蛋白復(fù)習總結(jié)

1 蛋白質(zhì)測序策略 蛋白質(zhì)測序策略 確定蛋白質(zhì)的純度在 97 以上 測定多肽鏈的數(shù)目 拆分多肽鏈 分析每一條多肽鏈的氨基酸組成 鑒定多肽鏈的 N 末端和 C 末端氨基酸殘基 用兩種以上方法把多肽鏈裂解成較小的肽段 測定各肽段的氨基酸序列 把各肽段拼接成完整的多肽鏈 確定二硫鍵的位置 2 蛋白質(zhì)組學的研究特點 蛋白質(zhì)組學的研究特點 同一性與多樣性 有限與無限 靜態(tài)與動態(tài) 時間與空間 孤立行為與相互作用 單一手段和多種技術(shù) 互補與互助 3 蛋白質(zhì)組學研究任務(wù) 蛋白質(zhì)組學研究任務(wù) 內(nèi)容 內(nèi)容 了解某種特定的細胞 組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類 明確各種蛋白質(zhì)分子是如何 讓形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)的 描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu) 揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部分 如 與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位 當前任務(wù) 當前任務(wù) 發(fā)展高通量 高靈敏度 高準確性的研究技術(shù)平臺 研究目的 研究目的 分離蛋白 顯示差異 將表現(xiàn)型與功能聯(lián)系起來 尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用 動態(tài)地反映生物體所處的狀態(tài) 4 蛋白質(zhì)組學研究的兩種策略 蛋白質(zhì)組學研究的兩種策略 1 竭澤法 采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多的乃至全部的蛋白質(zhì) 2 功能法 研究不同時期細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的變化 如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表 達 以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標 5 蛋白質(zhì)化學和蛋白質(zhì)組學的不同蛋白質(zhì)化學和蛋白質(zhì)組學的不同 蛋白質(zhì)化學 蛋白質(zhì)組學 單一蛋白質(zhì) 復(fù)雜混合物 全序列分析 部分序列分析 強調(diào)結(jié)構(gòu)與功能 強調(diào)通過數(shù)據(jù)庫匹配進行蛋白質(zhì)鑒定 結(jié)構(gòu)生物學 系統(tǒng)生物學 6 氨基酸的分類及結(jié)構(gòu)特點氨基酸的分類及結(jié)構(gòu)特點 1 非極性 R 基氨基酸 Ala Val Leu Ile Pro Phe Trp Met 共 8 種 這類氨基酸 在水中的溶解度較小 2 極性 R 基氨基酸 不帶電荷的極性 R 基氨基酸 Ser Thr Tyr Asn Gln Cys Gly 帶正電荷的 R 基氨基酸 Lys Arg His 帶負電荷的 R 基氨基酸 Asp Glu 7 脂肪族氨基酸 脂肪族氨基酸 甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 纈氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 異亮氨酸 Ileucine 亞氨基酸 亞氨基酸 脯氨酸 Proline 含硫氨基酸含硫氨基酸 甲硫氨酸 Methionine 半胱氨酸 Cysteine 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trytophan 堿性氨基酸堿性氨基酸 精氨酸 Arginine 賴氨酸 Lysine 組氨酸 Histidine 酸性氨基酸酸性氨基酸 天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate 含羥基氨基酸含羥基氨基酸 絲氨酸 Serine 含酰胺氨基酸含酰胺氨基酸 天冬酰胺 Asnaragine 谷氨酰胺 Glutamine 8 殘基 殘基 在肽鏈中氨基酸之間脫去一個水分子 脫水后的殘余部分叫殘基 residue 因 此蛋白質(zhì)肽鏈中的氨基酸統(tǒng)統(tǒng)是殘基形式 9 氨基酸的特性氨基酸的特性 一般一氨基一羧基的氨基酸等電點在 pH 6 左右 這是由于羧基的解離 程度大于氨基 故 pI 偏酸 堿性氨基酸 pI 在 pH 10 左右 酸性氨基酸的 pI 在 pH 3 左右 氨基酸水溶液中其解離度與溶液的氨基酸水溶液中其解離度與溶液的 pH 有關(guān) 有關(guān) 向氨基酸溶液中加酸時 羧基接受質(zhì)子 使 氨基酸帶正電 加堿時 氨基釋放質(zhì)子 與 OH 中和 使氨基酸帶負電 當溶液的 pH pI 時 氨基酸以兩性離子存在 當溶液的 pH pI 時 氨基酸溶液中正離子占優(yōu)勢 當溶液的 pH pI 時 氨基酸溶液中負離子占優(yōu)勢 10 氨基酸的化學性質(zhì)氨基酸的化學性質(zhì) 與亞硝酸的反應(yīng) Van Slyke 定氮 與甲醛的反應(yīng) 氨基滴 與?