酶工程制藥知識(shí)PPT課件

酶工程制藥 第一節(jié)概述第二節(jié)酶的來(lái)源和生產(chǎn)第三節(jié)酶和細(xì)胞的固定化第四節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器第五節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用第六節(jié)酶工程研究的進(jìn)展 癬帶杖佑氈蝶蹈失寅勸彼表鐮燼否杭都狗撻泉嗣枉烤俱霸寓插聞準(zhǔn)渺櫥澗生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 第一節(jié)概述 一 酶的特性酶 酶促反應(yīng)的定義酶除具有一般催化劑的共性外 還有其特有的特點(diǎn) 催化效率高 專(zhuān)一性強(qiáng) 反應(yīng)條件溫和 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制 1961年按酶所催化的反應(yīng)類(lèi)型將酶分成6大類(lèi) 氧化還原酶類(lèi) 轉(zhuǎn)移酶類(lèi) 水解酶類(lèi) 裂合酶類(lèi) 異構(gòu)酶類(lèi) 合成酶 或稱(chēng)連接酶 類(lèi) 責(zé)像笆抉叫羅態(tài)鐮陷宗嶄故硼浩蓬遍編壩判酥乏蘇邯筍恿吧這締攘及伏夾生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 二 酶工程簡(jiǎn)介 酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合 發(fā)展而形成的一門(mén)新的技術(shù)科學(xué) 它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶 應(yīng)用酶的特異性催化功能 并通過(guò)工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù) 20世紀(jì)20年代初 酶工程名稱(chēng)出現(xiàn)于自然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用 1953年 羧肽酶 淀粉糖化酶 胃蛋白酶和核糖核酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行固定 1969年 固定化酶技術(shù)拆分DL 氨基酸1971年 1st國(guó)際酶工程會(huì)議 酶的生產(chǎn) 分離純化 酶的固定化 酶及固定化酶的反應(yīng)器 酶及固定化酶的應(yīng)用等 免桑呆然智賣(mài)漆啡鍍某胸牙帕氈費(fèi)看筒吃羅威灣靡狗廚鄂瓣盧挑壹瞄秩瓷生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 二 酶工程簡(jiǎn)介 從現(xiàn)代觀點(diǎn)來(lái)看 酶工程主要有以下幾個(gè)方面的研究?jī)?nèi)容 酶的分離 提純 大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應(yīng)用開(kāi)發(fā) 酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究 包括酶?jìng)鞲衅?反應(yīng)檢測(cè)等 酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶 突變酶 的研究 酶的分子改造與化學(xué)修飾 以及酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究 有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究 酶的抑制劑 激活劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究 抗體酶 核酸酶的研究 模擬酶 合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì) 合成的研究 備的容中室摟淳淳埂被餒誣貌吮符本去謬沖佳招殆售險(xiǎn)釩批款隕醚憂珠姐生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 第二節(jié)酶的來(lái)源和生產(chǎn) 一 酶的來(lái)源酶的來(lái)源主要是動(dòng)植物和微生物 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法可用于酶生產(chǎn) 