菘藍(lán)葉片離體培養(yǎng)及植株再生-作業(yè).doc

激素對(duì)菘藍(lán)葉片組織培養(yǎng)的影響姓名：張亞洲 專業(yè)：農(nóng)學(xué)（本碩連讀） 班級(jí)：10-1 學(xué)號(hào)：20100099 指導(dǎo)老師：劉帆 倪蘇摘要：本研究以菘藍(lán)葉片為外植體，為了研究不同激素及其組合對(duì)菘藍(lán)離體葉片的生長(zhǎng)的影響，通過(guò)對(duì)離體消毒的菘藍(lán)葉片采用四種不同激素配比的培養(yǎng)基進(jìn)行比較培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在相同濃度的6-BA+NAA培養(yǎng)基中NAA在誘導(dǎo)叢生芽中，適宜低濃度的NAA有助于叢生芽的發(fā)生且叢生芽誘導(dǎo)效果好，生長(zhǎng)健壯，并在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)隨著濃度的升高對(duì)叢生芽的生長(zhǎng)的抑制作用加強(qiáng)；在相同濃度的2,4-D+KT培養(yǎng)基中，2,4-D對(duì)菘藍(lán)葉的愈傷組織的形成有一定的抑制作用，并且對(duì)于叢生芽的形成也有較強(qiáng)的抑制作用。但對(duì)于其最強(qiáng)的抑制誘導(dǎo)叢生芽和愈傷組織的濃度還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。關(guān)鍵詞：菘藍(lán)葉片；激素配比；比較培養(yǎng)；愈傷組織；芽。 菘藍(lán)( Isatis indigotica Fort. )是常用中藥板藍(lán)根和大青葉的主要來(lái)源植物，具有清熱解毒、涼血利咽、解熱、抗炎的功效，廣泛用于各種方劑1。以往對(duì)菘藍(lán)的研究多集中于其根板藍(lán)根化學(xué)成分和藥理作用(7,8,10）。但由于板藍(lán)根作為一種用量極大且長(zhǎng)期銷售不衰的藥材，市場(chǎng)需求很大。迫切需要生產(chǎn)大量且無(wú)病毒植株來(lái)滿足市場(chǎng)需求，因此人們逐步將植物組織培養(yǎng)這一新技術(shù)應(yīng)用與菘藍(lán)根。有關(guān)菘藍(lán)的組織培養(yǎng)前人已經(jīng)做了一些階段性研究11,12,如余紹華用菘藍(lán)嫩葉、葉柄和嫩莖為外植體2，陳秋芳、孟玉玲等以葉片作外植體，陳薇等以下胚軸為外植體建立了菘藍(lán)的快速繁殖體系3-5，張勝珍研究了菘藍(lán)葉片原生質(zhì)體的游離、純化6，張菊紅等9應(yīng)用正交設(shè)計(jì)方法,對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化篩選。本研究，將針對(duì)離體消毒的菘藍(lán)葉片采用四種不同激素配比的培養(yǎng)基進(jìn)行比較培養(yǎng),觀察不同激素配比對(duì)菘藍(lán)葉片愈傷組織的形成和芽的分化的影響，對(duì)其誘導(dǎo)分化的速度和誘導(dǎo)率進(jìn)行分析，從而為進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有對(duì)菘藍(lán)的組織培養(yǎng)技術(shù)提供重要的參考依據(jù)。1 材料與方法1.1 供試材料菘藍(lán)幼葉：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理系提供。1.2 試驗(yàn)方法 1.2.1 材料處理剪取生長(zhǎng)正常的菘藍(lán)葉片3-4cm，用紗布包好，置流水下沖洗20-30min。在已滅菌的超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精消毒10s，無(wú)菌水水漂洗3次；再用0.1%升汞進(jìn)行消毒10min，每隔1分鐘輕輕震蕩一次，再用無(wú)菌水漂洗4次，消毒完成后用將材料放在已消毒的無(wú)菌皿上待用。1.2.2 接種 用消過(guò)毒的手術(shù)刀切取已處理好的菘藍(lán)葉片0.30.5cm左右的小片，再用鑷子，取3片接種到滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基上（MS培養(yǎng)基/500ml：大量元素/50mL、微量元素/5mL、微量元素/0.5mL、鐵鹽/5mL、有機(jī)物/0.5mL、甘氨酸/1mL、肌醇/50mg），封口。1.2.3 培養(yǎng)觀察 先進(jìn)行一周后的黑暗培養(yǎng)，再將菘藍(lán)葉片轉(zhuǎn)入不同激素組合的離體培養(yǎng)基（表 1）中，放在1500lx-1800lx的光照（14小時(shí)/天），252的條件下培養(yǎng)。