PCR技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用.ppt

PCR技術(shù)的原理 操作及應(yīng)用 湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科黃一偉 什么是PCR PCR Polymerasechainreaction 即聚合酶鏈反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù) PCR技術(shù)的發(fā)展歷史 關(guān)于PCR的文章首次由美國科學(xué)家KaryMullis等人在 Science 雜志上發(fā)表 Science 雜志報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶 生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶 的發(fā)現(xiàn) 預(yù)示著分子時(shí)代的到來 12月 Science 雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè) 年度分子 1993KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) PCR技術(shù)的原理1 遺傳物質(zhì) 細(xì)胞核 染色體 DNA 脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構(gòu)成 堿基 A T C G 是按雙鏈螺旋排列的 堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性 比如人類體細(xì)胞中共有31億個(gè)堿基對(duì) 按上述的0 1 的差 人和人之間有3百萬個(gè)堿基對(duì)的差別 PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板 以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成 PCR技術(shù)的原理2 PCR反應(yīng)的基本成分包括7種基本成分 模板DNA 特異性引物 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 脫氧核苷三磷酸 dNTP 二價(jià)陽離子 緩沖液及一價(jià)陽離子基本反應(yīng)步驟 變性 退火 延伸最后通過染料如EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出 PCR技術(shù)的原理3 重復(fù)1 3步25 35輪 目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈與引物復(fù)性 DNA變性形成2條單鏈 子鏈延伸DNA加倍 RT PCR的原理 相對(duì)于PCR 在開始階段增加步驟 RNA cDNA合成 是單鏈到雙鏈的過程 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) Real TimeQuantitativePCR 是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán) 利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程 最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 常用的熒光定量PCR試劑 SYBRGreenITaqman水解探針 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理2 基線 Baseline 是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里 熒光信號(hào)變化不大 接近一條直線 這樣的直線即基線 光閾值threshold的設(shè)定一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) 熒光域值是PCR3 15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍 熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期 CT Cyclethreshold 值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) 研究表明 各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系 起始拷貝數(shù)越多 CT值越小 反之亦然 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù) 縱坐標(biāo)代表CT值 因此 只要獲得未知樣品的CT值 即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理3 Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后 熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比初始DNA量越多 熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù) Ct值 越少起始模板的對(duì)數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系 根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 特異敏感快速 簡便易自動(dòng)化等 PCR技術(shù)的局限性 為了構(gòu)建特定引物 使特定DNA序列的選擇性擴(kuò)增 必須有一個(gè)龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫 聚合酶鏈反應(yīng)效率差異很大 根據(jù)不同的因素需要優(yōu)化反應(yīng)條件 PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度有限 PCR技術(shù)的注意事項(xiàng) 防止污染 建立良好的質(zhì)量控制 操作時(shí)避免氣溶膠產(chǎn)生 特別注意陽性樣品的拿放 使用一次性耗材 穿戴手套并經(jīng)常更換 永遠(yuǎn)在最后一步才加核酸 液體分裝使用等 引物設(shè)計(jì)合理Taq酶擴(kuò)增錯(cuò)誤率較高 大約1 100對(duì)堿基 20個(gè)循環(huán)鎂離子濃度對(duì)反應(yīng)效率的影響儀器穩(wěn)定性 升降溫速率 管子的密合度等RT PCR注意防止RNA降解 PCR技術(shù)的操作1 以流感病毒的RT PCR和Real timeRT PCR檢測(cè)為例說明PCR技術(shù)的操作步驟主要儀器 PCR儀 Real timePCR儀 微量移液器 高速冷凍離心機(jī) 電泳儀和電泳槽 凝膠電泳觀察儀或成像系統(tǒng) 生物安全柜等 PCR技術(shù)的操作2 1 病毒核酸RNA提取2 RT PCR反應(yīng)或者Real timeRT PCR反應(yīng)3 UV紫外燈檢測(cè)或者電腦上直接讀取結(jié)果 流感病毒核酸提取1 試驗(yàn)材料QIAGEN公司的RneasyMiniKit 或QIAGEN公司的QIAmpViralRNAMiniKit 操作類似 巰基乙醇 mercaptoethanol 70 乙醇無菌及DNA RNA酶的1 5ml離心管10 l 20 l 200 l 1000 l加樣器和槍頭可調(diào)13K微型冷凍離心機(jī)待檢流感病毒200 l 流感病毒核酸提取2 1 取采樣液 鼻拭子 咽拭子 胸水等 或病毒培養(yǎng)物 雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液 200ul加在1 5mlEppendorf管中2 依次加入350ulRLT液 3 5ul 巰基乙醇和70 的乙醇550ul混勻3 將Rneasyminispin柱子置于干凈的2ml收集管上 將2步驟的混合液600ul吸出加入柱子中 12 000rpm 離心15秒 棄收集管中的離心液4 柱子仍放回收集管上 將2步驟剩余的混合液全部吸到柱子上 12 000rpm 離心15秒 棄離心液5 于柱子中加入700ulWashBufferRW1液 12 000rpm 離心15秒6 取一支干凈的2ml收集管 將離心后的柱子移到新的收集管上 于柱子中加入500ulWashBufferRPE液 12 000rpm 離心15秒7 棄收集管中的離心液 再于柱子中加入500ulWashBufferRPE液 13 000 14 000rpm 離心2分鐘8 將柱子移到一干凈的1 5ml的eppendrof管上 于柱子中加入20 50ul的Rnase freeWater 室溫靜置1 3分鐘9 12 000rpm 離心1分鐘 收集離心液即為提取的病毒RNA 立即做實(shí)驗(yàn)或 