目前工業(yè)化生產(chǎn)一般以微生物為主要來(lái)源 利用微生物生產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是 微生物種類(lèi)繁多 動(dòng)植物體內(nèi)存在的酶 幾乎都可從微生物中得到 微生物繁殖快 生產(chǎn)周期短 培養(yǎng)簡(jiǎn)便 并可以通過(guò)控制培養(yǎng)條件來(lái)提高酶的產(chǎn)量 微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性 通過(guò)各種遺傳變異的手段 能培育出新的高產(chǎn)菌株 鉚婁鞋敢搜艦廟竹垃住哩噪揣米仰票肚烈蜂通幀呼閩蔗皮纂暇喝皋甄紹碎生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 二 酶的生產(chǎn)菌 1 對(duì)菌種的要求 1 產(chǎn)酶量 酶的性質(zhì) 最好是胞外酶 2 不是致病菌 3 穩(wěn)定 不易產(chǎn)生變異退化 不易感染噬菌體 4 能利用廉價(jià)的原料 發(fā)酵周期短 易于培養(yǎng) 2 生產(chǎn)菌的來(lái)源 菌種保藏機(jī)構(gòu)和有關(guān)研究部門(mén) 但大量的工作應(yīng)是從自然界中分離篩選 菌樣采集 菌種分離初篩 純化 復(fù)篩和生產(chǎn)性能鑒定等 還應(yīng)包括改良 如基因突變 基因轉(zhuǎn)移和基因克隆 3 目前常用的產(chǎn)酶微生物 大腸桿菌 枯草桿菌 啤酒酵母 青霉菌 木霉菌 根霉菌鏈霉菌等 織學(xué)舊蒜況踩?；创毂腓徔竦ぜ褧粤考险脸蠹劫u(mài)吼炔懼深酋曳吸綻窗耘生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 第三節(jié)酶和細(xì)胞的固定化 酶反應(yīng)幾乎都在水溶液中進(jìn)行 屬均相反應(yīng) 自然簡(jiǎn)便 但缺點(diǎn)是游離酶只能一次性使用 不僅造成酶的浪費(fèi) 而且會(huì)增加產(chǎn)品分離的難度和費(fèi)用 影響產(chǎn)品的質(zhì)量 另外溶液酶很不穩(wěn)定 容易變性和失活 將酶制劑制成既能保持其原有的催化活性 性能穩(wěn)定 又不溶于水的固形物 即固定化酶 則可象一般固定催化劑那樣使用和處理 就可以大大提高酶的餓利用率 與酶類(lèi)似 細(xì)胞也能固定化 固定化細(xì)胞既有細(xì)胞特性和生物催化的特性 也具有固相催化劑的特點(diǎn) 洛唇代蹈閩鄰盒然垃鼎沮倘舍篇正妝卡酪途城橋結(jié)賂贅巨浴膀梆搬嗜郡夾生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 一 固定化酶的制備 1 固定化酶的定義 是指限制或固定于特定空間位置的酶 具體來(lái)說(shuō) 是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理 使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制 而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑 制備固定化酶的過(guò)程叫做酶的固定化 固定化所采用的酶 可以是經(jīng)提取分離后得到的有一定純度的酶 也可以是結(jié)合在菌體 死細(xì)胞 或細(xì)胞碎片上的酶或酶系 愿貢敞弄辨曼氦幟私突昌費(fèi)滄摩蛇罷籌未絆芳錯(cuò)趾昆泣碳桐跡柳蹭敵莆履生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 2 固定化酶的特點(diǎn) 酶類(lèi)可粗分為天然酶和修飾酶 固定化酶屬于修飾酶 修飾酶類(lèi)還包括經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶和用分子生物學(xué)方法在分子水平上進(jìn)行改良的酶等 固定化酶最大特點(diǎn)是既具有生物催化劑的功能 又具有固相催化劑的特性 固相酶還具有以下優(yōu)點(diǎn) 可多次使用 而且在多數(shù)情況下 酶的穩(wěn)定性提高 如固定化的葡萄糖異構(gòu)酶可以在60 65 條件下連續(xù)使用超過(guò)1000h 反應(yīng)后 酶與底物和產(chǎn)物易于分開(kāi) 產(chǎn)物中無(wú)殘留酶 易于純化 產(chǎn)品質(zhì)量高 反應(yīng)條件易于控制 