(nèi)容包括：(1) 通過GI-TAP和SPY-TAP轉(zhuǎn)基因材料，利用生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析手段，鑒定SPINDY蛋白質(zhì)復(fù)合體新組分。(2) 分析T-DNA插入突變體表型，明確SPINDY蛋白對蛋白質(zhì)復(fù)合體形成以及蛋白質(zhì)復(fù)合體形成對關(guān)鍵開花基因染色質(zhì)修飾的影響，揭示這些新組分對關(guān)鍵開花基因表觀遺傳調(diào)控的分子機制。(3) 通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀和酵母雙雜交分析，分析PICKLE的互作蛋白及蛋白復(fù)合體；并將pkl與hac1突變體進行比較，利用ChIP方法分析PKL結(jié)合于開花調(diào)控因子啟動子區(qū)域的染色質(zhì)狀態(tài)，探討PKL與HAC1、FLC和LFY在功能上的關(guān)系。3) 蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控植物開花過程的表觀遺傳信號網(wǎng)絡(luò)研究。解析多種組蛋白翻譯后修飾調(diào)控植物開花的遺傳和表觀遺傳機理，闡明自主通路感應(yīng)自身發(fā)育進程的信號促進植物開花的機理。蛋白質(zhì)翻譯后需要進一步修飾方能行使其生物學(xué)功能（包括蛋白質(zhì)的甲基化、乙?；⑻腔?、磷酸化以及泛素化等），這些修飾影響著幾乎所有的生命過程，研究表明開花發(fā)育不僅受遺傳調(diào)控，在表觀遺傳學(xué)水平上也受到更為精細的調(diào)控。其中，擬南芥中蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT4a/b等)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶AtHAC1都參與了FLC介導(dǎo)的開花調(diào)控過程，但是精氨酸甲基化如何在不同組織、不同發(fā)育階段以及在不同條件下的特異底物仍然是個未知數(shù)，這些甲基化信號是如何被讀取和傳導(dǎo)的？甲基化和乙酰化修飾之間的相互作用關(guān)系是什么？AtPRMT10蛋白是以二聚體形式存在，能自身甲基化，該蛋白質(zhì)自身翻譯后修飾是如何被調(diào)節(jié)的？它們又是通過哪些靶基因調(diào)控擬南芥開花過程的？對上述問題的回答將解析多種組蛋白翻譯后修飾調(diào)控植物開花的遺傳和表觀遺傳機理，闡明自主通路感應(yīng)自身發(fā)育進程的信號促進植物開花的機理。本項目將重點鑒定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白復(fù)合體，了解它們是通過修飾哪些因子、通過何種分子機理調(diào)控擬南芥開花的。具體內(nèi)容包括：(1) 在基因組水平上，利用Solexa大規(guī)模測序技術(shù)，比較野生型Col和atprmt5突變體基因的表達模式，重點分析mRNA可變剪切的變化及其對開花的調(diào)控機理。(2) 構(gòu)建atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b突變體之間的雙、三突變體和與athac1等自主通路突變體之間的多突變體，研究這些基因與擬南芥開花自主通路突變體的遺傳關(guān)系。(3) 通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀和酵母雙雜交分析，鑒定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白復(fù)合體，在體內(nèi)外驗證這些互作蛋白參與調(diào)控擬南芥開花的遺傳網(wǎng)絡(luò)。利用定點突變技術(shù)，鑒定參與AtPRMT10蛋白二聚體形成和自身甲基化位點，利用遺傳學(xué)手段研究AtPRMT10自身翻譯后修飾調(diào)控開花的機理。(4) 利用親和層析，尋找能夠特異識別對稱性和非對稱性雙甲基化的精氨酸殘基的蛋白，闡明這些甲基化信號是如何被讀取和傳導(dǎo)以調(diào)節(jié)擬南芥開花的。(5) 結(jié)合蛋白雙向電泳和精氨酸甲基化特異性抗體等分析手段，比較野生型Col和atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b單突變體及其雙、三突變體蛋白質(zhì)甲基化譜式的改變，通過質(zhì)譜分析出蛋白，進一步在體內(nèi)、外驗證該蛋白是哪種AtPRMT的特異性底物，并通過遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等手段，研究這些蛋白調(diào)控擬南芥開花的分子機理。(6) 利用反向遺傳學(xué)手段，分離鑒定參與開花調(diào)控的新的表觀調(diào)控因子，揭示這些因子調(diào)控植物開花過程的信號網(wǎng)絡(luò)。2、植物重要器官形態(tài)建成的調(diào)控機制和模型高等植物的器官發(fā)生和形態(tài)建成是一個連續(xù)、不間斷的生物學(xué)過程，隨著發(fā)育進程的展開，逐步在細胞、組織和器官等不同的發(fā)育層面上完成。花是植物體最重要和復(fù)雜的器官，在花器官原基起始以后的發(fā)育過程中，經(jīng)過一系列細胞分裂、功能分化和細胞生長，通過腹背、兩側(cè)、近遠三維軸向的建立，使花器官的不同區(qū)域被特化，形成完全發(fā)育的萼片、花瓣、雄蕊和心皮。在擬南芥中四種花器官（特別是雄配子體的發(fā)育）的出現(xiàn)不僅被各種器官特征轉(zhuǎn)錄因子所精確控制，而且受到miRNA和組蛋白修飾在轉(zhuǎn)錄后和染色質(zhì)水平上的調(diào)控。