；噭┑姆磻?yīng) 氨基保護基 與二甲基氨基萘磺酰氯 DNS Cl 的反應(yīng) 測序 與 2 4 二硝基氟苯 FDNB 的反應(yīng) 測序 與 Edman 試劑 PITC 苯異硫氫酸酯 測序 羧基參加的反應(yīng) 羧基參加的反應(yīng) 1 成鹽和成酯反應(yīng) 可用于羧基的保護 2 成酰氯反應(yīng) 可用于羧基的活化 3 脫羧基反應(yīng) 是生成胺類的重要反應(yīng) 4 疊氮反應(yīng) 可用于羧基的活化 11 蛋白質(zhì)功能的多樣性 蛋白質(zhì)功能的多樣性 a 催化 大多數(shù)酶是蛋白質(zhì) b 調(diào)節(jié) 如激素和反式作用因子 c 轉(zhuǎn)運 如血紅蛋白 血清蛋白 載酯蛋白 膜轉(zhuǎn)運蛋白等 d 貯存 如種子蛋白和卵清蛋白 e 運動 如肌肉 微管蛋白等 f 結(jié)構(gòu)成分 如角蛋白 膠原蛋白等 g 支架作用 如錨定蛋白 連接蛋白等 h 防御和進攻 如抗體 毒蛋白等 i 特殊功能 如甜蛋白 膠質(zhì)蛋白等 12 氨基酸組成的分析氨基酸組成的分析 a Edman 化學降解法 用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀 若每次循環(huán)的準確度為 99 經(jīng) 60 次循環(huán) 準確度為 0 9960 0 54 b 降解法 可用氨肽酶和羧肽酶 只能測出末端的幾個氨基酸 羧肽酶 Y 可作用 于任何氨基酸 有可能以此為基礎(chǔ)開發(fā)出新的氨基酸的順序測定儀 c 根據(jù)核苷酸序列推定法 分離 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測定 cDNA 的核苷酸序列 再用 遺傳密碼推定氨基酸序列 d 質(zhì)譜法 可分析微量的肽鏈 短肽在第一臺質(zhì)譜儀中經(jīng)電噴射電離 按荷質(zhì)比分 離 依次在經(jīng)碰撞池被裂解成離子碎片 在第二臺質(zhì)譜儀中測出各個離子碎片的 譜線 推算出短肽的氨基酸序列 在蛋白質(zhì)組學中應(yīng)用廣泛 但不能區(qū)分亮氨酸 和異亮氨酸 13 為何要進行作圖分析為何要進行作圖分析 1 基因組計劃的基本目標是獲得全基因組順序 在此基礎(chǔ)之上再對所獲得的序列進行解 讀 獲取基因組順序的主要方法是進行 DNA 測序 然后再將所獲取的順序進行組裝 以得到完整的基因組序列 2 基因組測序的第一步是構(gòu)建基因組圖 然后將基因組區(qū)段分解后逐個測序 最后進行 組裝 3 基因組作圖的基本構(gòu)想 在長鏈 DNA 分子的不同位置尋找特征性的分子標記 根據(jù) 標記將包括這些序列的克隆進行連鎖定位 繪制基因組圖 該圖一旦構(gòu)建好 即可著 手進行全基因組測序 14 以基因組作圖為指導(dǎo)的 以基因組作圖為指導(dǎo)的 2 種測序策略 種測序策略 1 直接鳥槍法 首先進行全基因組鳥槍法測序 再以基因組圖的分子標記為起點將鳥 槍法 DNA 片段進行組裝 高密度的基因組圖分子標記可以檢測組裝的 DNA 片段是 否處在正確的位置 并校正因重復(fù)順序的干擾產(chǎn)生的序列誤排 這是一種由下至上 bottom to up 的測序策略 2 重疊群 contig 法 重疊群是指相互間存在重疊順序的一組克隆 根據(jù)重疊順序的相 對位置將各個克隆首尾連接 覆蓋的物理長度可達 Mbp 在單個的重疊群中 采用 鳥槍法測序 然后在重疊群內(nèi)組裝 這是一種從上至下 up to down 的測序策略 15 遺傳圖的繪制 遺傳圖的繪制 有性雜交實驗 根據(jù)需要有計劃地實施雜交方案而后進行連鎖分析 如果蠅 老鼠以及 玉米 水稻等動植物的遺傳學實驗 系譜分析 不能進行有計劃的遺傳實驗 只能收集家系成員的相關(guān)資料進行連鎖分析 主要涉及人類以及多年生的樹木等 DNA 轉(zhuǎn)移 不發(fā)生減數(shù)分裂的生物 如細菌與病毒基因組的連鎖分析 16 為什么要繪制物理圖 遺傳分析繪制的基因組圖為何不能指導(dǎo)基因組計劃的測序 為什么要繪制物理圖 遺傳分析繪制的基因組圖為何不能指導(dǎo)基因組計劃的測序 遺傳圖的分辨率有限 這一點對微生物不成問題 因為微生物基因組較小 記錄成百上 千次實驗就能獲得十分詳盡的遺傳圖 其標記分布密度僅為數(shù)千個核苷酸 而人類及大多 數(shù)高等真核生物由于不可能獲得大量的后代 只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究 連鎖分 析的分辨力受到很大的限制 因而難以達到基因組測序?qū)蚪M圖的標記分辨率的要求 遺傳圖的精確性較低 由于重組熱點的存在使得染色體某一區(qū)段的交換頻率高于其他區(qū)段 尤其是倒位區(qū)段 由于受到交換限制 無法繪制精確的遺傳圖 由于存在以上兩個局限 因而在進行大規(guī)模的 DNA 測序之前 對大多數(shù)的真核生 物的遺傳圖必須進行驗證并利用其他的作圖技術(shù)予以校正和補充 17 常用的物理作圖技術(shù) 常用的物理作圖技術(shù) 限制性作圖 restriction mapping 將限制性酶切位點標定在 DNA 分子的相對位置 依靠克隆的基因組作圖 clone based mapping 根據(jù)欲克隆的 DNA 片段之間的重疊順 序構(gòu)建重疊群 contig 繪制物理連鎖圖 熒光標記原位雜交 