可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制 酶的利用效率高 單位酶催化的底物量增加 用酶量減少 比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng) 迢由昏爵瓷飯蚌礎(chǔ)霸鉸爭(zhēng)功李到酸哇截畔淡塌震罪馴轅痊芒但陵署彼喪溉生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 3 酶和細(xì)胞的固定化方法酶的固定化就是通過(guò)載體將酶限制或固定于特定的空間位置 使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制 而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑 由于酶的空間結(jié)構(gòu) 活性位點(diǎn)等物理化學(xué)特性不同 因此并不是一種固定化技術(shù)就能普遍適用于每一種酶 所以要根據(jù)酶的應(yīng)用目的和特性 來(lái)選擇其固定化方法 目前已建立的各種各樣的固定化方法 按所用的載體和操作方法的差異 一般可分為載體結(jié)合法 包埋法及交聯(lián)法3類(lèi) 細(xì)胞固定化還有選擇性熱變性 熱處理 方法 蘇隕聚因遺擴(kuò)置付渣酥蜂梅佃薪捶儉稍坊和曉很惰寺薪伸呸拒裹赤毀顯烏生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 酶和細(xì)胞的固定化方法 載體結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法 熱處理 細(xì)胞 物理吸附法 共價(jià)結(jié)合法 網(wǎng)格型 微囊型 離子結(jié)合法 燦燎輻質(zhì)封頰其抨找式踢摹嫉綱煩楓以稅鄖淬藥邏潔爛敵屎鈾云笆雛搪糊生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 1 載體結(jié)合法 載體結(jié)合法是將酶結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法 物理吸附法 是用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的一種固定化方法 此類(lèi)載體有無(wú)機(jī)載體 天然高分子 大孔型合成樹(shù)脂 疏水型的載體 物理吸附法的缺點(diǎn)在于最適吸附酶量無(wú)規(guī)律可循 不同載體和不同酶其吸附條件也不同 吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系 同時(shí)酶與載體之間的結(jié)合力不強(qiáng) 酶易于脫落 導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物 此法也可固定細(xì)胞 呢刷蹦佑利論否獸酗鑼坯訝杉短集滋嚴(yán)舵酌借色吟盎腐鮮遏幼磷魏挎蓋父生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 1 載體結(jié)合法 離子結(jié)合法 是通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上的固定化方法 此類(lèi)載體有多糖類(lèi)離子交換劑和合成高分子離子交換樹(shù)脂 如DEAE 纖維素 AmberliteCG 50 XE 97 IR 45和Dowex 50等 操作簡(jiǎn)單 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸不易被破壞 能得到酶活回收率較高的固定化酶 但是載體與酶的結(jié)合力比較弱 容易受緩沖液種類(lèi)或vpH的影響 在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí) 往往會(huì)發(fā)生酶從載體上脫落的現(xiàn)象 此法也可用于微生物細(xì)胞的固定化 細(xì)胞有自溶現(xiàn)象 做香跳嗜擬鄙饞爛場(chǎng)梭磚歉?jìng)}帚百諾在榨孟琉捂看擰膨堯傻屠后居森蛀麗生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 1 載體結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上的固定化方法 也就是將酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法 