以水稻為代表的單子葉器官形態(tài)建成與擬南芥有很大差異，而水稻中內(nèi)稃、外稃和漿片等擬南芥不具有的器官是如何產(chǎn)生的、細胞程序化死亡如何參與調(diào)控雄性生殖器官發(fā)育等問題一直是植物進化發(fā)育生物學(xué)中的重要科學(xué)問題。本課題重點研究植物器官形態(tài)建成的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析水稻內(nèi)稃、外稃和漿片等禾本科特有器官（相對于擬南芥）產(chǎn)生的遺傳和表觀遺傳機制，闡明調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索雄配子發(fā)育的分子基礎(chǔ)特別是糖、激素和程序化細胞死亡等信號等對雄配子形成的作用機制。1) 解析單子葉植物花器官形態(tài)建成的遺傳和表觀機制，提出發(fā)育模型。雖然人們在擬南芥器官形態(tài)形成研究方面取得了很大進展，但基于擬南芥和金魚草等雙子葉植物研究所得出的模型并不完全適用于單子葉植物，因為單、雙子葉植物早在1.21.8億年前就分別進化，單子葉植物花器官形態(tài)特征明顯不同于雙子葉植物。水稻是典型的單子葉禾本科植物，水稻花序由小穗組成，小穗由小花和兩個穎片組成，小花從外到內(nèi)依次由外稃、內(nèi)稃、2個漿片、6個雄蕊和1個雌蕊組成，具有與雙子葉植物相似的雄蕊和雌蕊生殖器官，但沒有明顯的花萼和花瓣結(jié)構(gòu)，取代它們的是外稃、內(nèi)稃和漿片。水稻的外稃和內(nèi)稃共同包裹著水稻種子，其發(fā)育的形態(tài)，不僅直接影響著水稻產(chǎn)量，還與水稻的品質(zhì)相關(guān)。目前對外稃和內(nèi)稃的發(fā)育進化和調(diào)控機理的相關(guān)研究還非常有限。因此，對其進行深入研究不僅具有理論價值，還具有應(yīng)用前景。從理論上，現(xiàn)有雙子葉植物花發(fā)育的ABC模型在單子葉水稻上存在一定差異。首先，進化樹分析表明水稻中存在4個擬南芥AP1亞群的成員，目前尚沒有充足的實驗數(shù)據(jù)確定水稻中是否真正存在和雙子葉植物中類似的A類基因；其次，由于基因復(fù)制事件的發(fā)生為水稻中MADS-box基因功能的分化提供了更多的可能。除了遺傳學(xué)研究以外，水稻花器官在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制方面的研究也開始起步，我們發(fā)現(xiàn)DCL4同源基因突變后導(dǎo)致葉片、外稃等側(cè)生器官腹背軸極性的喪失，最明顯的表型是外稃發(fā)育不全或者外稃異化為稻芒等異常的器官，具有雄性不育的表型。雖然近幾年來水稻花器官方面的研究取得了較大的進展。但還有不少問題仍有待回答。水稻花器官與雙子葉模式植物最大的差異在外部器官。首先，漿片已經(jīng)被認為是花瓣的同源物，內(nèi)外稃是否為花萼的同源物？內(nèi)稃與外稃是同一種器官還是不同的器官？水稻的穎片是一朵退化的花還是一朵花的有機組成部分？擬南芥與水稻的花發(fā)育“ABC”模型有一定的相似之處，在這個模型中，所涉及的都是轉(zhuǎn)錄因子，缺乏下游的受調(diào)控基因。而不同花器官的形態(tài)建成都涉及到細胞的分裂分化。因此，如何解釋這些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生突變影響到細胞分裂分化的命運也即揭示完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要更系統(tǒng)、深入的利用分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、表觀遺傳組學(xué)等手段來闡明各個轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的關(guān)系以及它們的下游靶基因。本課題根據(jù)我們的工作基礎(chǔ)，將重點開展控制水稻花器官的重要調(diào)控因子對植物花器官形成的遺傳和表觀遺傳機制，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和模型。具體內(nèi)容包括：(1) 以水稻osmads1, osmads13、oseg1和osrep1等外稃、內(nèi)稃、穎片和心皮發(fā)育異常的突變體為材料深入研究關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如MADS-box參與水稻等花器官形態(tài)建成的遺傳控制機理；(2) 利用花器官發(fā)育異常的突變體構(gòu)建一些重要雙突變體，如fon4#osmads1，fon4#osmads3，osmads3#osmads13，osmads3#osmads21等，深入研究這些基因的功能和相互關(guān)系，將水稻花器官發(fā)育的關(guān)鍵基因和擬南芥“ABC”模型進行比較，提出單子葉植物水稻花器官的發(fā)育模型；(3) 以osdcl4為研究對象，深入研究小分子RNA參與外稃發(fā)育的表觀遺傳機制； (4) 利用大規(guī)模小分子RNA測序技術(shù)，通過比較野生型和osdcl4不同組織的小分子RNA的組成，鑒定osdcl4調(diào)控的小分子RNA及其作用的靶位點，研究這些因子在水稻外稃、內(nèi)稃發(fā)育中的作用；(5) 通過和雙子葉植物的比較研究，從進化發(fā)育生物學(xué)角度解析單子葉植物花器官形成的分子機制，提出相關(guān)模型。2) 解析植物雄蕊發(fā)育遺傳和表觀遺傳機制。雄蕊發(fā)育主要來自L2層的孢原細胞(ACS)進行幾次平周分裂, 形成初生壁細胞(PPC)和初生造孢細胞(PSC)。初生造孢細胞進行幾次有絲分裂發(fā)育為小孢子母細胞(PMC)，初生壁細胞則進行兩次平周分裂形成內(nèi)皮層、中層和絨氈層。MSP1（MULTIPLE SPOROCYTE1）是水稻中克隆到的第一個控制著早期造孢細胞發(fā)育的基因，它編碼一個與擬南芥中EMS1/EXS功能相似的富含亮氨酸的受體蛋白激酶。msp1 突變體可產(chǎn)生過多的雌雄孢子母細胞，花藥壁細胞混亂，絨氈層缺失。