兩周后取生長(zhǎng)良好的與菘藍(lán)幼葉的瘀傷組織接種到已滅菌的繼代培養(yǎng)基配培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)基/500ml：蔗糖/15g、瓊脂/2.5g、肌醇/50mg、MS/50mL、6-BA/1mg、NAA/0.25mg，pH為5.8），放在1500lx-1800lx的光照（14小時(shí)/天），252的條件下培養(yǎng)。觀察，并記錄數(shù)據(jù)。表1 不同激素組合培養(yǎng)基（500ml）組別蔗糖/g瓊脂/g肌醇/mg不同激素組合培養(yǎng)基2152.550MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L3152.550MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L4152.550MS+2,4-D 1.0 mg/L +KT 0.5 mg/L5152.550MS+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L （注：配制好后，調(diào)pH為5.8，高壓滅菌后備用）1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 記錄培養(yǎng)不同培養(yǎng)基組合對(duì)菘藍(lán)葉片的啟動(dòng)效果（污染數(shù)、存活數(shù)），以及觀察葉片形態(tài)變化狀況。2 結(jié)果與分析通過(guò)記錄不同培養(yǎng)基中菘藍(lán)葉片的存活率以及死亡原因如表2，發(fā)現(xiàn)2號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基真菌的平均污染率為1.4%相比3號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基的平均污染率6.51%出現(xiàn)較低；方差分析結(jié)果數(shù)據(jù)無(wú)問(wèn)題，平均真菌感染率為4.0%，但對(duì)于造成這種規(guī)律的原有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。通過(guò)對(duì)細(xì)菌污染率進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，5號(hào)培養(yǎng)基差異顯著，故5號(hào)培養(yǎng)基不能作為分析數(shù)據(jù)，求剩余數(shù)據(jù)的平均值，得出該試驗(yàn)細(xì)菌感染率為3.3%。通過(guò)記錄培養(yǎng)不同培養(yǎng)基組合對(duì)菘藍(lán)葉片的啟動(dòng)效果，得出表2數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不同種類的激素和激素配比對(duì)菘藍(lán)幼葉片的分化效率有一定的影響。通過(guò)觀察2號(hào)培養(yǎng)基菘藍(lán)葉片在添加了NAA和6-BA的MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周左右的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)葉片開(kāi)始增厚一腫脹一鼓起，21d左右有不定芽原基從葉片邊緣產(chǎn)生(圖1中2號(hào))，34d不定芽高度可以達(dá)到3-4cm(圖1中2號(hào))。而觀察不同培養(yǎng)基組合的菘藍(lán)葉片離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況（如表2與圖1）。通過(guò)整體對(duì)比可以看出2號(hào)和號(hào)培養(yǎng)基的激素配比最適合菘藍(lán)誘導(dǎo)叢生芽的離體培養(yǎng)，4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基最適合菘藍(lán)誘導(dǎo)愈傷組織的離體培養(yǎng)。通過(guò)2號(hào)與3號(hào)培養(yǎng)基片相比誘導(dǎo)出較多的叢生芽，叢生芽多而繁、高而細(xì)，2號(hào)只有少數(shù)生芽點(diǎn)出現(xiàn)，大多數(shù)矮而胖，總的來(lái)說(shuō)2號(hào)的比3號(hào)長(zhǎng)勢(shì)要好，一方面表明2號(hào)（MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L）的培養(yǎng)基更有利于誘導(dǎo)出叢生芽，誘導(dǎo)出的叢生芽健壯，個(gè)體較大；另一方面表明隨著NAA濃度的下降，叢生芽誘導(dǎo)數(shù)量及生長(zhǎng)狀況有下降趨勢(shì)。通過(guò)4號(hào)與5號(hào)培養(yǎng)基片相比，4號(hào)培養(yǎng)基也有叢生芽誘導(dǎo)出，但是都很小，肉眼要仔細(xì)觀察才能觀察到，其主要表現(xiàn)在于出現(xiàn)了較多的愈傷組織；而5號(hào)只有葉片卷曲，少數(shù)膨脹，有些邊緣發(fā)黑，愈傷組織很少。