它是研究最廣泛 內(nèi)容最豐富的固定化方法 其原理是酶分子上的功能團(tuán) 如氨基 羧基 羥基 咪唑基 巰基等和載體表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵 因而將酶固定在載體上 共價(jià)結(jié)合法有數(shù)十種 如重氮化 迭氮化 酸酐活化法 酰氯法 異硫氰酸酯法 縮合劑法 溴化氰活化法 烷基化及硅烷化法等 在共價(jià)結(jié)合法中必須首先使載體活化 即使載體獲得能與酶分子的某一特定基團(tuán)發(fā)生特異反應(yīng)的活潑基團(tuán) 另外要考慮到酶蛋白上提供共價(jià)結(jié)合的功能團(tuán)不影響酶的活性 反應(yīng)條件盡可能溫和 訛攀置屹起錘膛胎豹瑤摯彌睛塌醫(yī)嶼酵測(cè)貓酉單屬浮餌匈綢辭疹禁出索透生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 共價(jià)結(jié)合法的優(yōu)缺點(diǎn) 共價(jià)結(jié)合法與離子結(jié)合法和物理吸附法相比 反應(yīng)條件苛刻 操作復(fù)雜 而且由于采用了比較強(qiáng)烈的反應(yīng)條件 會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化 破壞部分活性中心 因此往往不能得到比活性高的固定化酶 甚至酶的底物專(zhuān)一性等性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化 但是酶與載體結(jié)合牢固 一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類(lèi)等原因而輕易脫落 紙?jiān)竸ζ乱鲏劢吏~(yú)蹈福索畝狙坐械磺征櫥呻杯砷皮舵如褒舷兵叁酞圣侄生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 2 交聯(lián)法 交聯(lián)法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細(xì)胞與細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化方法 交聯(lián)法有可分為交聯(lián)酶法 酶與輔助蛋白交聯(lián)法 吸附交聯(lián)法及載體交聯(lián)法4種 其內(nèi)容有酶分子交聯(lián) 分子間交聯(lián)或輔助蛋白與酶分子間交聯(lián) 也可以先將酶或細(xì)胞吸附于載體表面而后再交聯(lián)或者在酶與載體之間進(jìn)行交聯(lián) 常用的交聯(lián)劑有戊二醛 雙重氮聯(lián)苯胺 2 2 二磺酸 1 5 二氟 2 4 二硝基苯及己二酰亞胺二甲酯等 參與交聯(lián)反應(yīng)的酶蛋白的功能團(tuán)有N 末端的 氨基 賴氨酸的 氨基 酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巰基及組氨酸的咪唑基等 跑裙巳裹擦輔虧疚糙遠(yuǎn)豬領(lǐng)峻吉酚待度各栗膊磨丈蝴賠煞抱墊烘諷余瘡涎生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 交聯(lián)法的優(yōu)缺點(diǎn) 交聯(lián)法的反應(yīng)條件比較強(qiáng)烈 固定化酶的酶活回收一般較低 但是盡可能降低交聯(lián)劑的濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶比活的提高 狗喳趟脖配枉印徘鄰蔓摩訝段唾芭猜呵福必裝娥娜襖巡晃瓜祟鞍老械掏礬生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 最常用的交聯(lián)劑是戊二醛 它的二個(gè)醛基與酶分子的游離氨基反應(yīng)形成schiff堿 彼此交聯(lián) 其方式如下 CH N 酶 N CH CH2 3 CH N 酶 N CH 交聯(lián)方式 N CH CH2 3 CH N N CH CH2 3 CH N CH N 酶 N CH CH2 3 CH N 酶 N CH 贍飾舷掘燃線湃李捎佳蹲適郡捎祥騾誓陷嗣筷疵遺繃升滁潛掇爪檀崇繹仇生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 交聯(lián)法 一般用交聯(lián)法所得到的固定化酶顆粒小 結(jié)構(gòu)性能差 酶活性低 故常與吸附法或包埋法聯(lián)合使用 如先使用明膠 蛋白質(zhì) 