最終小孢子母細胞的發(fā)育停留在減數(shù)分裂,而大孢子母細胞的發(fā)育不受影響，造成完全雄性不育。此外擬南芥TAPETAL DETERMINANT1 (TPD1)基因編碼一個小分泌蛋白，也具有相似的功能。TPD1和EMS1可以直接結(jié)合，水稻中TPD1的同源蛋白OsTDL1A可以和MSP1直接結(jié)合。最近，兩個高度相似的擬南芥富含亮氨酸的受體蛋白激酶，SERK1 和SERK2被證明是絨氈層形成所必需，且其作用途徑與EMS1/EXS和MSP1相似。他們可能分別在雙子葉植物和單子葉植物中在促進從前體細胞到絨氈層的分化過程中行使重要的功能。在花藥絨氈層發(fā)育中起作用的關(guān)鍵基因還有DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 (DYT1)、Tapetum Degeneration Retardation（TDR)、Undeveloped Tapetum1 (Udt1)、MS1、ABORTED MICROSPORES (AMS)、AtMYB103等。DYT1、TDR、AMS和UDT1基因可以編碼bHLH類型轉(zhuǎn)錄因子，這些基因主要在絨氈層表達，對于絨氈層細胞分化以及花粉發(fā)育十分重要，基因突變后可導(dǎo)致完全雄性不育。花粉發(fā)育過程中，絨氈層早期包圍著花粉囊，到花粉發(fā)育晚期，絨氈層經(jīng)過一種細胞程序化死亡(Programmed cell death, PCD)過程開始降解，為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)。研究證明了TDR可以正調(diào)控控制絨氈層細胞PCD，該基因突變后，tdr的絨氈層和中層不能及時降解，PCD大大延遲，小孢子釋放后迅速降解，由此導(dǎo)致完全的雄性不育。然后DYT1、TDR、Udt1、MS1、AMS、AtMYB103等這些基因在花藥發(fā)育過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。減數(shù)分裂是由一系列基因在時空上按照極為精確的順序,最終完成從二倍性體細胞到單倍性性細胞的轉(zhuǎn)變過程。在這中間任何一個基因發(fā)生突變都有可能影響正常配子的形成,最終在不同程度上影響減數(shù)分裂產(chǎn)物的染色體數(shù)目、倍性及育性。目前擬南芥和水稻中克隆到的參與孢子母細胞減數(shù)分裂過程的基因主要有AtPRD1、AtSPO11-1、Atmus81、RAD51C、MER3、DMC1、PAIR2、PAIR1、MEIOSIS ARRESTED AT LEPTOTENE1 (MEL1)、OsRAD21-3、OsRad21-4等。表觀遺傳控制方面，mel1突變體在減數(shù)分裂早期染色體的濃縮和大小發(fā)生異常，花粉母細胞的染色體中心粒位置的組蛋白H3K9甲基化發(fā)生異常改變，不能形成雄性生殖細胞；同時雌性生殖細胞也不能正常形成，說明在水稻中存在生殖細胞特異性的表觀遺傳控制機制。目前的研究僅僅是對水稻減數(shù)分裂過程分子生物學(xué)研究的開端，這一復(fù)雜的過程還有待于人們的進一步研究。植物正常授粉還需要花藥適時開裂和合適的花絲長度，花粉才能在成熟后適時釋放出來進行授粉,所以花藥開裂是花藥發(fā)育后期的一個重要特征?；ㄋ庨_裂涉及到花藥壁各層細胞的變化以及細胞內(nèi)的許多生理生化反應(yīng)，Sander等認為擬南芥花藥的開裂從中層以及絨氈層的降解開始；然后，藥室內(nèi)壁細胞膨大、藥室內(nèi)壁以及連接層細胞上發(fā)生纖維狀帶的沉積；后期位于藥室間的隔膜層降解產(chǎn)生了一個雙藥室的花藥；最后，連接兩個藥室的裂縫細胞降解，使花藥開裂。目前在其它物種中已經(jīng)分離到幾個與花藥開裂有關(guān)的基因。例如擬南芥的ms35 、nondehiscent1、delayed dehiscence1（dde1）/opr3表現(xiàn)為裂縫層stomium）細胞的降解延遲，使得花藥未適時開裂,此外還有COI1、DAD1等都影響了花藥的開裂。除了運用遺傳學(xué)方法尋找控制雄蕊發(fā)育基因的研究之外，近年人們還利用基因芯片技術(shù)在基因組層面上開展雄蕊發(fā)育過程中基因表達譜變化的分析，為認識雄蕊發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)開辟了一條新的途徑?？傊参镄廴锇l(fā)育的過程是一個復(fù)雜的過程，雖然在近年來發(fā)現(xiàn)了一些參與控制這一過程的基因，但還有許多遺傳和表觀遺傳機制有待于發(fā)現(xiàn)和理解,特別是表觀遺傳記憶如何通過配子體傳遞給下一代，重編程過程是在何種調(diào)控水平上進行的？哪些基因控制這些過程等都是需要回答的重要生物學(xué)問題。本課題根據(jù)我們的工作基礎(chǔ)，將重點開展控制擬南芥和水稻雄蕊形成的重要調(diào)控因子研究，闡述雄蕊形態(tài)建成以及小孢子發(fā)生的遺傳和表觀遺傳機制，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和模型。具體內(nèi)容包括：(1) 以擬南芥dmg1、dmg2和dmg3等雄蕊有絲分裂異常突變體為材料深入研究雄配子體發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子及其相互作用蛋白，并揭示其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用PCD in male gametogenesis (pig)類突變體系統(tǒng)鑒定雄配子PCD的PIG基因，研究其功能。