fluorescent in situ hybridization FISH 將熒光標記的探針與染色體雜 交確定分子標記的所在位置 順序標簽位點 sequence tagged site STS 通過 PCR 或分子雜交將小段 DNA 順序定位 在基因組的 DNA 區(qū)段中 18 脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳 PFGE pulsed field gel electrophoresis 是一種分離大分子 DNA 的方法 在普通凝膠電泳 中 大的 DNA 分子 10kb 移動速度接近 在凝膠中難以形成足以區(qū)分的條帶 在 PFGE 中 電場不斷在兩種方向上 有一定夾角 而不是相反的兩個方向 變動 DNA 分 子帶有負電荷 會朝正極移動 相對較小的分子在電場轉(zhuǎn)換后可較快轉(zhuǎn)變移動方向 而較 大的分子轉(zhuǎn)向較為困難 因此小分子向前移動的速度比大分子快 PFGE 可用來分離從 10kb 10Mb 的 DNA 分子 19 常用的指紋分析方法 常用的指紋分析方法 A 限制性帶型 restriction patterns 指紋 B 重復(fù)順序 DNA 指紋 repetitive DNA fingerprints C STS 目錄作圖 STS content mapping D 重復(fù) DNA PCR repetitive DNA PCR 或分散重復(fù)順序 PCR interspersed repeat element PCR IRE PCR 指紋 20 STS 作圖原理作圖原理 1 序列標簽位點或 STS sequence tagged site STS 是基因組中任何單拷貝長度在 100 500bp 之間的 DNA 序列 與限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列相關(guān)聯(lián) 每個基因組 中僅 1 份拷貝 很易分辨 2 將染色體 DNA 隨機打斷 2 個標記所處的物理位置越近 位于同一片段的機率越高 3 隨機打斷的染色體 DNA 長度不一 彼此靠近的 2 個標記有很大的機率位于同一片段 相距較遠的標記分開的機率很高 21 作為合格的 作為合格的 STS 必須要滿足必須要滿足 2 個條件 個條件 它應(yīng)是一段序列已知的片段 可據(jù)此設(shè)計 PCR 反應(yīng)來檢測不同的 DNA 片段中是否存 在這一順序 STS 必須在染色體上有獨一無二的位置 如果某個 STS 在基因組中多個位點出現(xiàn) 則由 此得出的作圖數(shù)據(jù)將是含混不清的 22 尋找尋找 STS 的常用方法 的常用方法 表達順序標簽 expression sequence tag EST 這是一些從 cDNA 克隆中找到的小段序列 EST 轉(zhuǎn)變成 STS 的條件是 這個 EST 來自單拷貝基因而非基因家族成員 后者常常含有相 同或相似的序列 簡單序列長度多態(tài)性 simple sequence length polymorphism SSLP SSLP 產(chǎn)生于重復(fù)順 序的可變排列 同一位點重復(fù)順序的重復(fù)次數(shù)不同 表現(xiàn)出 DNA 序列的長度變化 與 RFLP 不同的是 SSLP 具有多等位性 multiallelic 每個 SSLP 都有多個長度不一的變異體 具有多態(tài)性并已在連鎖分析中定位的 SSLP 具有特別的價值 因其可直接建立遺傳圖與物 理圖之間的聯(lián)系 隨機基因組順序 從克隆的 DNA 中隨機測序可獲得有用的序列 也可從數(shù)據(jù)庫中尋找 感興趣的某些序列 23 SAGE 特點 特點 1 進行轉(zhuǎn)錄物組研究 也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究 2 通過快速和詳細分析成千上萬個 EST 來尋找出表達豐度不同的 SAGE 標簽序列 從而 接近完整地獲得基因組的表達信息 3 SAGE 區(qū)別于差異顯示 消減雜交等其它技術(shù)的主要特點是可用于尋找那些較低豐度 的轉(zhuǎn)錄物 最大限度地收集基因組的基因表達信息 這使之成為從總體上全面研究基 因表達 構(gòu)建基因表達圖譜的首選策略 4 SAGE 可用于在不同環(huán)境 不同生理狀態(tài)及不同生長階段的細胞和組織表達圖譜構(gòu)建 對不同狀態(tài)下基因表達水平的定量或定性比較 特別是對疾病組織與正常組織的比較 發(fā)展迅速 理論依據(jù) 理論依據(jù) 1 來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列 9 11 bp 含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性 的足夠信息 可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標簽 tag 2 通過簡單的方法將這些標簽串聯(lián)在一起 形成大量多聯(lián)體 concatemer 對每個克隆 到載體的多聯(lián)體進行測序 并應(yīng)用 SAGE 軟件分析 可確定表達的基因種類 并可 根據(jù)標簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達風度 abundance 步驟 步驟 a 將 5 g 含有 