包埋 再用戊二醛交聯(lián) 或先用尼龍 聚酰胺類(lèi) 膜或活性炭 Fe2O3等吸附后 再交聯(lián) 由于酶的功能團(tuán) 如氨基 酚基 羧基 巰基等參與了反應(yīng) 會(huì)引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變 導(dǎo)致酶活性下降 為了避免和減少這種影響 常在被交聯(lián)的酶溶液中添加一定量的輔助蛋白如牛血清白蛋白 以提高固定化酶的穩(wěn)定性 血莊砷島狄貍袒昆壘螞坊濘褲脹卉曰唬器疚驕呀避捍救悉徑亢收泣哮燕孜生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 3 包埋法 包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型兩種 將酶或細(xì)胞包埋在高分子凝膠網(wǎng)絡(luò)中的稱(chēng)為網(wǎng)格型 將酶或細(xì)胞包埋在高分子半透膜中的稱(chēng)為微囊型 包埋法注意事項(xiàng) 防止高分子聚合造成酶的失活 只適于小分子底物和產(chǎn)物 網(wǎng)格型中用的高分子有聚丙烯酰胺 聚乙烯醇和光敏樹(shù)脂等合成高分子和淀粉 明膠 膠原 海藻膠和角叉菜膠等天然高分子 網(wǎng)格型包埋法是固定化細(xì)胞中用得最多 最有效的方法 由包埋法制得的微囊型固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體 顆粒比網(wǎng)格型要小得多 比較有利于底物與產(chǎn)物的擴(kuò)散 但是反應(yīng)條件要求高 制備成本也高 痊綿拖索畫(huà)拄乎偽窖爍會(huì)寓盡九糖茂佳愛(ài)提思繳嶄婚殲綱薔足鍋竿煎到隔生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 4 選擇性熱變性法 專(zhuān)用于細(xì)胞固定化 是將細(xì)胞在適當(dāng)溫度下處理使細(xì)胞膜蛋白變性但不使酶變形而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法 薯奇盂羅涯責(zé)無(wú)藤提丟尋噸嘩遠(yuǎn)葵釘弗俏分腺跌蜜涯墩毋八但參省嶺碩或生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 4 酶和細(xì)胞的固定化載體 在酶的固定化過(guò)程中所用的水不溶性固體支持物為載體或基質(zhì) 固定化載體必須符合一定的條件 固定化過(guò)程不引起酶變性 對(duì)酸堿有一定的耐受性 有一定的機(jī)械強(qiáng)度 有一定的餓親水性及良好的穩(wěn)定性 有一定的疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 顆粒均勻 共價(jià)結(jié)合時(shí)具有可活化基團(tuán) 有耐受酶和微生物細(xì)胞的能力 廉價(jià)易得 蛤攝卜拉宰矚擻亡悅鑼浙營(yíng)撰脅待增售奎吞難霍耪動(dòng)犀輝永鎢匝忠貼賴鎊生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 吸附載體 主要有物理吸附和離子吸附兩種 物理吸附有無(wú)機(jī)物和有機(jī)物 包埋載體 目前工業(yè)上用的包埋載體主要有卡拉膠 海藻膠等 共價(jià)結(jié)合載體 有纖維素 SephadexA200 瓊脂 瓊脂糖 苯胺多孔玻璃等 交聯(lián)法是通過(guò)雙或多功能試劑進(jìn)行固定化 因此不需要固定化載體 也可用與吸附法和包埋法相同的載體進(jìn)行交聯(lián) 酶和細(xì)胞固定化的載體見(jiàn)書(shū)中表7 1 師恭佃端寅駿讀診尖宰粗頂唆狀握川役營(yíng)藻紫咳螞閣杰求射際歇猿靖矽私生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 5 固定化酶的制備技術(shù) 1 吸附法制備固定化酶技術(shù) 2 包埋法制備固定化酶技術(shù) 呀吩嗎肇棠豐戳楊琶審張紊噓楓懼問(wèn)貪主遂跺柵左含滓菊膛堿克沛襪識(shí)哈生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 1 吸附法制備固定化酶技術(shù) 物理吸附 用酶的水溶液與對(duì)此酶具有高度吸附能力的載體混合 洗去雜質(zhì)和未吸附的酶即得固定化酶 易脫落 故不常用 離子交換吸附 處理方法與物理吸附相同 但離子間力強(qiáng) 較常用 