(2) 利用正向和反向遺傳學(xué)手段分離控制擬南芥和水稻雄性生殖細胞分化和花粉發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AMS、TDR、UDT1、PMD等在減數(shù)分裂、細胞程序性死亡等重要生物學(xué)過程的控制機理；其中AMS、TDR和UDT1為bHLH類型轉(zhuǎn)錄因子，PMD為Myb類型轉(zhuǎn)錄因子，利用基因組學(xué)等手段深入研究這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控靶基因，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3) 基因組水平解析植物花器官和雄蕊發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和模型。已有的植物器官形態(tài)建成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和模型的研究，主要根據(jù)遺傳學(xué)等手段闡明基因之間的相互關(guān)系和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，然而這些手段存在通量較低，只能在單個或者幾個基因或者因子水平上開展研究，隨著最新Solexa等測序技術(shù)的發(fā)展對于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供新的手段，因此，本項目將：(1) 用基因芯片和CHIP-sequencing等技術(shù)在基因組水平上研究控制植物花器官形態(tài)建成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的靶標基因，揭示其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括：OsMADS3、OsMADS6、OsMADS7、OsMADS58等抗體為中心的染色質(zhì)免疫共沉淀全基因組芯片分析。(2) 用基因芯片和CHIP-sequencing等技術(shù)在基因組水平上研究控制植物雄蕊形態(tài)建成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的靶標基因，揭示其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括：TDR、PMD、AMS等抗體為中心的染色質(zhì)免疫共沉淀全基因組測序和芯片分析，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3、重要植物器官大小控制的分子基礎(chǔ)植物器官大小控制的分子基礎(chǔ)是植物發(fā)育生物學(xué)中最為重要的課題之一，對植物器官大小控制機理深入研究已經(jīng)成為植物科學(xué)領(lǐng)域中重要的前沿和新的增長點。本課題正是面對這一國際前沿領(lǐng)域，利用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)和生物化學(xué)、分子細胞生物學(xué)等為主要手段，利用模式植物豐富的突變體和完善的基因組學(xué)平臺，圍繞植物器官大小控制的分子機制這一關(guān)鍵的科學(xué)問題展開，旨在解析植物器官大小控制中的細胞學(xué)基礎(chǔ)、器官多少與大小之間的相互關(guān)系及分子基礎(chǔ)、對器官大小以及多少的分子調(diào)控機制和網(wǎng)絡(luò)以及對內(nèi)、外源發(fā)育信號響應(yīng)的遺傳和表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。針對關(guān)鍵的科學(xué)問題，本項目將從細胞學(xué)變化和基因調(diào)控的層面入手，我們將開展以下三個方面的研究； 1） 解析植物種子器官大小控制的分子機制。揭示內(nèi)源生長信號、環(huán)境信號等調(diào)節(jié)細胞分裂和細胞生長從而調(diào)控種子發(fā)育和大小的作用機制。在植物種子器官大小的發(fā)育和控制的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要的基因具有顯著的作用，例如AP2、ARF2和ANT；但是這些基因控制種子器官大小的同時還會影響植物的育性。分離鑒定正常育性的大種子突變體不僅可以幫助理解種子大小控制的分子機理，而且具有重要應(yīng)用價值。在這里我們擬在模式植物擬南芥中首次分離鑒定了正常育性的大種子突變體da1的基礎(chǔ)上，重點分離鑒定da1的增強子和da1的抑制子，并通過鑒定與DA1相互作用的蛋白及其功能，鑒定DA1調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)和DA1途徑中的新成員，闡明DA1在控制種子和器官大小方面的分子機理。具體內(nèi)容包括：(1)通過EMS誘變，篩選獲得da1的增強子和抑制子；分離da1增強子或抑制子基因，建立da1、增強子或抑制子突變體之間的遺傳及基因間關(guān)系；(2)獲得并鑒定DA1相互作用蛋白（DA1 interacting protein， DIP）并對其進行功能分析；希望可以鑒定出DA1的直接下游靶目標，從而進一步理解DA1作用的分子基礎(chǔ)；(3)鑒定出da1-1突變體中差異表達的基因，研究這些基因在調(diào)控種子和器官大小方面的功能，并建立DA1調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)；(4)比較不同生態(tài)型間種子和器官的大小，測序不同生態(tài)型間DA1基因的自然變異，建立DA1基因的自然變異與種子和器官大小之間的關(guān)系，更好地理解DA1在控制種子和器官大小的功能；(5)通過基因芯片技術(shù)結(jié)合分子遺傳學(xué)和生化方法，探索植物激素油菜素內(nèi)酯對種子性狀、大小以及飽滿程度的影響，并通過對突變體種子大小的突變以及恢復(fù)突變，鑒定受激素調(diào)控的參與調(diào)控種子發(fā)育的關(guān)鍵基因。2） 解析地上器官葉和花大小控制的遺傳基礎(chǔ)。