【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）不同成熟度烤煙葉片超微結構及生理生化特性研究作物栽培與耕作學碩士論文

密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 不同成熟度 烤煙 葉片 超微 結構 及生理 生化 特性 研究 on of on of I 摘 要 應用透射電子顯微鏡 對 不同成熟度烤煙 葉片細胞超微結構 進 行 觀察 ,結合生理生化指標分析， 發(fā)現(xiàn) 變化 主要表現(xiàn)在以下幾個方面： 胞進入衰老期后 最早和 最 明顯的現(xiàn)象；線粒體 和 細胞核保持功能至衰老后期；質膜是最后發(fā)生裂解的細胞器，這種高度有序的 結構 喪失可以保證衰老細胞代謝所需能量 的 要求。在葉片成熟的過程中，葉綠體的超微結構變化最明顯，且葉綠體發(fā)育不同步，前質體以及處于不同發(fā)育時期的葉綠體出現(xiàn)在同一細胞中。成熟期由于淀粉粒發(fā)育充盈導致葉綠體形狀不規(guī)則。 葉片衰老 的 過程中，淀粉粒數(shù)量逐漸增多，體積也明顯膨大， 淀粉粒的粘性增加 。 在成熟后期，淀粉粒把 葉綠體的被膜撐破，發(fā)生了游離。觀察發(fā)現(xiàn)， 欠熟期低 片層數(shù)基粒 片層 （ 片層數(shù) 10） 占統(tǒng)計基粒 片層 數(shù) 的 而過熟期 低 片層數(shù) 基粒 片層 （片層數(shù) 10）占統(tǒng)計基粒 片層 數(shù)的 由此可以明顯的看出葉綠體基粒垛疊在衰老過程中的變化 。 主要集中在嵴數(shù)的變化上，成熟后期，線粒體 嵴數(shù)明顯減少， 大部分內膜已經破裂， 內部可供呼吸作用的面積減少，呼吸強度降低。 粒體 多 圍繞在葉綠體周圍，但是分布并不均勻，分布在近壁一側的要多于內側 ； 成熟后期， 則呈現(xiàn)無規(guī)律的不均勻分布 ，說明前期質膜需要更多的能量來維持生理功能 。 發(fā)現(xiàn)過氧化物體 , 后期在葉綠體和 線粒體上出現(xiàn) 了很多電子致密物， 同 時 細胞核異染色質化程度加深，說明此時的細胞已經進入 程序化死亡 階段 。 葉綠素是受葉片衰老影響最顯著的指標 ， 葉片成熟 期， 葉綠體 片層結構的 破壞， 從而引發(fā)了整個細胞衰老 。 關鍵詞 ： 烤煙 ， 衰老 ， 超微結構 ，生理生化特性 he on of by on of as 1 of in of of to be of of be in of to of C，由此分析表明， 作為外觀指標衡量是比較合適的。 士學位論文 第四章葉片超微結構與生理生化特性的關系分析 32 第 四 章 葉片超微結構與 生理生化特性 的關系 分析 從 不同成熟度 煙葉 細胞超微結構 的 復雜程度來看， 欠熟期葉片 的葉綠體超微結構最復雜，具體表現(xiàn)在基粒片層多，基質濃厚，多片層基粒所占比例較大， 適熟期 葉次之，而 過熟期 葉 片 的 超微結構 則表現(xiàn)的 相對簡單 。煙葉成熟期間總氮與葉綠素、煙堿和可溶 性蛋白之間的相關性分析顯示總氮與葉綠素和煙堿含量極顯著相關，而與可溶性蛋白相關不顯著。 葉綠素有助于煙堿對總氮的貢獻，而煙堿卻不利于葉綠素對總氮的貢獻，即從氮代謝的角度看這個過程是單向的，這與 葉綠體 的 變化是細胞器中變化最明顯的這一結論 是 一致的。同時，線粒體也表現(xiàn)出與葉綠體相似的變化規(guī)律，結合葉綠素含量分析表明，三個部位的葉綠素含量變化規(guī)律與 葉綠體 超微結構變化規(guī)律相一致 ， 這與 粒片層垛疊復雜程度與葉綠體的含量是直接相關的”結論一致。 