如柱況存扶蒸匡封陷屆懊吊舷窺蠶充曉枷鼎端籠菲游測(cè)皮印郵錐顴鄂虐殊生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 2 包埋法制備固定化酶技術(shù) 凝膠包埋法和微囊化包埋法 凝膠包埋法 將酶或細(xì)胞限制于高聚物網(wǎng)格中的技術(shù) 可以通過(guò)調(diào)節(jié)凝膠材料的濃度來(lái)改變包埋率和固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度 還可通過(guò)先包埋再交聯(lián)的方法 使保留更堅(jiān)固 微囊化法 將酶或細(xì)胞固定于不同構(gòu)型的膜的外殼內(nèi)的技術(shù) 包有酶的半透膜厚約20nm 膜孔徑40nm 有界面沉降法和界面聚合法兩種 汛稱(chēng)裴佩敏荊舵凹玲郡顴崖哀螢庸怨夾漆哭扼冒寧產(chǎn)攙攙嗎誣寵跨刻興訊生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 界面沉降法 是物理法 其利用某些在水相和有機(jī)相界面上溶解度極低的高聚物成膜的過(guò)程將酶包埋的方法 其過(guò)程為酶溶液在表面活性劑幫助下與水不混溶的沸點(diǎn)比水低的有機(jī)相中乳化 將溶于有機(jī)溶劑的高聚物加入攪拌下的乳化液中 加入另一種不能溶解高聚物的有機(jī)溶劑 使高聚物在油水界面上沉淀 析出及成膜 最后在乳化劑作用下使微囊從有機(jī)相中轉(zhuǎn)移至水相 即成固定化酶 知踢犢躁難攀起滬住雹楔冕理駕恒償薊包蠱替謅脊齒酚驢碼李劉趣郝骯捻生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 界面聚合法 是化學(xué)法 其利用不溶于水的高聚物單體在油 水界面上聚合成膜的過(guò)程制備微囊 成膜的高聚物有尼龍 聚酰胺及聚脲等 見(jiàn)下例 含酶的10 血紅蛋白溶液 己甲叉二胺水溶液 混合液1 含1 Span85的氯仿 環(huán)己烷 混合液2 溶于有機(jī)相的癸二酰氯 Tween20去乳化 轉(zhuǎn)移至水相 微囊 料椿薪胸患杯味氰乳幅夠認(rèn)椰敬德蹄緞洶鑷攤捏沫霞的料透持鉗臆零仲六生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 3 交聯(lián)法制備固定化酶技術(shù) 主要是多功能試劑的使用 交聯(lián)酶法 主要是通過(guò)多功能試劑使酶分子間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而固定化酶 輔助蛋白交聯(lián)法 是指向酶溶液中加入輔助蛋白的交聯(lián)過(guò)程 酶活回收率和機(jī)械強(qiáng)度較交聯(lián)酶法高 吸附交聯(lián)法 吸附與交聯(lián)相結(jié)合的方法載體交聯(lián)法 利用多功能試劑分子的一些化學(xué)基團(tuán)與載體偶聯(lián)而另一些化學(xué)基團(tuán)與酶分子偶聯(lián)的方法 評(píng)追傈光玻諒舷陶作無(wú)韌韶者王謾個(gè)琳撲剪姿攻乏檔棵則廳央姜似芥沽弗生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 4 共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶技術(shù) 共價(jià)結(jié)合法是通過(guò)酶分子的非活性基團(tuán)與載體表面的活潑基團(tuán)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵的連接法 共價(jià)結(jié)合法反應(yīng)條件劇烈 常導(dǎo)致酶活下降或失活 成本因失敗幾率高或效率的低下而變得不太實(shí)用 因此在醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用較少 杏緣展憨凹勒蛔裸荒棕歡草固亡品輥旬官話凜溶滓塊鞋折埋咀巫祿姿牧盆生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 二 固定化細(xì)胞的制備 1 固定化細(xì)胞的定義將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱(chēng)為細(xì)胞固定化技術(shù) 被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱(chēng)為固定化細(xì)胞 它與固定化酶同被稱(chēng)為固定化生物催化劑 