已經(jīng)有證據(jù)表明有些器官大小相關(guān)的突變體（例如，35S:ARGOS, 和bb）的種子大小正常，說明存在種子或器官特異的對大小進行調(diào)控的途徑；而bpe突變體主要影響花的大小，ppd突變體主要影響葉子和角果，說明不同器官間也存在特有的調(diào)控途徑。雖然arf2 突變體和異位表達ANT植株有減低的育性，但arf2 突變體和異位表達ANT植株的種子和器官（例如葉子）增大，說明一些大小調(diào)控途徑是種子和器官共有的。在前期鑒定ARGOS的基礎(chǔ)上，我們針對器官大小調(diào)節(jié)的共同途徑這一科學(xué)問題，擬利用遺傳學(xué)、生物化學(xué)和反向遺傳學(xué)的方法，進一步鑒定參與控制擬南芥地上器官葉和花大小的功能基因信號控制，解析激素和其它環(huán)境調(diào)控植物器官發(fā)育及大小的分子機制和信號途徑。具體內(nèi)容包括：（1） 控制器官大小途徑中組分的鑒定和研究。以器官的大小和細胞數(shù)目作為指標，篩選ARGOS的抑制子，鑒定ARGOS下游的信號分子和其它影響器官大小的功能基因，并研究其功能，解析葉和花器官大小控制的分子基礎(chǔ)。（2） 解析控制地上器官大小的信號途徑。研究器官大小控制中的重要功能基因和生長信號和環(huán)境信號的關(guān)系，揭示激素信號和其它環(huán)境信號生長素控制葉、花大小的細胞學(xué)機制分子。（3） 探索器官大小控制中的關(guān)鍵基因的應(yīng)用潛力。將對鑒定到的在擬南芥器官大小控制中起重要作用的基因，將通過轉(zhuǎn)基因的方法評估其在作物改良方面的應(yīng)用潛力。3） 研究植物重要器官大小、粗細和多少控制的分子基礎(chǔ)，探索植物器官在大小、形狀和數(shù)量之間補償機理。從突變體入手，我們擬重點研究模式植物擬南芥和水稻在營養(yǎng)生長過程中葉片器官的大小、形狀以及莖器官分枝的多少的控制機理，分離調(diào)控葉片大小、形狀和分枝數(shù)目的基因，探索它們之間補償關(guān)系的細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容包括：(1)分離鑒定控制葉片大小或/和形狀的擬南芥基因CUR2和CUR4的功能，鑒定與CUR2和CUR4相互作用的蛋白，闡明這些突變體的葉片大小和形狀控制的分子機理；(2)分離鑒定控制莖分枝增多的基因MCB1和莖粗發(fā)育控制基因DWT1的功能，闡明基因工作的分子基礎(chǔ)；(3)對本研究中克隆的一些重要的器官大小控制基因，研究和評價其在糧食和經(jīng)濟作物改良中的應(yīng)用潛力，為作物的改良提供基因資源。二、預(yù)期目標1、總體目標將利用擬南芥和水稻突變體材料和實驗操作體系，綜合遺傳學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、全基因組學(xué)和生物信息學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)研究手段和工具，研究高等植物重要器官發(fā)生、形態(tài)建成、器官大小的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機理，揭示植物生長發(fā)育與環(huán)境互作的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為產(chǎn)量性狀的分子設(shè)計提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。通過本項目的實施，預(yù)計將在以下幾個方面取得突破：(1) 闡明高等植物重要器官發(fā)生、形態(tài)建成和大小決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控機制和網(wǎng)絡(luò)，取得一批重大原始創(chuàng)新性科學(xué)成果。(2) 闡明植物開花、重要花器官形態(tài)建成和大小控制過程中關(guān)鍵因子的作用機理和信號網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘一批控制植物器官數(shù)目和大小的重要功能基因，為產(chǎn)量性狀的分子設(shè)計提供依據(jù)。(3) 通過項目的實施，培育和造就一批在國際上具有影響力、在國內(nèi)具有引領(lǐng)作用的優(yōu)秀中青年研究人才，進一步提升我國在植物發(fā)育生物學(xué)的研究水平，使我們在該領(lǐng)域的研究進入國際領(lǐng)先行列。2、五年預(yù)期目標在已有的工作基礎(chǔ)上，在植物器官特征決定、重要器官形態(tài)建成和器官大小控制的分子機理等方面取得突破性進展，使我國在植物器官發(fā)育的理論和應(yīng)用研究進入國際前沿水平，具體目標包括：(1) 揭示控制營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變、單雙子葉植物花器官進化與發(fā)育、種子葉等器官大小控制的關(guān)鍵遺傳和表觀遺傳因子及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立相關(guān)的新的理論和模型。(2) 分離鑒定植物器官特征決定、形態(tài)建成和大小控制的關(guān)鍵基因20-30個，建立相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)1-2個，揭示激素等信號參與控制植物器官形成的遺傳和表觀遺傳機制。(3) 在國際著名學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表有較大學(xué)術(shù)影響的論文，發(fā)表SCI論文30篇、累計影響因子達150以上。(4) 培養(yǎng)學(xué)術(shù)帶頭人2人以上，研究生3040人、博士后8人。