從而表明4號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)情況比5號(hào)培養(yǎng)基的好,而叢生芽生長(zhǎng)隨2.4-D濃度的升高而加強(qiáng)。圖1. 離體培養(yǎng)菘藍(lán)葉片葉片形態(tài)序號(hào)接種數(shù)/個(gè)污染數(shù)/支污染率/%存活數(shù)存活率葉片形態(tài)觀察真菌細(xì)菌真菌細(xì)菌2280103.572692.86葉片膨大，卷曲，增厚有20個(gè)重生芽出現(xiàn)328217.143.572589.28葉片膨大，卷曲，增厚有10個(gè)重生芽點(diǎn)出現(xiàn)435112.82.83394.29葉片卷曲變大有愈傷組織形成534225.885.882985.29葉片卷曲，葉緣變黃或變褐有愈傷組織形成表2.不同培養(yǎng)基組合啟動(dòng)效果觀察統(tǒng)計(jì)3 結(jié)論與討論 植株組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得無(wú)毒植物的重要方法，是植物生物工程技術(shù)研究的基礎(chǔ)，而植株組織培養(yǎng)是一個(gè)復(fù)雜的技術(shù)體系，與植株本身的激素水平和培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度密切相關(guān)。在組織培養(yǎng)中，人們常用生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)已分化細(xì)胞脫分化。2，4-D一般有利于愈傷組織的形成，但對(duì)芽的分化有強(qiáng)烈的抑制作用，本試驗(yàn)材料也不例外，在加入2，4一D的培養(yǎng)基上，不能誘導(dǎo)出不定芽，即使再加入6-BA也不行。NAA和2，4一D都是生長(zhǎng)素類物質(zhì)，單純的NAA或與6-BA組合，都可以誘導(dǎo)不定芽的分化。胡東楠等13，認(rèn)為隨著培養(yǎng)基中6-BA與NAA相對(duì)比例的升高，不定芽的分化率會(huì)增高。在本試驗(yàn)中，當(dāng)NAA l.0mg/L，6-BA 0.5mg/L時(shí)分化率較高，NAA為0.5 mg/L時(shí)的誘導(dǎo)率均低于6-BA為0.1 mg/L時(shí)分化率。且叢生芽生長(zhǎng)健壯。同時(shí)也得出2，4-D在同等的KT的培養(yǎng)基上，低濃度的2，4-D更有利于愈傷組織的生長(zhǎng)，因此2，4-D對(duì)愈傷組織有一定的生長(zhǎng)抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，菘藍(lán)葉片不易通過(guò)愈傷組織發(fā)生不定芽，可以不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段直接誘導(dǎo)發(fā)生叢生芽，在誘導(dǎo)叢生芽時(shí)，不但要考慮誘導(dǎo)污染率的問(wèn)題，同時(shí)也應(yīng)該考慮誘導(dǎo)分化形態(tài)發(fā)育程度。在以菘藍(lán)葉片為外植體誘導(dǎo)叢生芽時(shí)，得出在相同濃度的6-BA+NAA培養(yǎng)基中NAA在誘導(dǎo)叢生芽中，適宜低濃度的NAA有助于叢生芽的發(fā)生且叢生芽誘導(dǎo)效果好，生長(zhǎng)健壯，并在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)隨著濃度的升高對(duì)叢生芽的生長(zhǎng)的抑制作用加強(qiáng)；在相同濃度的2,4-D+KT培養(yǎng)基中，2,4-D對(duì)菘藍(lán)葉的愈傷組織的形成有一定的抑制作用，并且對(duì)于叢生芽的形成也有較強(qiáng)的抑制作用。但對(duì)于其最強(qiáng)的抑制誘導(dǎo)叢生芽和愈傷組織的濃度還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)：1 張潤(rùn)珍, 張玉文. 板藍(lán)根的研究進(jìn)展J. 中草藥, 2000, 31(6): 474-476.2 余紹華. 菘藍(lán)的組織培養(yǎng)J. 四川師范學(xué)院學(xué)報(bào), 1991, 12(4): 358-361.3 陳秋芳, 群策, 秦廣雍. 菘藍(lán)葉片離體培養(yǎng)與試管無(wú)性系的建立J. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 38(12):98-100.4 孟玉玲. 菘藍(lán)子葉直接誘導(dǎo)叢生芽J. 中草藥, 1995, 20(1): 52.5 陳薇, 杜利云, 寸守銑, 等. 菘藍(lán)下胚軸組織離體培養(yǎng)J. 藥學(xué)實(shí)踐雜志, 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