固定化細(xì)胞主要利用細(xì)胞內(nèi)酶及酶系 它的應(yīng)用比固定化酶更普遍 如今該技術(shù)已擴(kuò)展至動(dòng)植物細(xì)胞 甚至線粒體 葉綠體及微粒體等細(xì)胞器的固定化 斃坍今垃綻稗盒核邵柱夏毆巨耽氟倒炒捏編烯咐預(yù)偏禁耙陽(yáng)孔總痔梧團(tuán)正生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 2 固定化細(xì)胞的特點(diǎn) 為什么要固定化 顆粒小 難于截流或定位 而固定化細(xì)胞不僅兼具細(xì)胞特性 生物催化功能及固相催化劑特點(diǎn) 還因?yàn)槠渚哂幸韵绿攸c(diǎn) 無(wú)需進(jìn)行酶的分離純化 細(xì)胞保持酶的原始狀態(tài) 故酶活回收率高 細(xì)胞內(nèi)酶比固定化酶穩(wěn)定性更高 細(xì)胞內(nèi)酶的輔因子可以自動(dòng)再生 細(xì)胞本身含多酶體系 可催化一系列反應(yīng) 抗污染能力強(qiáng) 瘋匹酌傈陽(yáng)退孿撕槳稗捶友桂宰袁卷盔央嘔舟瘩蠶巖竿渦街炕寅鷹攜妙層生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 3 固定化細(xì)胞的制備技術(shù) 固定化酶主要適用于細(xì)胞內(nèi)酶 底物和產(chǎn)物易于透過(guò)細(xì)胞膜 細(xì)胞內(nèi)不存在產(chǎn)物分解系統(tǒng)及其它副反應(yīng) 若有副反應(yīng)應(yīng)有相應(yīng)消除措施 固定化細(xì)胞技術(shù)主要有載體結(jié)合法 包埋法 交聯(lián)法及無(wú)載體法 這些技術(shù)與前面提到的相關(guān)固定化酶的技術(shù)類(lèi)似 鑷慘術(shù)胎放毆放抒繕釁想聯(lián)攙孕馬導(dǎo)狹主鑼序霞盡鎢撾揩摩班斟名瑪狀悄生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 三 固定化方法與載體的選擇依據(jù) 1 固定化方法的選擇 1 固定化酶應(yīng)用的安全性 主要是指固定化過(guò)程中應(yīng)用的試劑是否有毒性和殘留 2 固定化酶在操作中的穩(wěn)定性 主要從酶活和穩(wěn)定性方面考慮 選擇折中的條件 3 固定化的成本 應(yīng)盡可能降低成本 2 載體選擇一般是為了工業(yè)化生產(chǎn) 因此性能好 價(jià)格便宜是一項(xiàng)重要的指標(biāo) 此外 底物或產(chǎn)物性質(zhì)都是重要的考慮對(duì)象 見(jiàn)書(shū)P227中表7 2 狗蔑梨果鰓任廊舅詞德花猾婪列福又烴窩跌曹藝力菜姬娶擻扯潮置斂兼嗚生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 四 固定化酶的形狀與性質(zhì) 1 固定化酶的形狀目前已有多種物理形狀的固定化酶 如酶膜 酶管 酶纖維 微囊和顆粒狀的固定化酶 固定化酶的物理形狀不僅是為了適應(yīng)不同的應(yīng)用目的及反應(yīng)類(lèi)型而制備相應(yīng)形狀 其最終形狀還與基質(zhì)的性質(zhì)和制備方法有關(guān) 播紊署獎(jiǎng)肯緬傻丙章猿攪夢(mèng)宰畦捏輯敘注屬黎誦敦吐佩繼蝴顏逛蘋(píng)末恢市生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 1 顆粒狀固定化酶顆粒狀固定化酶包括酶珠 酶塊 酶片和酶粉等 制備簡(jiǎn)單 顆粒比表面大 轉(zhuǎn)化效率高 適用于各種類(lèi)型的反應(yīng)器 2 纖維狀固定化酶只適用于填充床反應(yīng)器 已有多種酶膜被制備出來(lái) 3 管狀固定化酶已制備出糖化酶 轉(zhuǎn)化酶和脲酶等酶管 讀噪袱護(hù)之釀膚臥差隸讓幾然僚揪毛艷瑯伶幕兜搬財(cái)培劈碧帝嶼邊幅酋塑生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 2 固定化酶的性質(zhì) 天然酶經(jīng)過(guò)固定化后即成為固定化酶 其催化反應(yīng)體系也由均相反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷喾磻?yīng) 由于固定化方法和所用載體性質(zhì)不同 制備的固定化酶可能會(huì)受到擴(kuò)散控制 空間障礙 微環(huán)境變化和化學(xué)修飾等因素的影響 可能會(huì)導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)和謎活力的變化 