烤煙在 欠熟到過熟的生育期內，葉綠素含量逐漸減少，這是電鏡觀察 中葉綠體基粒片層垛疊數(shù)分布規(guī)律的反映，同時也是細胞超微結構復雜程度的反映，觀察表明，從欠熟期到過熟期，葉綠體垛疊明顯出現(xiàn)松散的趨勢，表現(xiàn)在基粒片層數(shù)的下降，片層結構的崩潰，基質濃度下降，片層內嗜鋨顆粒增加，后期更是出現(xiàn)了葉綠體被膜的破裂的情況。 過熟期 片層結構松散 ， 葉片葉綠體低 片層數(shù) 基粒所占比例遠遠大于欠熟和適熟葉片， 欠熟期低 片層數(shù) 基粒 片層 （片層數(shù) 10）占統(tǒng)計基粒 片層 數(shù)的 而過熟期低 片層數(shù) 基粒 片層 （片層數(shù) 10）占統(tǒng)計基粒 片層 由此可以明顯的看出葉綠體基粒垛疊在衰老過程中的變化 ， 說明過熟葉片的葉綠體內膜系統(tǒng) 功能 相對于欠熟和適熟已經下降，而適熟和過熟期葉綠體基粒片層數(shù)大于 20 的已經很少，說明其葉綠體內膜系統(tǒng)已經不發(fā)達 ，被膜破裂，同時淀粉粒逐漸發(fā)育充盈，最后撐破葉綠體被膜游離到細胞中部。同時 觀察還發(fā)現(xiàn)，基粒片層的變化不僅僅表現(xiàn)在垛疊層數(shù)的變化上，其單個類囊體的長度也發(fā)生了明顯的變化，通過對不同時期各 50 個葉綠體的類囊體進行觀察，其平均長度從苗期的 降到欠熟期的 了過熟期由于結構的崩潰很多葉綠體內已經沒有整齊的垛疊 。 說明 葉綠體 基粒片層垛疊的程度與葉 綠體內葉綠素總含量是直接相關的，垛疊整齊、單個垛疊片層數(shù)多且類囊體長的處理葉綠素含量較高，反之葉綠素含量則較低。 適熟期的基粒片層垛疊變化較為明顯，明顯的觀察到了片層之間的離散，大部分葉綠體已經開始失去其清晰的片層結構，嗜鋨體小球相對 較多 ，說明葉綠體開始解體，光合作用不如前一段時間強，此階段有機物質積累速度減慢，葉片的衰老 速度 加快，將 此時的 取樣時間縮短，更加詳細的分析葉肉細胞的超微形態(tài)變化將為人工控制葉片衰老過程提供重要依據。而過熟期葉綠體出現(xiàn)明顯的空泡，垛疊基本上已經離解，大部分的葉綠體呈松散的結構，垛疊 片層離散，片層結構紊亂，出現(xiàn)空泡，有的只能觀察到殘留的片層，而有的已經觀察不到有基粒的存在，這一現(xiàn)象反映了此階段 是 葉綠體急劇衰老期，即衰老末期。 同時，細胞核異染色質化程度加深。以上細胞的超微結構變化表明，細胞在葉片進入成熟期后已經開始進入程序化死亡階段，到過熟期程序化死亡的特征更為明顯，細胞個體的衰老與葉片的衰老是緊密相連的。 本研究通過對葉片細胞超微結構觀察證明，葉綠體 整齊片層結構的 喪失是細胞進入衰老期后 最早和 最 明顯的現(xiàn)象 ， 線粒體 和細胞 核保持功能至衰老后期 ， 質膜是最后發(fā)生裂解的細胞器，這種高度有序的 結構 喪 失可以保證衰老細胞代謝所需能量 的 要求。 這與李寒冰等觀察小麥芒和旗葉葉綠體結構的結果較一致 ，即 葉綠體 生理 活性強 時， 基粒垛疊整齊，基質濃厚， 士學位論文 第四章葉片超微結構與生理生化特性的關系分析 33 易形成突起；線粒體嵴發(fā)達，充滿濃厚基質。但當葉綠體衰老時，可溶核糖核酸 (蛋白質含量下降， 化酶活力下降顯著，繼而葉綠素消退，核糖體解體，片層膜破碎分解，嗜鋨顆粒增加，葉綠體退化收縮，體積變小，數(shù)量減少，或轉化為其它有色體。姬生棟等在研究小麥旗葉 的 衰老過程中也觀察到此現(xiàn)象，認為這些結構特征是導致葉片光合速率迅速降低的原因，而水稻研究中則認為光合 活性降低的主要原因是由于葉綠體中某些蛋白質的降解。 對葉綠體基粒片層數(shù)的顯著性分析顯示 烤煙 葉片葉綠體的超微結構在不同成熟時期有顯著的變化， 而 葉綠素含量隨著成熟度的加深也 開始 下降，說明了葉綠體 基粒片層垛疊的程度與葉綠體內葉綠素總含量是直接相關的 。 