三、研究方案實現(xiàn)項目五年預(yù)期目標的總體研究思路： 主要作物的產(chǎn)量是由單位面積有效穗、每穗粒數(shù)、千粒重三個基本要素決定的，而這三要素主要由開花時間、花器官發(fā)育和種子大小等器官形成相關(guān)的發(fā)育生物學(xué)因素決定的。因此，本項目將針對上述科學(xué)問題，從植物器官特征決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、植物重要器官形態(tài)建成的調(diào)控機制和模型以及重要植物器官大小控制的分子基礎(chǔ)三個方面系統(tǒng)研究器官形態(tài)建成的分子機制，為實現(xiàn)對植物生長發(fā)育調(diào)控的遺傳改良提供理論依據(jù)。其中，這三個課題之間具有內(nèi)在的聯(lián)系，花器官決定是花器官發(fā)育的前提，而兩者均對器官和種子的大小有一定的影響， 實現(xiàn)項目五年預(yù)期目標的技術(shù)路線：本項目以擬南芥和水稻為主要材料，利用遺傳學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)和全基因組學(xué)研究手段，重點采用突變體篩選和鑒定，分離和克隆控制突變體表型的關(guān)鍵基因并對克隆的基因進行功能驗證，利用細胞學(xué)和分子生物手段、突變體間的遺傳雜交分析研究功能基因間的相互作用關(guān)系；通過蛋白質(zhì)修飾和互作檢測技術(shù)以及DNA與蛋白質(zhì)互作全基因組分析技術(shù)研究蛋白與蛋白互作或者基因與蛋白互作，整合植物器官決定、形成和大小的遺傳與表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，初步闡明器官形態(tài)建成的分子機理，為實現(xiàn)對植物生長發(fā)育調(diào)控的遺傳改良提供理論依據(jù)。本項目實現(xiàn)預(yù)期目標的可行性：(1) 資源優(yōu)勢：水稻和擬南芥的基因組測序已完成，功能基因組和蛋白組學(xué)的平臺建設(shè)已逐步完善。擁有一大批與本項目有關(guān)的擬南芥和水稻器官發(fā)育相關(guān)的突變體，已克隆了一些重要的功能基因，項目實施過程中通過相互作用蛋白或者蛋白與基因的互作的高通量篩選，又可獲得大量新的有用材料，為項目的實施提供了保障。(2) 研究優(yōu)勢：植物器官形成及調(diào)控機制的研究已有一定的研究基礎(chǔ)。本項目的研究內(nèi)容是建立在已有的工作基礎(chǔ)之上，各個研究組已具備了較好的研究基礎(chǔ)和條件，在突變體篩選、ChIP分析、生化分析、顯微操作和免疫熒光定位技術(shù)等都是項目組有關(guān)成員多年來經(jīng)常采用的技術(shù)。相關(guān)的工作已有多篇論文在國際權(quán)威刊物上公開發(fā)表。所取得的成果已經(jīng)證明我們在該領(lǐng)域具有較強的國際競爭力，特別是目前研究團隊內(nèi)良好的學(xué)術(shù)氛圍，完全可以保證本項目的順利實施。(3) 人才優(yōu)勢：項目組主要成員有多年從事植物遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究經(jīng)驗，已在Nature、PNAS、Plant Cell、EMBO Reports和Plant Physiology等國際重要刊物上發(fā)表多篇相關(guān)的論文，這為深入開展植物重要器官形成的遺傳和表觀遺傳分子機理的研究奠定了良好的科學(xué)和人才基礎(chǔ)。同時本項目在已有優(yōu)勢人才的基礎(chǔ)上，圍繞關(guān)鍵科學(xué)目標進一步優(yōu)化了現(xiàn)有隊伍，建立起優(yōu)勢互補、聯(lián)合攻關(guān)的協(xié)作團隊。本項目的創(chuàng)新性和特色(1) 科學(xué)問題的前沿性：本項目以我國糧食安全重大需求為導(dǎo)向，瞄準國際科學(xué)前沿，凝練研究目標，集中開展重要農(nóng)藝性狀（產(chǎn)量）相關(guān)的分子基礎(chǔ)研究，揭示控制植物重要器官形成的調(diào)控機理，發(fā)掘鑒定一系列在植物重要器官發(fā)生、形態(tài)建成、器官大小控制過程中起關(guān)鍵作用的遺傳因子和非編碼RNA，建立遺傳與表觀遺傳相互作用調(diào)控植物重要器官發(fā)生和形態(tài)建成的理論和模型，闡明作物重要產(chǎn)量性狀決定的分子基礎(chǔ)。(2) 研究方法的先進性：綜合運用分子遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等多學(xué)科交叉研究方法，結(jié)合最新的小分子RNA、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶標基因的全基因組分析技術(shù)等，從基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白翻譯后調(diào)控三個層次對控制植物重要器官形態(tài)建成的遺傳與表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)開展系統(tǒng)性的研究。(3) 研究體系的獨特性：項目所涉及的研究材料(擬南芥和水稻等)，既有模式植物的有利特點，使研究技術(shù)和途徑易于實施、保證了研究的深度和水平，又與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)目標緊密結(jié)合，使研究結(jié)果產(chǎn)生直接的農(nóng)業(yè)效益。另外，發(fā)育生物學(xué)研究很大程度上依賴于重要研究價值的突變體材料的獲得，本項目的研究團隊已具備了大量工作積累，獲得了一批與植物器官形態(tài)建成相關(guān)的重要突變體，為進一步深入研究植物器官特征決定、形態(tài)建成、大小控制等奠定了堅實的工作基礎(chǔ)。