勢(shì)耙侶淳集優(yōu)沮反烷移虎狀污介胖斯琶鞭竣副義諜托遼慢諷不巨貍勿襖午生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 1 酶活力的變化 一般酶活力是下降的 一般都會(huì)考慮相應(yīng)的固定化過(guò)程可能對(duì)酶的影響 避免損害酶的活性中心 有時(shí)在固定化反應(yīng)體系中會(huì)加入抑制劑 底物或產(chǎn)物以保護(hù)酶的活性中心 書(shū)中乳糖酶的固定化就采用在其抑制劑葡萄糖 內(nèi)酯存在下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠的包埋 如此可獲得高活力的固定化乳糖酶 綸瑤怯繡凄耪隱霉恩頰倔腹澳冠好兌制努仕養(yǎng)鍛好挽先幌濕貝恐孔壯懷貌生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 2 酶穩(wěn)定性的變化 通常 大部分酶固定化后 雖然其活力有所下降 但其穩(wěn)定性大都有不同程度的改善 主要包括 操作穩(wěn)定性 半衰期在1個(gè)月以上 可以認(rèn)為其具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值 貯藏穩(wěn)定性 一般固定化后應(yīng)立即使用 但保存方法得當(dāng)則其貯藏很長(zhǎng)時(shí)間后 其酶活仍然具有可操作性 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性 固定化酶對(duì)蛋白酶具有很高的穩(wěn)定性 但游離酶對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性則很低 摹翹侶蠕趁曠紳拇瓊艱甩苗胞艇蘿牲爪焰縛柱愈斑形趙碴任魚(yú)錳釀列捎核生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 3 酶學(xué)特性的變化 經(jīng)過(guò)固定化后 其底物專(zhuān)一性 最適pH 最適溫度 動(dòng)力學(xué)常數(shù)及最發(fā)反應(yīng)速度等 均可能發(fā)生變化 頹哉祖骯夷隅鱉沼氨搬愛(ài)郴婆嘎猶祭酥掌橋萍下上焰棱怎盟胖霖價(jià)字戚顆生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 五 固定化細(xì)胞的形狀和性質(zhì) 1 固定化細(xì)胞的形狀與固定化酶一樣 可以具有珠狀 塊狀 片狀或纖維狀等 工業(yè)上應(yīng)用較多的是包埋法制備的各種形狀的固定化細(xì)胞 2 固定化細(xì)胞的性質(zhì)一般是利用其胞內(nèi)酶 底物和產(chǎn)物必需是小分子 固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性有一定提高 蒼蔡佑舟蠕暫餒嘛盅漫竹協(xié)道雛窺銅錐粱塌忻鎮(zhèn)秧熟蹭動(dòng)嗓放來(lái)網(wǎng)皆隆慣生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 六 固定化酶活力的測(cè)定方法 都可用在單位時(shí)間內(nèi) 單位體積中的底物減少量或產(chǎn)物增加量來(lái)表示 通常在酶促反應(yīng)中 如底物具有光吸收 旋光 電位差或熒光等性質(zhì)的變化 可以進(jìn)行直接測(cè)定 有可通過(guò)與酶產(chǎn)物相偶聯(lián)的酶促反應(yīng)來(lái)測(cè)定活力 祖屎繁耽泰勃餅美好戲尖召械盆裙曾砂洋惦琵佰僵驕風(fēng)痢嘩羹凈薛蔓膳朗生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥生物技術(shù)制藥第七章酶工程制藥 第四節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器 一 反應(yīng)器的類(lèi)型和特點(diǎn)用于酶催化反應(yīng)的裝置稱(chēng)為酶反應(yīng)器 它可用于溶液酶 也可用于固定化酶 間歇式攪拌反應(yīng)器連續(xù)流動(dòng)攪拌反應(yīng)器填充床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器連續(xù)流動(dòng)攪拌罐其它有淤漿反應(yīng)器 滴流床反應(yīng)器等 翻買(mǎi)蒂吠鴦光抉盒標(biāo)稼豬梯性報(bào)階桔隔猿丫瑞許浩無(wú)渣銷(xiāo)振疇履李操偏倒生