oligo dT 引物 的磁珠與 RNA 混合 b 合成雙鏈 cDNA c 用 Nla 酶消化形成一條鏈末端有標簽的產(chǎn)物 d 將樣品分成兩份 連接成含有識別序列的產(chǎn)物 以備用 BsmF1 消化 e 用 Mme I 切割每一個樣品形成約 60bp 的標簽 f 延伸 5 秒 連接成約 130bp 的雙鏈標簽 g PCR 擴增 h 用 Nla 酶切 130bp 產(chǎn)物釋放 34bp 雙鏈標簽 i 連接片斷形成串聯(lián)體 j 克隆到 pZErO 1 里 并測序 24 基因芯片的主要應(yīng)用 基因芯片的主要應(yīng)用 1 基因表達檢測 擬南芥 酵母基因表達研究等 2 突變檢測 BRCA 基因外顯子 CFTR 基因 地中海貧血 酵母突變菌株 HIV 1 逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測等 3 基因組多態(tài)性分析 人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定及分析及人線粒體 16 6kb 基 因組多態(tài)性的研究等 4 基因文庫作圖 通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖 25 生物大分子的制備的主要特點 生物大分子的制備的主要特點 生物材料的組成極其復(fù)雜 常含有數(shù)百種乃至上千種化合物 許多生物大分子在生物材料中的含量極微 分離純化步驟繁多 流程長 許多生物大分子一旦離開了生物的體內(nèi)環(huán)境就極易失活 因此在分離過程中如何防止其 失活 就是生物大分子制備的最困難之處 生物大分子中的各種具體物質(zhì)的組成比例不同 制備幾乎都是在溶液中進行的 溫度 pH 值 離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成 的綜合影響 很難準確估計和判斷 26 生物大分子的制備步驟 生物大分子的制備步驟 明確生物大分子制備的目的和要求 建立相應(yīng)可靠的分析測定方法 通過文獻調(diào)研和預(yù)備性實驗 生物大分子制備方案的選擇和探索 生物材料的破碎和預(yù)處理 目的產(chǎn)物的提取及進一步的分離純化 生物大分子制備物的均一性 即純度 鑒定 目的產(chǎn)物的濃縮 干燥 和 保存 27 生物大分子的分離純化方法可粗略地分類如下 生物大分子的分離純化方法可粗略地分類如下 以分子大小和形態(tài)差異為依據(jù)的方法 差速離心 區(qū)帶離心 超濾 透析和凝膠過濾等 以溶解度差異為依據(jù)的方法 鹽析 萃取 分配層析 選擇性沉淀和結(jié)晶等 以電荷差異為依據(jù)的方法 電泳 電滲析 等電點沉淀 吸附層析和離子交換層析等 以生物學功能專一性為依據(jù)的方法 親和層析等 28 生物大分子樣品的早期分離純化 生物大分子樣品的早期分離純化 1 特點 特點 粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜 欲制備的生物大分子濃度很稀 物理化學性質(zhì)相 近的物質(zhì)很多 希望能除去大部分與目的產(chǎn)物的理化性質(zhì)差異較大的雜質(zhì) 2 對所選方法的要求 對所選方法的要求 要快速 粗放 能較大地縮小體積 分辨力不必太高 負荷能力要大 3 可選用的方法 可選用的方法 吸附 萃取 沉淀法 熱變性 鹽析 有機溶劑沉淀等 離子交換 批量吸附 胖柱交換 親和層析 29 生物大分子樣品的晚期分離純化 生物大分子樣品的晚期分離純化 1 可選用的方法 可選用的方法 吸附層析 鹽析 凝膠過濾 離子交換層析 親和層析 等電聚焦制 備電泳 制備 HPLC 等 2 要注意的一些問題 要注意的一些問題 鹽析后要及時脫鹽 用凝膠過濾時如何縮小上樣體積 因為凝膠層析柱的上樣體積只能是柱床體積的 1 10 1 6 也可使用串聯(lián)柱以加大柱床體積 必要時也可重復(fù)使用同一種分離純化方法 如分級有機溶劑沉淀 分級鹽析 連續(xù)兩次 凝膠過濾 離子交換層析等 分離純化步驟前后要有科學的安排和銜接 盡可能減少工序 提高效率 如吸附不可放 在鹽析之后 以免大量鹽離子影響吸附效率 離子交換要放在凝膠過濾之前 因為離子交 換層析的上樣量可以不受限制 只要不超過柱交換容量即可 分離純化后期 目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高 此時對于很多敏感的酶極易變性失 活 因此操作步驟要連續(xù) 緊湊 盡可能在低溫下 如在冷室中 進行 得到最終產(chǎn)品后 必要時要立即冰凍干燥 分裝并寫明標簽 20 或 70 保存 30 蛋白質(zhì)樣品制備原則與純化方法 蛋白質(zhì)樣品制備原則與純化方法 原則 1 在適宜鹽濃度下 可重復(fù)溶解所有蛋白質(zhì) 包括疏水性蛋白質(zhì) 并使樣品中的 分子以分離的形式存在 2 避免溶解性低的蛋白質(zhì) 如胰蛋白 在等電聚焦時由于溶解度降低而沉淀析出 3 防止蛋白質(zhì)的化學修飾 包括蛋白質(zhì)降解 蛋白酶或尿素熱分解后所引起的修飾 4 排除核酸 多糖 脂類和其他干擾分子 5 獲得的目標蛋白質(zhì)應(yīng)在可探測水平 有時需要去除高豐度蛋白質(zhì)和不相關(guān)蛋白質(zhì) 純化方法 純化方法 1 沉淀法 有機溶劑沉淀法 選擇性沉淀法 等電點沉淀法 共沉淀法 2 根據(jù)形態(tài)差異建立的方法 透析 超濾 離心分析 3 