董建華等在研究水稻和稗草葉片葉綠體基粒片層與葉綠素含量、光合速率間的關系時認為葉綠體的光合膜發(fā)達的品種，其葉綠素含量和光合速率較高。馬國英等研究了不同小麥品種葉片葉綠體超微結構與葉片葉綠素含量、光合速率的相互關系，得出了相同的結論。 在過熟期，丙二醛含量出現(xiàn)較 大幅度的增加，這與電鏡觀察到的成熟后期葉綠體內嗜鋨顆粒的增加和電子致密物的增多的情況一致。對 不同成熟度葉片的葉綠素、煙堿、總氮進行定量分析 ，結果表明，葉綠素對總氮的影響主要是直接的，而煙堿雖然對總氮的影響達到極顯著，但直接影響的作用不顯著；可溶性蛋白含量雖然很大，但對總氮的影響不顯著。 電鏡觀察中，不同 成熟度 葉片細胞超微結構變化最明顯的就是葉綠體，經過比較， 欠熟期 上部葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量都高于中部和下部葉片，但到了過熟期，上部葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量則略低于中部和下部葉片，上部葉的丙二醛含量一直高于 中部和下部葉，說明上部葉在成熟過程中各方面的變化較大，這與觀察到的上部葉片 超微 結構比中部和下部葉復雜的規(guī)律是一致的。 線粒體的超微結構變化規(guī)律與葉綠體相似，但是變化沒有葉綠體明顯。由于線粒體是進行呼吸作用的細胞器，伴隨著線粒體內膜系統(tǒng)的崩潰，細胞的呼吸作用水平也隨之下降。 呼吸作用釋放的能量除一部分轉變?yōu)闊崮鼙簧⑹У敉猓蟛糠謩t以 形式貯存起來，供生命活動利用。呼吸作用在分解有機物質的過程中產生了許多中間產物，其中有些中間產物的化學性質非?；钴S，如丙酮酸、 果酸等，它們是合成核酸、蛋 白質、糖以及其它物質的原料。而線粒體則是進行呼吸作用的主要場所，所以線粒體的功能直接影響了細胞的生理狀態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)苗期線粒體很不發(fā)達， 進入成熟期，線粒體發(fā)生了很大的變化。欠熟期，線粒體處于發(fā)育較好的狀態(tài)，個數(shù)增多，分布于葉綠體周圍，分布不均勻，有聚集的現(xiàn)象出現(xiàn)，大小不一，有的較大，有的體積不大但是結構 較好 ， 個別 體積較小的線粒體嵴數(shù)還比體積大的嵴數(shù)還要多，說明線粒體的功能并不能簡單的用其體積大小來進行比較。適熟期 線粒體 個數(shù)沒有明顯的減少，其變化主要集中在嵴數(shù)的變化上，這一時期，線粒體的嵴數(shù)明顯降低，說明這一時 期線粒體的內膜開始破裂，呼吸作用的水平下降，反映出此時細胞的代謝強度下降。而到了成熟后期，線粒體結構崩潰，觀察到的嵴已經很少 ，說明此時的線粒體大部分內膜已經破裂，內部可供呼吸作用的內膜面積 也有一定的下降。同時，細胞葉綠體被膜大部分也已經破裂，大淀粉粒游離到細胞中部，這時的細胞內部結構比較混亂，細胞內容物沒有規(guī)律的分布在細胞里。 對 超氧化物歧化酶（ 過氧化物酶（ 可溶性蛋白（ 丙二醛（ 葉綠素（ 淀粉酶（ 淀粉（ C% 、 N、 P、 K、還原糖（ 總糖（ 總植物堿（ 相應的幾個比值等 18 個指標進行的 主成分特征負荷量與典型相關系數(shù)分析 士學位論文 第四章葉片超微結構與生理生化特性的關系分析 34 結合煙葉成熟衰老的發(fā)育規(guī)律發(fā)現(xiàn) ， 決定第一主成分的主要是 C、 N/S、 N、P、 A，決定第二主成分的主要是 定第三主成分的主要是 一主成分 指向 葉綠體解體 、 碳氮代謝 和 總植物堿合成代謝，第二主成分 指向 淀粉降解有關的可溶性糖積累，第三主成分 指向 煙葉膜質過氧化的過程。