southern雜交標準步驟.doc

1、 試劑的選用和配置：不同種類的尼龍膜其所采用的轉(zhuǎn)移緩沖液和洗膜液不同。本實驗標準采用帶正電荷的尼龍膜。變性液/堿性轉(zhuǎn)移緩沖液（應用于帶正電荷尼龍膜的堿性轉(zhuǎn)移）0.4mol/L NaOH1mol/L NaCl配2母液1L。中和緩沖溶液（只用于堿性轉(zhuǎn)移）0.5mol/L Tris-Cl (pH 7.2)1mol/L NaCl20SSC800ml H2O溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，用幾滴14mol/LHCl調(diào)pH至7.0，用水定容至1L。分裝后高壓滅菌，試劑終濃度為3.0mol/L NaCl和0.3mol/L檸檬酸鈉。10%(m/V) SDS配制時68加熱助溶，濃鹽酸調(diào)pH至72，定容室溫保存。（pH極易調(diào)過，需小心?。┒⒓夹g(shù)操作步驟：、DNA酶切和低壓電泳：概述：酶切所需DNA的量為10g30g，所需限制性內(nèi)切酶量為10Unit酶/1g DNA，neb公司的限制性內(nèi)切酶的最佳酶切條件為50l體系酶切12gDNA。為了避免型號活性，注意所加酶的甘油含量和鹽分含量（glycerol concentration 5%, or pH 8.0 may result in star activity酶儲液含50% glycerol，因而酶最大用量不能超過酶切體系的10%），同時，選擇內(nèi)切酶時要注意其可能因甲基化的敏感性導致基因組酶切效果不好。1、400l的酶切反應體系：（1030g）30 g DNA 酶300 U 37酶切16h。電泳檢測酶切效果。1/10體積（40l）3mol/L醋酸鈉2.5倍體積的冷無水乙醇（或0.61倍體積的遇冷異丙醇）-20沉淀DNA，70%乙醇洗滌沉淀，溶解于25l 1TE。2、熒光定量測定濃度后，加入5l 6上樣緩沖溶液，56水浴5min，迅速置于冰上2min，以破壞粘性末端可能形成的堿基對。1TAE或0.5TBE電泳緩沖液和0.8%的瓊脂糖凝膠以小于1V/cm的電壓電泳12h。由于DNA在凝膠中會擴散，因而最好不要將凝膠放置超過一天。（樓下電泳儀一般用30V）3、修去凝膠邊緣和加樣孔上不平整的無用部分，加樣孔端朝下，凝膠左下角Marker側(cè)，切去一小三角，作為凝膠方位的標記。對于大于15kb的條帶，可采用將凝膠置于0.2mol/L的HCl中數(shù)分鐘，直到溴酚藍變黃，二甲苯青變成黃色/綠色后，迅速將HCl倒入廢液缸，去離子水洗滌數(shù)次。（強酸導致DNA脫嘌呤，而有利于轉(zhuǎn)膜。但是，過度會導致DNA斷裂成較小片段。）、DNA的變性、轉(zhuǎn)膜裝置組裝和轉(zhuǎn)膜：1、帶電荷的尼龍膜：將凝膠浸入數(shù)倍體積的堿性轉(zhuǎn)移緩沖溶液中，室溫振蕩15min。更換一次堿性緩沖溶液繼續(xù)浸泡20min。2、切一張每邊比凝膠大1mm的尼龍膜，并剪兩張同樣大小的厚吸水紙。（注意：需帶一次性PE手套和鈍頭鑷子，沾有油污的膜不易浸濕。）3、將膜飄浮于盛有去離子水的平皿中，直到其完全浸濕后，將其浸入適當?shù)霓D(zhuǎn)移緩沖溶液中至少5min，用干凈的解剖刀切下膜的一角，與凝膠所切下的角一致。（注意：膜的浸濕完全與否，對DNA的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。浸濕的膜可保存在高壓的2SSC飽和的3MM濾紙中，4保存。）4、將一張厚的吸水紙放在一片樹脂玻璃板或平皿上，形成比凝膠長且寬的支持物。將支持物或皿放入一個大的干烤皿中，吸水紙兩端從板邊緣垂下。5、干烤皿中加入適當?shù)霓D(zhuǎn)移緩沖液，直到液面幾乎與支持物表面平齊。當支持物上的吸水紙完全浸濕后，用玻璃棒趕走吸水紙下的氣泡。6、將凝膠從變性液/堿性緩沖液中取出，倒轉(zhuǎn)使原來的底面向上。放在支持物上，并位于吸水紙中央。用玻璃棒趕走凝膠與吸水紙間的氣泡。