依據(jù)電荷特性設(shè)計的分離方法 吸附交換分離法 聚焦層析 電泳法 4 根據(jù)穩(wěn)定性建立的分離純化方法 熱變性法 酸堿變性法 表面變性法 5 根據(jù)親和作用建立的純化方法 親和電泳 免疫吸附層析 疏水作用層析 共價層析 金屬螯合層析 6 高效液相色譜分離分析法 體積排阻色譜 離子交換色譜法 反相色譜法 高效疏水 作用色譜 31 雙向凝膠電泳的基本原理 雙向凝膠電泳的基本原理 雙向電泳的第一向是等電聚焦電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)的 PI 不同進行分離 第二向為變性聚丙烯 酰胺凝膠電泳 根據(jù)分子量不同進行分離 樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后 得到等電點 和分子量的信息 32 雙向電泳的分類 雙向電泳的分類 非變性 2D PAGE 非變性 SDS 2D PAGE 非變性 還原 SDS 2D PAGE 變性 2D PAGE 33 雙向電泳分析中的樣品制備 雙向電泳分析中的樣品制備 1 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài) 包括多數(shù)疏水性蛋白 且制備方法應(yīng) 具有可重現(xiàn)性 2 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀 3 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾 如酶性或化學性降解等 4 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白 5 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白 從而保證待研究蛋白的可檢測性 3434 雙向凝膠電泳的基本流程 雙向凝膠電泳的基本流程 1 等電聚焦 標記膠條 樣品上樣及水化 置于聚焦盤內(nèi) 設(shè)定 IEF 電泳程序 加礦 物油覆蓋膠面 2 膠條平衡 先在含有 SDS 還原劑 DTT 但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡 再在含碘 乙酰胺的平衡液中平衡 3 SDS PAGE 制膠 樣品制備 加緩沖液 連接電源 電泳 4 染色 染色液及脫色液的配制 染色 脫色 3535 雙向電泳中第一向到第二向進行平衡過程的機理 雙向電泳中第一向到第二向進行平衡過程的機理 平衡 buffer 1 還原 將 S S 鍵轉(zhuǎn)化為 SH DTT 平衡 buffer 2 烷基化物 使每個 SH 均烷基化以防止 S S 鍵的重新形成 碘乙酰胺 36 有機染料和銀染有機染料和銀染 1 考染靈敏度為 30 100ng 線性范圍是 20 倍 銀染的線性范圍是 40 倍 靈敏度是考染 的 100 倍 2 膠體考馬斯亮藍染色技術(shù)可實現(xiàn) PAGE 的無背景染色 其極限靈敏度為 8 10ng 但這 種染液會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果 3 胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯 PVDF 和 或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色 4 銀染的缺點是 對某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差 對其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析造 成影響 5 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量 37 預(yù)防酶自解和微生物的污染 預(yù)防酶自解和微生物的污染 使用較好的測序級 TPCK Trysin 在加酶使膠塊吸脹后 一定要去掉多余的酶液 不要認為這樣會影響酶解效率 酶解時間不宜過長 24hr 電泳玻板 染膠的器皿等用前要清洗 所用試劑和溶液的純度要高 以保證質(zhì)譜分析的可靠性 盡量用干凈的乳膠手套和潔凈的 EP 管及 Milliq 水 盡量減少不必要的操作步驟 簡化操作程序 要有一個潔凈的操作環(huán)境 38 膠內(nèi)酶解注意事項 膠內(nèi)酶解注意事項 若樣品種類較多 應(yīng)將離心管編號 樣品對號入管 考染方案各注釋均適用銀染方案 整個操作過程應(yīng)注意角蛋白等的污染 佩戴一次性乳膠手套 使用潔凈的離心管及 Millipore 水 不同公司的酶需要不同的最適的 pH 因此 需調(diào) pH 值 39 樣品的純化與濃縮 樣品的純化與濃縮 操作步驟 配制適當?shù)娜芤?