微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn).doc

微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)學(xué)號(hào)： 1035130150姓名： 李睿班級(jí)： 生命科學(xué)學(xué)院 10級(jí) 生物工程郵箱： 1059508633 一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 了解模擬生化干實(shí)驗(yàn)的方法和意義，掌握用protein軟件提純蛋白質(zhì)的方法 。 2. 進(jìn)一步熟悉層析、熱變性、鹽析等常用生化分離方法的原理和應(yīng)用。 二、 實(shí)驗(yàn)原理： 1： “Protein”軟件有36個(gè)任務(wù)，即36組待分離純化的蛋白。任務(wù)要求利用軟件提供的幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提純每一個(gè)目的蛋白，最終達(dá)到單向電泳一條帶，雙向電泳一個(gè)點(diǎn)，而且使用的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)(根據(jù)提取步驟計(jì)算得到)不得超過一個(gè)特定值。在每個(gè)任務(wù)開始時(shí)，軟件給出目的蛋白的一些性質(zhì)，如熱穩(wěn)定的溫度范圍和pH穩(wěn)定范圍等，利用這些信息，可以使實(shí)驗(yàn)少走彎路。 2： “Protein”提供的分離純化方法有七種：熱變性；硫銨沉淀；排阻層析(凝膠色譜)；離子交換層析；吸附層析；聚焦層析；制備電泳。 3： 在“Protein”所提供的各種分離純化方法中，熱變性法和鹽析法是比較好的粗提方法，在提純的早期使用效果較好。層析是各種方法中最強(qiáng)有力的方法，制備電泳雖然純化倍數(shù)高，但是回收率低。在各種層析方法中，又以離子交換層析最為有效和易于使用，并且耗費(fèi)的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)也較少。排阻層析和聚焦層析耗費(fèi)較大，但在某些特定情況下，這兩種方法是不可替代的。 4： “Protein”提供了四種電泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等電聚焦電泳和雙向電泳。這些電泳方法不但可以用以檢測(cè)樣品的純度，而且也給出了樣品的一些信息，如分子量、等電點(diǎn)等，這些信息對(duì)于后續(xù)提純有重要的參考價(jià)值，等電聚焦電泳和PAGE還可以用于制備。 三、 實(shí)驗(yàn)要求：完成實(shí)驗(yàn)軟件中三種酶的分離純化。 四、 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)中為了比較在樣品性質(zhì)不同情況下，如何有效分離，以及各種方法的優(yōu)劣，擬分離如下三種樣品： 1. pH穩(wěn)定范圍較大的1號(hào)蛋白 2. 堿性條件下穩(wěn)定的36號(hào)蛋白 3. 酸性條件下穩(wěn)定的3號(hào)蛋白 1：酸性條件下穩(wěn)定的3號(hào)蛋白 3號(hào)酶在62以下穩(wěn)定，穩(wěn)定pH范圍3.85.8（酸性條件）。 以上為總步驟 二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)） 以上為第一步驟具體參數(shù)以上為第二步驟具體參數(shù) 以上為第三步驟集體參數(shù)以上為第三步洗脫曲線以上為第三步之后的二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)） 以上為第四步的具體參數(shù)以上為第四步的洗脫曲線以上為第四步之后的二維電泳，pH 310，分離膠濃度20（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)）已經(jīng)達(dá)到一個(gè)點(diǎn)的要求PAGE：分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)），緩沖體系：磷酸二氫鉀-NaOH，pH 8.0已經(jīng)達(dá)到一個(gè)點(diǎn)要求SDS-PAGE：分離膠濃度20（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)）。已經(jīng)達(dá)到一條線要求由以上試驗(yàn)可得酶活力回收91.86，純化倍數(shù)為20.577，耗費(fèi)986.8054元，費(fèi)時(shí)35小時(shí)。2：堿性條件下穩(wěn)定的36號(hào)蛋白36號(hào)酶在31度下穩(wěn)定，穩(wěn)定pH范圍7.7-10以上為總步驟二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)） 第一步的具體參數(shù)第一步的洗脫曲線第一步之后的二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)）第二步的具體參數(shù) 第二步的洗脫曲線二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)）已經(jīng)達(dá)到一個(gè)點(diǎn)PAGE 緩沖體系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6?？梢钥闯觯呀?jīng)基本達(dá)到一個(gè)點(diǎn)。SDS-PAGE：分離膠濃度10%（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3%（體積分?jǐn)?shù)）已經(jīng)達(dá)到只有一條清晰的線由以上試驗(yàn)可得酶活力回收93.01，純化倍數(shù)為15.605，耗費(fèi)340元，費(fèi)時(shí)20小時(shí)。3： pH穩(wěn)定范圍較大的1號(hào)蛋白1號(hào)酶在50度下穩(wěn)定，穩(wěn)定范圍2-11(穩(wěn)定范圍較大)以上為總步驟二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)） 以上為第一步的具體參數(shù)以上為第二步的具體參數(shù)以上為第二步驟的洗脫曲線以上為第二步后二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)）以上為第三步的具體參數(shù)以上為第三步的洗脫曲線二維電泳，pH 310，分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)）已經(jīng)達(dá)到一個(gè)點(diǎn)PAGE：分離膠濃度10（體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3（體積分?jǐn)?shù)），緩沖體系：磷酸二氫鉀-NaOH，pH 8.0