課題設(shè)置課題1、植物器官特征決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)置思路：植物器官特征決定受一些關(guān)鍵基因控制，這些基因受到轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后等多種水平精細調(diào)節(jié)?；ㄆ鞴贈Q定是植物從營養(yǎng)生長向生殖發(fā)育轉(zhuǎn)變的重要發(fā)育過程，并產(chǎn)生花器官。長期以來調(diào)控植物開花的分子機制一直是植物發(fā)育生物學(xué)研究的熱點。赤霉素和自主途徑因子是植物自身發(fā)育進程調(diào)控開花的關(guān)鍵因素，但是對赤霉素如何啟動植物開花的了解卻非常有限，而表觀遺傳調(diào)控因子在哪些通路、通過哪些靶位點調(diào)控開花關(guān)鍵基因還不清楚。赤霉素和自主途徑因子如何接受環(huán)境信號通過植物自身發(fā)育進程來協(xié)調(diào)開花調(diào)控的目前還知之甚少。研究內(nèi)容：本課題將從花器官決定入手，通過鑒定參與赤霉素和自主途徑的遺傳和表觀遺傳調(diào)控因子、解析這些遺傳因子之間在各自的途徑和與其它途徑間相互作用的分子機制、研究表觀遺傳調(diào)控因子通過哪些靶位點調(diào)控各種遺傳因子，解析各種激素和環(huán)境因素如何參與調(diào)控植物器官特征決定的遺傳和表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們將開展以下三個方面的研究：1) 赤霉素調(diào)控植物開花的分子機制研究。揭示短日照條件下早花突變體的作用機理，初步建立赤霉素促進開花的遺傳途徑。具體內(nèi)容包括：(1) 利用pSPY:SPY-GFP的擬南芥轉(zhuǎn)基因材料，通過EMS化學(xué)誘變和遺傳篩選，獲得Paclobutrazol抗性并抑制ga1-t表型的早花pef 突變體和抑制spy3表型的晚花ros突變體。比較ga1-t ros，ga1-t和ga1-t pef突變體間開花時間及開花相關(guān)基因的表達差異，進而推測ROS和PEF在調(diào)控開花機制中的可能功能。(2) ROS和PEF基因克隆，分析基因表達模式和抗體制備。分析ROS和PEF對SPINDY或者DELLA蛋白功能的影響。(3) 通過酵母雜交和免疫共沉淀分析可能與ROS和PEF蛋白質(zhì)相互作用的蛋白（或基因），深入探討ROS和PEF在植物開花調(diào)控中的功能，重點分析這些新成分在控制植物開花中的功能，揭示赤霉素調(diào)控植物開花的分子機制。2) 蛋白質(zhì)復(fù)合體對開花關(guān)鍵基因表達調(diào)控的分子機制研究。鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合體組分，重點闡述蛋白質(zhì)復(fù)合體對開花關(guān)鍵基因表達調(diào)控的分子機制。具體內(nèi)容包括：(1) 通過GI-TAP和SPY-TAP轉(zhuǎn)基因材料，利用生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析手段，鑒定SPINDY蛋白質(zhì)復(fù)合體新組分。(2) 分析T-DNA插入突變體表型，明確SPINDY蛋白對蛋白質(zhì)復(fù)合體形成以及蛋白質(zhì)復(fù)合體形成對關(guān)鍵開花基因染色質(zhì)修飾的影響，揭示這些新組分對關(guān)鍵開花基因表觀遺傳調(diào)控的分子機制。(3) 通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀和酵母雙雜交分析，分析PICKLE的互作蛋白及蛋白復(fù)合體；并將pkl與hac1突變體進行比較，利用ChIP方法分析PKL結(jié)合于開花調(diào)控因子啟動子區(qū)域的染色質(zhì)狀態(tài)，探討PKL與HAC1、FLC和LFY在功能上的關(guān)系。3) 蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控植物開花過程的表觀遺傳信號網(wǎng)絡(luò)研究。解析多種組蛋白翻譯后修飾調(diào)控植物開花的遺傳和表觀遺傳機理，闡明自主通路感應(yīng)自身發(fā)育進程的信號促進植物開花的機理。具體內(nèi)容包括：(1) 在基因組水平上，利用Solexa大規(guī)模測序技術(shù)，比較野生型Col和atprmt5突變體基因的表達模式，重點分析mRNA可變剪切的變化及其對開花的調(diào)控機制。(2) 構(gòu)建atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b突變體之間的雙、三突變體和與athac1等自主通路突變體之間的多突變體，研究這些基因與擬南芥開花自主通路突變體的遺傳關(guān)系。(3) 通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀和酵母雙雜交分析，鑒定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白復(fù)合體，在體內(nèi)外驗證這些互作蛋白參與調(diào)控擬南芥開花的遺傳網(wǎng)絡(luò)。利用定點突變技術(shù)，鑒定參與AtPRMT10蛋白二聚體形成和自身甲基化位點，利用遺傳學(xué)手段研究AtPRMT10自身翻譯后修飾調(diào)控開花的機理。(4) 利用親和層析，尋找能夠特異識別對稱性和非對稱性雙甲基化的精氨酸殘基的蛋白，闡明這些甲基化信號是如何被讀取和傳導(dǎo)以調(diào)節(jié)擬南芥開花的。(5) 結(jié)合蛋白雙向電泳和精氨酸甲基化特異性抗體等分析手段，比較野生型Col和atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b單突變體及其雙、三突變體蛋白質(zhì)甲基化譜式的改變，通過質(zhì)譜分析出蛋白，進一步在體內(nèi)、外驗證該蛋白是哪種AtPRMT的特異性底物，并通過遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等手段，研究這些蛋白調(diào)控擬南芥開花的分子機理。