對不同質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)或肽段的提取效率應(yīng)事先估計 注意事項 整個操作過程潤濕體積 0 6 l 因填料為 0 6 l pH 4 整個過程不能引入氣泡 注意流速 最好速度均勻 40 蛋白質(zhì)定量分析策略 蛋白質(zhì)定量分析策略 41 定量蛋白質(zhì)組學 定量蛋白質(zhì)組學 內(nèi)容 內(nèi)容 是把一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復(fù)雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進行精確 的定量和鑒定的一門學科 通常情況是只需對兩種不同狀態(tài)細胞的蛋白質(zhì)進行比較 只需相對含量的變化進行準 確的定量即可 意義 意義 研究方法 研究方法 1 體內(nèi)標記 體內(nèi)標記 15N 體內(nèi)代謝標記 體內(nèi)代謝標記 用富含 15N 的介質(zhì)來培養(yǎng)細胞 15N 被滲入合成的蛋白質(zhì)中 從而 充當其定量的內(nèi)部標準 每結(jié)合一個 15N 該肽比正常 14N 的相同肽大一個質(zhì)量單位 使得不同細胞狀態(tài)來源的肽段得以區(qū)分 肽質(zhì)譜峰信號成對出現(xiàn) 從而根據(jù)質(zhì)譜峰的 信號強度來進行準確的定量 缺點 由于相同肽段的不同同位素標記形式之間的質(zhì)量變化依賴于氮原子數(shù)目 因 此對未知蛋白難以進行定量 穩(wěn)定同位素標記的必需氨基酸標記 穩(wěn)定同位素標記的必需氨基酸標記 在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定同位素標記的必需氨基酸 如 Lys Leu Phe 等 這主要用于高等動物細胞中蛋白質(zhì)的定量以及鑒定 優(yōu)點 省去了標記化學反應(yīng)和分離純化等步驟 因而減少了樣品的損失 有利于低豐 度蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測 缺點 1 不能對組織來源的蛋白質(zhì)進行分析 2 同位素介質(zhì)可能會影響蛋白質(zhì)的表達水 平 3 受成本限制 不能對整個動物體進行標記 4 無法確定標記物與肽段之間量的關(guān)系 2 同位素親和標簽技術(shù)同位素親和標簽技術(shù) ICAT ICAT 試劑包括三部分 1 反應(yīng)基團 可特異地與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的半胱氨酸 Cys 殘基的 SH 進行反應(yīng) 使試劑共價結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈上 2 同位素標記的接頭 含有穩(wěn)定同位素 H 和 D 的標記 3 親和標記的生物素 用于分離標記的蛋白質(zhì)或多肽 ICAT 試劑中 8 個 X 位置被 H 取代時 稱為輕試劑 D0 8 個 X 位置被 D 取代時 稱 為重試劑 D8 輕試劑和重試劑的相對分子量差 8Da 或 4Da 肽段帶兩個電荷 在質(zhì)譜圖上這對標記蛋白質(zhì)的肽段離子峰 m z 相差 8 或 4 從而能將來自不同樣品的同 一蛋白質(zhì)分離開 ICAT 策略的優(yōu)點策略的優(yōu)點 a 若一種蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生至少一個 Cys 殘基的肽段的話 就可以對其進行鑒別和定 量 含有 Cys 殘基的肽段越多 結(jié)果對照得出的結(jié)論就越準確 b 鑒定的肽段中肯定都會有至少一個 Cys 因此在進行數(shù)據(jù)庫搜索時就增加了一個 有效的約束條件 c 肽段根據(jù)標記情況有選擇性地得到了富集 從而減少了下游質(zhì)譜分析的復(fù)雜程度 d 分離出來的標記多肽可直接與后面的 RP LC MS 分析系統(tǒng)在線偶聯(lián)操作 e 可直接對混合樣品進行分析 f 可對低豐度蛋白質(zhì)直接捕獲和快速定性 定量鑒定 尤其是對膜蛋白等疏水性蛋 白質(zhì) g 可快速找出功能性蛋白質(zhì) h 無需繁冗的雙向凝膠電泳分析分離 i ICAT 軟件及質(zhì)譜技術(shù)平臺系統(tǒng)可用于全自動快速鑒定蛋白質(zhì) ICAT 策略的缺陷 策略的缺陷 a 不能獲得不含 Cys 的肽段 同時翻譯后修飾的檢出率較低 而酵母細胞中約有 10 左 右的蛋白質(zhì)肽鏈上沒有 Cys 殘基 因而得不到鑒定 b ICAT 試劑的分子質(zhì)量為 500Da 左右 相對肽段而言較大 增加了數(shù)據(jù)庫檢索算 法的復(fù)雜性 對于較小片段的修飾可能會影響數(shù)據(jù)庫搜索 c 耗時太長 數(shù)據(jù)存儲消耗在表達量沒有改變的蛋白質(zhì)上 而這些蛋白質(zhì)可能與研 究的問題沒有太大的關(guān)聯(lián) d 相對于雙向凝膠電泳技術(shù) 該方法有高分子量偏性 ICAT 策略的改進措施 策略的改進措施 a 采用了固相氨基酸同位素標記試劑來代替 ICAT 試劑 b 采用多維 LC MS MS 分析系統(tǒng) 把鑒定和定量分開 c 雙向凝膠電泳技術(shù)與 ICAT 技術(shù)互補結(jié)合測定蛋白質(zhì)在兩樣品中的相對含量 d 磷酸化蛋白質(zhì)同位素標記親和標簽 Phosphoprotein isotope coded Affinity Tags PhIAT 技術(shù) 42 同位素親和標簽 同位素親和標簽 ICAT 標記方法的步驟 標記方法的步驟 a 將來自一種狀態(tài)下的細胞的蛋白質(zhì)混合物分離純化后用 D0 試劑標記蛋白質(zhì)側(cè)鏈 上的 Cys 殘基 將來自另一狀態(tài)下的同種細胞的蛋白質(zhì)混合物分離純化后用 D8 試劑標記 b 將兩種樣品混合在一起 用 trypsin 酶切 