綜合結果表明：煙葉的成熟衰老主要由于葉綠體解體、植物堿合成 代謝造成 ， 而最后才是膜脂過氧化的作用，其對煙葉衰老 的影響是深刻而不可逆的。 典型相關分析結果表明，在葉綠體解體與總植物堿合成代謝的關系中，第一對典型變量主要由 A 相關，第二對典型變量主要由 C/N 相關，第三對典型變量補充反應了 S/相關。在葉綠體解體與可溶性糖積累代謝的關系中，第一對典型變量主要由 C 和 二、三對典型變量主要由 C 和 相關。 烤 煙成熟期間總氮與葉綠素、煙堿和可溶性蛋白之間的相關性分析顯示總氮與葉綠素和煙堿含量極顯著相關，而與可溶性蛋白相關不顯著。 葉綠素含量對總氮含量的貢獻主要是直接作用，高達 可溶性蛋白含量直接作用僅占 從間接作用看，葉綠素含量通過煙堿對總氮含量的作用達 而煙堿通過葉綠素對總氮的貢獻為 說明葉綠素有助于煙堿對總氮的貢獻，而煙堿卻不利于葉綠素對總氮的貢獻。 結 合 電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，葉綠體整齊片層結構的喪失是 細胞進入衰老期 最早和最明顯的現(xiàn)象，而后期嗜鋨體小球和電子致密物的明顯增多表明質膜是最后發(fā)生裂解的細胞器。對葉綠素 A、葉綠素 B、 總葉綠素 、 類胡蘿卜素和丙二醛進行主成分分析的結果也顯示反映葉綠體狀態(tài)的葉綠素含量受衰老的影響大于反映細胞膜狀態(tài)的丙二醛。 士學位論文 第五章結論 35 第 五 章 結論 本論文主要研究了不同成熟度烤煙葉片的超微結構特征， 結合生理生化指標分析，主要結論如下： 葉綠體基粒整齊片層結構的喪失 是 細胞進入衰老期后 最早和 最 明顯的現(xiàn)象 ， 線粒體 和 核保持功能至衰老后期 ， 質膜是最后發(fā)生裂解的細胞器，這種高度有序的 結構 喪失可以保證衰老細胞代謝所需能量 的 要求。 微結構特征及其變化規(guī)律 煙草成熟過程中，葉 肉細胞 超微結構 變化最明顯的是葉綠體，主要表現(xiàn)在片層結構松散 ， 過熟 期 葉片葉綠體低 片層數(shù) 基粒所占比例遠遠大于欠熟和適熟葉片， 欠熟期低 片層數(shù) 基粒 片層 （片層數(shù) 10）占統(tǒng)計基粒 片層 數(shù)的 而過熟期低 片層數(shù) 基粒 片層 （片層數(shù) 10）占統(tǒng)計基粒片層 數(shù)的 說明過熟 期 葉片的葉綠體內膜系統(tǒng) 功能 相對于欠熟和適熟來講已經下降，而適熟 期 和過熟期葉綠體基粒片層數(shù)大于 20的已經很少，說明其葉綠體內膜系統(tǒng)已經不發(fā)達 ，被膜破裂，同時淀粉粒逐漸發(fā)育充盈，最后撐破葉綠體被膜游離到細胞中部 。同時觀察還發(fā)現(xiàn)，其單個類囊體的平均長度從苗期的 降到欠熟期的 了過熟期由于葉綠體結構的崩潰很多葉綠體內已經沒有 整齊 的垛疊 。 結構特征及其變化規(guī)律 線粒體 的 變化主要集中在嵴數(shù)的變化上，成熟后期，線粒體嵴數(shù)明顯減少，大部分內膜已經破裂， 內部可供呼吸作用的面積減少，呼吸強度降低。 粒體多圍繞在葉綠體周圍分布，但是分布并不均勻，分布在近壁一側的要多于內側；成熟后期，則呈現(xiàn)無規(guī)律的不均勻分布，說明前期質膜需要更多的能量來維持生理功能。 而且后期在葉綠體和線粒體上出現(xiàn) 了很多電子致密物，同時細胞核異染色質化程度加深，說明此時的細胞已經進入程序化死亡 階段 。 綠素是受葉片衰老影響最顯著的指標，葉片成熟期，葉綠體片層結構的破壞，從而引發(fā)了整個細胞衰老。 對 18個指標進行測定 并 結合煙葉成熟衰老的發(fā)育規(guī)律 分析發(fā)現(xiàn)， 煙葉的衰老首先是葉綠素降解，碳水化合物的轉化，隨后是總植物堿的合成、蛋白質降解，然后是可溶性糖含量的上升，最后是膜質過氧化過程 ，其對煙葉的衰老影響是深刻而不可逆的，并最終造成了 細胞 的死亡。 