(6) 利用反向遺傳學(xué)手段，分離鑒定參與開花調(diào)控的新的表觀調(diào)控因子，揭示這些因子調(diào)控植物開花過程的信號網(wǎng)絡(luò)。研究目標：鑒定GA開花調(diào)控途徑中新成員的2個；確定擬南芥中多個蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶等蛋白質(zhì)翻譯后修飾因子調(diào)控開花過程的靶基因3-5個；提出1-2個關(guān)鍵開花基因遺傳和表觀遺傳調(diào)控分子機制的模型。發(fā)表高影響因子的SCI論文10篇、總影響因子50以上；培養(yǎng)研究生10名、博士后2人。承擔單位： 中國科學(xué)院遺傳發(fā)育生物學(xué)研究所課題負責人： 曹曉風 主要學(xué)術(shù)骨干： 傅向東、范六民、王濤、侯歲穩(wěn)課題1經(jīng)費比例： 36本課題的經(jīng)費占總課題經(jīng)費的36%，其中33%作為科研實施經(jīng)費，另外3%作為項目負責人協(xié)調(diào)各個課題之間科研工作的管理費用以及項目執(zhí)行期間舉辦研究課題相關(guān)領(lǐng)域?qū)W術(shù)研討會等費用。各單位的經(jīng)費分配主要根據(jù)各單位承擔任務(wù)的多少和預(yù)期目標的大小而定，各個課題之間存在一定的聯(lián)系，初步的任務(wù)承擔和經(jīng)費分配方案如下： 1、赤霉素調(diào)控植物開花的分子機制研究傅向東組（中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所） 總項目的102、蛋白質(zhì)復(fù)合體對開花關(guān)鍵基因表達調(diào)控的分子機制范六民組 （北京大學(xué)）總項目的3.5 侯歲穩(wěn)組 （蘭州大學(xué)）總項目的2.53、蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控植物開花過程的信號網(wǎng)絡(luò)研究。曹曉風組（中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所） 總項目的14.5王 濤組（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)） 總項目的2.5課題2、植物重要器官形態(tài)建成的調(diào)控機制和模型設(shè)置思路：高等植物的器官發(fā)生和形態(tài)建成是一個連續(xù)、不間斷的生物學(xué)過程，隨著發(fā)育進程的展開，逐步在細胞、組織和器官等不同的發(fā)育層面上完成。花是植物體最重要和復(fù)雜的器官，在花器官原基起始以后的發(fā)育過程中，經(jīng)過一系列細胞分裂、功能分化和細胞生長，通過腹背、兩側(cè)、近遠三維軸向的建立，使花器官的不同區(qū)域被特化，形成完全發(fā)育的萼片、花瓣、雄蕊和心皮。在擬南芥中四種花器官的出現(xiàn)不僅被各種器官特征轉(zhuǎn)錄因子所精確控制，而且受到miRNA和組蛋白修飾在轉(zhuǎn)錄后和染色質(zhì)水平上的調(diào)控。以水稻為代表的單子葉器官形態(tài)建成與擬南芥有很大差異，而水稻中內(nèi)稃、外稃和漿片等擬南芥不具有的器官是如何產(chǎn)生的、細胞程序化死亡如何參與調(diào)控雄性生殖器官發(fā)育等問題一直是植物進化發(fā)育生物學(xué)中的重要科學(xué)問題。研究內(nèi)容：本課題以擬南芥和水稻為主要材料，利用遺傳學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)和全基因組學(xué)研究手段，重點采用突變體篩選和鑒定，分離和克隆控制突變體表型的關(guān)鍵基因并對克隆的基因進行功能驗證，利用細胞學(xué)和分子生物手段、突變體間的遺傳雜交分析研究功能基因間的相互作用關(guān)系；初步闡明器官形態(tài)建成的分子機理。我們將開展以下三個方面的研究：1) 水稻外稃、內(nèi)稃和穎片發(fā)育遺傳機制研究：(1) 以osmads1, osmads13、oseg1、osrep1和osdcl4等外稃、內(nèi)稃、穎片、心皮等發(fā)育異常的突變體為材料，通過構(gòu)建雙突變體、篩選增強子和抑制子等，研究這些關(guān)鍵因子以及小分子RNA參與控制水稻等花器官形態(tài)建成的遺傳控制機理；(2) 構(gòu)建遺傳群體對osrep1和osdcl4的增強子和抑制子進行形態(tài)分析；并利用圖位克隆等技術(shù)分離控制花器官的關(guān)鍵基因，進行功能研究，提出相關(guān)模型；(3) 利用大規(guī)模小分子RNA測序技術(shù)，通過比較野生型和osdcl4不同組織的小分子RNA的組成，鑒定osdcl4調(diào)控的小分子RNA及其作用的靶位點，研究這些因子在水稻外稃、內(nèi)稃發(fā)育中的作用。2) 控制擬南芥和水稻雄蕊及小孢子發(fā)育關(guān)鍵遺傳機理研究：(1) 深入研究擬南芥和水稻雄蕊發(fā)育(有絲分裂、細胞程序性死亡)等異常的突變體，如dmg1、dmg2、dmg3、ams, osms1, osms5 和PCD in male gametogenesis (pig)等；(2) 分離DMG1、DMG2、DMG3、OsMS1、OsMS5和PIG基因，進行RT-PCR、原位雜交等功能分析；利用切片、免疫染色等深入研究DMG1、DMG2、DMG3、AMS、OsMS1、OsMS5和PIG參與雄蕊特別是小孢子發(fā)育的機理。(3) 控制水稻雄性生殖細胞分化和花粉發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)