20 以下保存試劑盒為QIAGEN公司的RNeasyMiniKit catalog 74104 注意 試劑盒中的RPE液用前需加44ml的無水乙醇 使終體積達(dá)到55ml RT PCR反應(yīng)1 試驗(yàn)材料QIAGENOneStepRT PCRKit CatNo210212 RNaseinhibitor40u l上游引物200ng l下游引物200ng l擴(kuò)增H5亞型禽流感病毒的引物序列為 H5 1 5 GCCATTCCACAACATACACCC 3 H5 3 5 CTCCCCTGCTCATTGCTATG 3 提取的RNA RT PCR反應(yīng)2 1 分別標(biāo)記好0 2ml的微量離心管 在每個(gè)管中加入如下內(nèi)容 5ulQIAGENOneStepRT PCRbuffer 5 1ul10mMdNTPs1ulEnzymeMix0 13ulRNaseinhibitor 40U ul 14 3ulRnase freewater2 加1ul的引物加5ul未知RNA或5ul陽性對(duì)照或Rnase freewater作為陰性對(duì)照 RT PCR反應(yīng)3 OneStepRT PCR反應(yīng)條件如下 50 作用30分鐘 逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 95 作用15分鐘 使逆轉(zhuǎn)錄酶等失活 94 變性30秒55 退火30秒72 延伸30秒回到第3步 34個(gè)循環(huán)72 作用2分鐘結(jié)束 RT PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)1 凝膠電泳緩沖液配方10 TBE緩沖液 每升 Tris107 8gBoricAcid55 0gEDTA Na2 8 2g10 TAE緩沖液 每升 Tris48 4g冰乙酸11 42g0 5mol LEDTA20ml用電泳緩沖液制備1 5 瓊脂糖凝膠 按每孔8ulPCR產(chǎn)物上樣至膠中 100伏電泳30min 紫外觀察并拍照記錄 RT PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)2 RT PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判定 Real timeRT PCR的操作1 病毒核酸RNA提取 同RT PCRReal timeRT PCR 以匹基公司禽流感檢測(cè)試劑盒為例 按試劑盒操作說明 25 l反應(yīng)體系 RT PCR反應(yīng)液15 l Taq酶0 25 l 逆轉(zhuǎn)錄酶n 4顆 n為PCR管數(shù) 待檢RNA10 l 加好RNA后400g離心5sec 將PCR管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi) 記錄樣本擺放順序 反應(yīng)條件為 42 30min 92 3min 92 10sec 45 30sec72 1min5個(gè)循環(huán) 92 10sec 60 30sec40個(gè)循環(huán) 60 時(shí)設(shè)置收集熒光 Real timeRT PCR的操作2 結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測(cè)結(jié)果 閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn) 結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn) 或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整 CT Cyclethreshold 值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) 研究表明 各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系 起始拷貝數(shù)越多 CT值越小 反之亦然 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù) 縱坐標(biāo)代表CT值 因此 只要獲得未知樣品的CT值 即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù) 基線 Baseline 是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里 熒光信號(hào)變化不大 接近一條直線 這樣的直線即基線 光閾值threshold的設(shè)定一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) 熒光域值是PCR3 15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍 熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期 Real timePCR的操作3 結(jié)果判定1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)1 1陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陰性 1 2陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28 0 否則 此次實(shí)驗(yàn)視為無效 2 結(jié)果判斷2 1Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本 2 2Ct值 30 0的樣本為陽性 2 3Ct值大于30 0的樣本建議重做 重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性 否則為陽性 PCR技術(shù)的應(yīng)用 基因克隆 測(cè)序和表達(dá)等法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定遺傳性疾病檢測(cè) 腫瘤診斷 病原體檢測(cè)等 基因克隆和表達(dá) DNA指紋技術(shù)1 1984年英國的遺傳學(xué)家AlecJeffreys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時(shí) 意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA 不產(chǎn)生蛋白的DNA 上重復(fù)著一種小片段DNA 這一含15個(gè)左右堿基的DNA片段 在不同個(gè)體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同 Jeffreys首先在自己的DNA上進(jìn)行研究 驗(yàn)證了這一技術(shù) 如果我們有血緣關(guān)系 這些不同會(huì)大大縮小 Jeffreys命名這一技術(shù)為DNA指紋技術(shù) DNAfingerprint DNA指紋技術(shù)2 采集血樣 毛發(fā) 精液 口腔粘膜細(xì)胞 分離DNA 用PCR將選定的DNA片段放大 并進(jìn)行對(duì)比 統(tǒng)計(jì)分析 便可得出是否為作案兇手或是否有血緣關(guān)系 分子診斷學(xué) 分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ) 利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在 結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化 為疾病的預(yù)防 預(yù)測(cè) 診斷 治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù) 分子診斷學(xué)的發(fā)展階段 分子診斷學(xué)大致經(jīng)歷了3個(gè)階段 1 利用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷 2 以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA診斷 特別是定量PCR和實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用 不僅可以檢測(cè)存在于宿主的多種DNA和RNA病原體載量 還可檢測(cè)多基因遺傳病細(xì)胞中mRNA的表達(dá)量 3 以生物芯片 biochip 技術(shù)為代表的高通量密集型檢測(cè)技術(shù) 生物芯片技術(shù)包括基因芯片 蛋白質(zhì)芯片 組織芯片等 分子診斷學(xué)的發(fā)展方向 分子診斷學(xué)的發(fā)展方向 1 分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達(dá)產(chǎn)物 mRNA 蛋白質(zhì) 的全面診斷 2 分子診斷的策略從利用