產(chǎn)生多肽片段 包括標記的和未標記的 c 樣品經(jīng) SCX RPLC 兩維色譜分離 除去消化酶 去垢劑 還原劑和 ICAT 試劑 d 混合物經(jīng)過抗生物素和色譜柱分離 得到只含有同位素標記的多肽混合物 e 將分離得到的標記多肽混合物再用 RP lC MS 分離和鑒定 43 不同染色方法的比較 不同染色方法的比較 1 考馬斯亮藍 優(yōu)點 選擇性地對蛋白質(zhì)進行染色 大大地降低了化學噪音 提高了靈 敏度 2 銀染 優(yōu)點 大大提高了靈敏度 擴展了動態(tài)線性范圍兼容質(zhì)譜 去除戊二醛后 快 速 方便 3 缺點 銀離子可與半胱氨酸殘基結(jié)合 銀染試劑戊二醛和甲醛都會對蛋白質(zhì)的 和 氨基烷基化 妨礙后續(xù)分析 4 熒光染色 優(yōu) 與質(zhì)譜兼容性好 在 2 2000ng 間效果與量成線性正比 5 缺 范圍窄 試劑貴 需要較高的設(shè)備 44 亞細胞蛋白質(zhì)組的研究意義和策略 亞細胞蛋白質(zhì)組的研究意義和策略 意義 意義 富集低豐度蛋白 對特定成份的蛋白質(zhì)的研究 提供亞細胞定位信息 提供結(jié)構(gòu)與 功能的信息 對細胞分子的生理分子預(yù)測 差異表達譜 策略 策略 亞細胞組分的分離 亞細胞蛋白質(zhì)組學技術(shù) 蛋白質(zhì)亞細胞定位技術(shù) 蛋白質(zhì)亞細 胞定位預(yù)測技術(shù) 定位實驗技術(shù) 定位實驗技術(shù) 分離 TAP 串聯(lián)親和純化 免疫電阱或免疫熒光 確認 轉(zhuǎn)基因 GFP 基因缺失突變 45 蛋白質(zhì)相互作用和研究策略 蛋白質(zhì)相互作用和研究策略 作用 多亞基蛋白質(zhì)的形成 多成分蛋白質(zhì)的相互作用 瞬時的蛋白質(zhì)相互作用 控制著一些重要的生命活動 研究方法 生化方法 親和層析 親和印跡 免疫共沉淀 化學交聯(lián) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 生物傳感 器 分子生物學方法 酵母雙雜交系統(tǒng) 噬菌體展示技術(shù) 串聯(lián)親和純化技術(shù) TAP 遺傳學方法 基因外抑制子 合成致死 46 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理 是指在兩個不同的熒光基團中 如果一個熒光基團 供體 Donor 的發(fā)射光譜與另一個基 團 受體 Acceptor 的吸收光譜有一定的重疊 當這兩個熒光基團間的距離合適時 一般 小于 100 就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象 即以前一種基團的激發(fā)波長 激發(fā)時 可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光 47 噬菌體展示技術(shù) 噬菌體展示技術(shù) 是一種基因表達產(chǎn)物和親和選擇相結(jié)合的技術(shù) 他以改構(gòu)的噬菌體為載體 把待選基因片 段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū) 使外源多肽或蛋白質(zhì)表達并展示于噬菌體表面 進 而通過親和富集法表達有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體 48 生物傳感器 生物傳感器 biosensor 由固定化的生物敏感材料作識別元件與適當?shù)睦砘瘬Q能器及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具 或系統(tǒng) 特點特點 1 采用固定化生物活性物質(zhì)作催化劑 價值昂貴的試劑可多次重復(fù)使用 克服了過去酶 法分析試劑費用高和化學分析繁瑣復(fù)雜的缺點 2 專一性強 只對特定的底物起反應(yīng) 而且不受顏色 濁度的影響 3 分析速度快 可以在一分鐘得到結(jié)果 4 準確度高 一般相對誤差可以達到 1 5 操作系統(tǒng)比較簡單 容易實現(xiàn)自動分析 6 成本低 在連續(xù)使用時 每例測定僅需要幾分錢人民幣 7 有的生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生 能得到 許多復(fù)雜的物理化學傳感器綜合作用才能獲得的信息 同時還可指明增加產(chǎn)物得率的方向 49 質(zhì)譜原理特點及質(zhì)譜系統(tǒng) 質(zhì)譜原理特點及質(zhì)譜系統(tǒng) MS 原理 原理 待測化合物分子吸收能量 在離子源的電離室中 后產(chǎn)生電離 生成分子離子 分 子離子由于具有較高的能量 會進一步按化合物自身特有的碎裂規(guī)律分裂 生成一系列確 定組成的碎片離子 將所有不同質(zhì)量的離子和各離子的多少按質(zhì)荷比記錄下來 就得到一 張質(zhì)譜圖 由于在相同實驗條件下每種化合物都有其確定的質(zhì)譜圖 因此將所得譜圖與已 知譜圖對照 就可確定待測化合物 特點 特點 信息量大 應(yīng)用范圍廣 是研究分子結(jié)構(gòu)的有力工具 由于分子離子峰可以提供樣品分子的相對分子量的信息 所以質(zhì)譜法也是測定分子量 的常用方法 分析速度快 靈敏度高 高分辨率的質(zhì)譜儀可以提供分子或離子的精密測定 質(zhì)譜儀器較為精密 價格昂貴 