7、用Parafilm膜包繞凝膠四周，不要覆蓋凝膠。以屏蔽轉(zhuǎn)移緩沖液從凝膠周圍短路流入吸水紙。8、用適當?shù)霓D(zhuǎn)移緩沖溶液將凝膠濕潤。將濕潤的尼龍膜放置于凝膠上并使兩者的切角相重疊。為避免產(chǎn)生氣泡，當先使膜的一角與凝膠接觸再緩慢的將膜放到凝膠上。膜的一邊應恰好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣。膜一旦放在凝膠上就不要再移動了。9、在尼龍膜上放置兩張與膜大小相同的吸水紙，切一疊略小于吸水紙的紙巾（58cm高），將紙巾放在吸水紙之上，在紙巾頂部放一塊玻璃板然后用一400g重物壓實。10、轉(zhuǎn)移824h，當紙巾濕潤后更換新的紙巾。11、除去凝膠上的紙巾和吸水紙，翻轉(zhuǎn)凝膠以及與之接觸的尼龍膜，凝膠向上平放于干燥的吸水紙上。用極軟的鉛筆或圓珠筆標記加樣孔的位置。12、將凝膠從膜上剝離，棄去凝膠。13、紫外成像檢測凝膠上DNA的殘留量，用以確定轉(zhuǎn)移效率。、DNA的固定：帶正電荷的尼龍膜的堿性轉(zhuǎn)移：堿性緩沖溶液會使DNA共價結(jié)合于帶正電荷的尼龍膜上，因而不需要固定，直接將膜浸入中和緩沖溶液，室溫15min。浸泡以除去膜上的凝膠碎片，同時使膜中和。不帶電荷的中性尼龍膜的中性轉(zhuǎn)移：1、將膜浸入6SSC，室溫放置5min，以除去粘附在膜上的凝膠碎片。2、真空烘烤固定：將膜從6SSC中取出，并使多余的液體流凈。將膜放在紙巾上室溫晾干30min，將膜夾在兩張干燥的吸水紙中間，真空爐中80烘烤2h。 微波爐烘烤固定：將潮濕的膜放在一張干燥的吸水紙上，將微波爐調(diào)到最大功率（750900W）對膜加熱23min。（直接進行雜交，或?qū)⒛じ稍锖笪堉斜４妫?紫外照射交聯(lián)：將潮濕的膜放在一張干燥的吸水紙上。254nm的紫外線照射使DNA交聯(lián)到膜上。（其原理是紫外線照射使DNA中的一小部分胸腺嘧啶殘基與膜表面帶正電荷的氨基基團之間形成共價交聯(lián)，但過量照射將導致大部分的胸腺嘧啶共價結(jié)合而降低雜交信號。同時，紫外線照射可能增強某些帶正電荷的尼龍膜的雜交信號背景，因而應當使膜上帶有DNA的一面朝向紫外。建議對潮濕的膜采用總量1.5J/cm2，干燥的膜采用0.15J/ cm2。）3、對于不立即用于雜交的膜都應充分干燥，松弛的包于鋁箔紙或吸水紙中，室溫下最好保存在真空條件?；虼だ鋮s后，用保鮮膜包好以后保存在-20備用。地高辛顯色系統(tǒng)方案：、探針的合成：（300bp1kb）一、PCR法標記探針：概述：為了減少探針的非特異性擴增，最好不要以基因組DNA為模板直接合成探針。需要對合成探針的片段進行PCR擴增并膠回收目的片段，回收后濃度一般為2040ng，可做為探針合成模板使用。 PCR法合成探針采用萊伯克生物科技公司的DIG DNA標記試劑盒，引物濃度為10pmol/l，反應體系為：正向引物（50100pmol） 5l反向引物（50100pmol） 5lcDNA模板（1020ng/l） 1 l 10 PCR緩沖溶液 2lMgCl2 2lDig-dUTP標記混合物 2lH2O XlTaq DNA聚合酶 0.5lTotal: 20lPCR反應程序：94 4min94 30s60 30s72 1min30s72 10min4 紫外分光光度計測濃度后，保存在-20。（DNA探針雜交需525ng/ml，RNA探針雜交需100ng/ml，寡核苷酸探針，0.110pmol/ml。CDP-star為底物時，探針濃度應減少一半。）經(jīng)驗量：取5l電泳，條帶清楚的話，每次雜交需23l。500ng/l的探針。、雜交：概述：標準雜交液的雜交溫度在6568，加有50%的formamide的雜交液或High SDS Buffer的雜交溫度為3742。1、探針變性：95煮沸5min（PCR儀中操作），立即置于冰上5min。2、將膜放入雜交管中，DNA一面朝里，不能有氣泡。