烤 煙 在 欠熟到過熟的生育期內，葉綠素含量逐漸減少，這是 電鏡觀察中葉綠體基粒片層低垛疊數(shù)分布規(guī)律的反映，表明衰老的細胞復雜程度下降，在過熟期，丙二醛含量出現(xiàn)較大幅度的增加，而此時細胞內的嗜鋨顆粒和電子密集物也明顯增多， 細胞核異染色質化程度加深， 說明了在這一時期，細胞膜系統(tǒng)已經崩潰，細胞的生理活性隨著其衰老程度的加深呈下降的趨勢 ，細胞已經進入程序化死亡 階段 。 綜合以上結果表明， 烤 煙葉片在衰老過程中最早發(fā)生變化的是葉綠體，其結構和葉綠素含量發(fā)生了明顯的變化，而質膜則是最后發(fā)生裂解的細胞器。 士學位論文 圖版 36 圖版 圖版說明 W 胞壁， CE 綠體被膜， P 粉粒 L 粒片層 E N 胞核 M 粒體 C 氧化物酶體 圖版： 1 苗期，示葉綠體沿細胞壁整齊排列。 2 苗期葉綠體，示基粒整齊的片層結構。 3 苗期 ，示不同發(fā)育時期的葉綠體。 4 欠熟期葉綠體，示類囊體垛疊。 5 欠熟期葉綠體，示垛疊整齊的基粒和線粒體 。 6 欠熟期葉綠體，示 大淀粉粒和小淀粉粒。 m ： 1 2 of 3 of 4 of 5 of 6 of m 士學位論文 圖版 37 圖版 圖版： 1 欠熟期葉綠體，示略有松散的片層排列。 2 適熟期葉綠 體 ，示基粒類囊體垛疊松散。 3 適熟期葉綠體 ，示連接基粒的類囊體。 4 適熟期葉綠體 ，示淀粉粒膨大后發(fā)生游離。 5 過熟期葉綠體， 示葉綠體片層出現(xiàn)空泡。6 過熟期葉綠體 ，示出現(xiàn)空泡的葉綠體和線粒體。 m 1 of 2 of 3of 4 of 5 of of 6 of of m 士學位論文 圖版 38 圖版 圖版： 1 過熟期葉綠體 ，示出現(xiàn)空泡的葉綠體、線粒體和電子致密物。 2 過熟期葉綠體 ，示片層溶解后的殘留部分。 3 過熟期葉綠體 ，示淀粉粒膨大后游離到細胞中部。 4 過熟期葉綠體 ，示后期仍有新的淀粉粒形成。 5 苗期 ，示不發(fā)達的線粒體。 6 欠熟期 ，示結構發(fā)達的線粒體。 m 1 of a of of 2 of of 3 of in of of 5 6 of m 士學位論文 圖版 39 圖版 圖版： 1 適熟期 ，示內膜溶解的線粒體和葉綠體上的電子致密物。 2 適熟期 ，示出現(xiàn)空泡的線粒體。 3 過熟期 ，示內膜溶解的線粒體。 4 過熟期 ，示 高度 異染色質化的細 胞核。 5 過熟期 ，示線粒體上的電子致密物。 6 過熟期 ，示葉綠體上的電子致密物。 m 1 of of 2 of 3 4 5 of of 6 of of m 士學位論文 圖版 40 圖版 圖版： 1 過熟期，示葉綠體被膜上的電子致密物 。 2 過熟期 ，示葉綠體和線粒體上的錐形電子致密物 。 3 適熟期 ，示過氧化物酶體 。 4 適 熟期 ，示過氧化物酶體。 m 1 of of of of 士學位論文 參考文獻 41 參考文獻 1. 陳瑞泰主編 . 中國煙草栽培學 M. 上海：上?？茖W技術出版社， 11。 2. 陳淑珍 ,高致明 , 馬長力 ， 等 . 煙草葉片腺毛發(fā)育及其分泌活動對煙葉品質的影響 J. 煙草科技， 1993,4： 3236。 3. 陳少裕 . 甘蔗葉片衰老與膜脂過氧化 J. 作物學報， 1992,18(2) : 111115。 4. 陳逸鵬，林凱，江豪 . 烤煙煙葉成熟的外觀特征研究 I 煙葉成熟度與葉齡的關系 J1997, 5： 1314。 5. 陳逸鵬，林凱，江豪 葉成熟度與葉片結構的關系 J1997, 2： 3940。 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