3、加入65預熱的Hyb高效雜交液（美季）5ml（0.1ml/cm2），65 815轉(zhuǎn)/min預雜交1h。4、倒出預雜交液，另取適量預熱的高效雜交液（5ml），加入變性的探針混勻（此步可以用1ml的雜交液將探針稀釋后再加）。加入雜交管中，65雜交過夜20h。洗膜：1、取出雜交管，倒棄雜交液至廢液缸中，夾住露出瓶口的膜的一角將多余的雜交液晾干。2、將膜沒入含有數(shù)百毫升的2SSC及0.5%SDS的皿中，室溫輕輕振蕩5min。切忌將膜干燥！3、將第一次洗液倒入廢液缸中，加入數(shù)百毫升2SSC及0.1%SDS。室溫下放置15min，期間輕輕振蕩數(shù)次。4、將浸泡的溶液換成數(shù)百毫升新鮮的含有0.1%SDS的0.1SSC。65下放置30min1h。并輕輕振蕩。5、室溫下，0.1SSC洗去膜上的泡沫。顯色：概述：NBT（四唑硝基藍）為堿性磷酸酶的最佳底物之一，在堿性磷酸酶催化下，BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽）被水解，BCIP脫磷并聚合而變藍，過程中放出的H+使NBT還原形成不溶性深藍色的NBT-Formazan。 一般Dig1配置900ml后600ml用于配Dig3，100ml配Dig2（需加熱溶解），Dig5配200ml，Dig6顯色配50ml。1、Dig1 沖洗膜面 1/10體積的10Dig1 Buffer2、Dig2封閉1h 1% digoxin block reagent in Dig1 （需提前65加熱溶解）3、Dig3 洗滌30min 1% BSA和0.3% Triton-X 100 in Dig14、Dig4 雜交2h 1:2000 anti-dig-AP in Dig3(現(xiàn)用現(xiàn)加)5、Dig3 洗滌4次 每次10min6、Dig1 沖洗并洗滌10min7、Dig5 沖洗并洗滌10min 1/10體積的10Dig5A和1%的六水和氯化鎂 in water8、Dig6 錫箔紙包裹避光4顯色過夜（切勿振蕩）1/50體積NBT和1/50 BCIP in Dig5（NBT和BCIP有毒，應戴手套操作。）9、蒸餾水沖洗終止顯色后保鮮膜包裹掃描。不要顯色過頭。10、1525干膜存放，其顏色會減淡，可在TE溶液中濕潤。生物素顯色系統(tǒng)方案：采用North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit探針標記試劑盒。、biotin標記探針按照說明書上操作。、預雜交 將4取出的North2South Hybridization Buffer放置至室溫。 將膜放入雜交管中，加入雜交液0.1ml/cm2膜。 DNA在55下孵育至少30min。、探針變性 100加熱探針10min后，迅速放在冰上5min，變性探針。、雜交 預雜交后，加入變性的生物素標記探針。（約30ng/ml雜交液） 55雜交過夜。、嚴格洗膜 將North2South Hybridization Stringency Wash Buffer(2)37水浴溶解。 待Wash Buffer完全溶解后，加入等體積的ddH2O稀釋為1Buffer。（含有2SSC/0.1 SDS） 0.2ml/cm2膜的1Strigency Wash Buffer 55洗1520min，共洗三次。、親和素雜交注意用干凈的鑷子夾起膜的一角，不要夾其他部位，并用乙醇沖洗鑷子。 到出Strigency Wash Buffer，加入足夠的Blocking Buffer（至少0.25ml/cm2膜），室溫孵育15min30min。 以1:300倍稀釋的比例加入Streptavidin-HRP到雜交管的底部的Blocking Buffer，注意不要與膜接觸，搖動雜交管，待混勻后，室溫孵育15min。 ddH2O稀釋Wash Buffer（4）為1。洗膜4次，每次5min，室溫。 將膜轉(zhuǎn)入干凈的平皿中，加入Substrate Equilibration Buffer（0.25ml/cm2膜），室溫平衡5min。、顯影： 1:1體積