工作環(huán)境要求較高 系統(tǒng) 系統(tǒng) 質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)由 7 部分組成 進樣系統(tǒng) 離子源室 質(zhì)量分析器 檢測器 數(shù)據(jù)處理 系統(tǒng) 真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng) 其中離子源室 質(zhì)量分析器 檢測器必須處于高真空狀態(tài) 離子源要求 10 4 10 5Pa 質(zhì)量分析器要求 10 6Pa 以降低背景以及減少離子間或離子與分 子的碰撞 進樣系統(tǒng) 把樣品從室內(nèi)常壓轉(zhuǎn)移到離子源 離子源室 把樣品分子轉(zhuǎn)換成樣品離子 在質(zhì)量分析器里 電場或者磁場 或者兩者都有的分析器 被用來控制樣品離子的運動 這樣便可根據(jù)其質(zhì)量不同而將其分離 檢測器 可以感知已經(jīng)被分離的離子的到達 放大極其微小的離子的電流以便進一步的電子 處理 記錄儀接受檢測器的信號 將其放大并記錄 這樣就得到了質(zhì)譜圖 質(zhì)譜要在真空系統(tǒng)運行減少空氣中成分的干擾 離子源 質(zhì)量分析器和檢測器在真空系統(tǒng) 里 50 四級桿質(zhì)譜與飛行時間質(zhì)譜 四級桿質(zhì)譜與飛行時間質(zhì)譜 四級桿質(zhì)譜 四級桿質(zhì)譜 物質(zhì)氣化后以分子狀態(tài)進入質(zhì)譜儀后 經(jīng)過燈絲發(fā)射的電子轟擊后 成各種 不同的碎片 有的是只掉了一個 H 有的是掉了一個基團 有的成為更小的碎片 各種各 樣的 然后這些碎片進入四極桿后 四極桿通過不同的電的方向變換 這些碎片在通過四 極桿時 由于碎片的質(zhì)量和所帶的電核不同 質(zhì)荷比 所以 也隨著四極桿電的方向變換 而改變前進方向 帶電碎片到達終點 接收端 的時間不同 質(zhì)荷比太小或太大的帶電碎 片它們的方向變換也會過快或過慢 這個可以設(shè)置 會撞到四極桿而不能被檢測 中間的 碎片會按質(zhì)荷比由小到大的順序先后到達接受端 而被檢測到 飛行時間質(zhì)譜 飛行時間質(zhì)譜 TOF MS 分析方法的原理非常簡單 這種質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器是一個離子 漂移管 樣品在離子源中離子化后即被電場加速 由離子源產(chǎn)生的離子加速后進入無場 漂移管 并以恒定速度飛向離子接收器 假設(shè)離子在電場方向上初始位移和初速度都為 零 所帶電荷數(shù)為 q 質(zhì)量數(shù)為 m 加速電場的電勢差為 V 則加速后其動能應(yīng)為 m v2 2 qe V 其中 v 為離子在電場方向上的速度 離子以此速度穿過負極板上的柵條 飛向檢測器 離子從負極板到達檢測器的飛行時間 t 就是 TOFMS 進行質(zhì)量分析的判據(jù) 51 生物質(zhì)譜的基本原理 生物質(zhì)譜的基本原理 分析樣品在特定的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楦咚龠\動的離子 這些離子根據(jù)質(zhì)量 電荷比的不同在靜電 場和磁場的作用下得到分離 用特定的檢測器可以記錄不同質(zhì)荷比的各種離子的相對強度 并形成質(zhì)譜圖 主要部分組成 主要部分組成 基本部分 1 離子源 2 質(zhì)量分析器 3 檢測器 檢測由質(zhì)量分析器分離的離子 其他部分 1 復(fù)雜計算機 2 真空泵系統(tǒng) 主要類型 主要類型 52 生物質(zhì)譜的電離方式 生物質(zhì)譜的電離方式 硬電離方法 能給樣品較大能量 生成較多碎片離子的電離方法 電子轟擊離子化 EI 軟電離方法 給樣品較小能量 碎片離子較少或不生成碎片離子的電離方法 電噴霧電離 ESI 基質(zhì)輔助激光解吸電離 MALDI 53 ESI 和和 MALDI 的比較的比較 離子化方式 可在線聯(lián)用的方式 離子電荷形式 對雜質(zhì)容忍程度 ESI 液相 多電荷 直接進樣時差 MALDI 固相 一般為 1 或 2 個電荷 較好 5454 比較 比較 MALDIMALDI 和和 ESIESI 的異同點 的異同點 MALDI 離子源工作原理 1 以脈沖方式使樣品離子化 從固相標本中產(chǎn)生的離子 并在飛行管中測定分子量 2 將分析物分散在基質(zhì)分子 尼古丁酸及其同系物 中并形成晶體 用激光照射晶體 由 于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱 從而使基質(zhì)晶體升華 導(dǎo)致基 質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相 3 樣品被包裹在基質(zhì)中 大部分激光能量被基質(zhì)的發(fā)色基團首先吸收 從而保護了樣品分 子的完整性 MALDI 優(yōu)點 能夠耐受高鹽 具有較高的質(zhì)測上限 能分析混合物 敏感度為 fmol 可發(fā)展為蛋 白及核酸測序手段 缺點 質(zhì)量分辨率 500 質(zhì)量測定精確度為 0 1 0 01 不能與液相色譜聯(lián)用 ESI 離子源工作原理 原理 樣品通過液流流動 通常從 HPLC 進入離子源 穿過有持續(xù)高壓的不銹鋼錐體或進 樣針 隨著液流利開進樣針樣品分散為細霧狀微滴 微滴含有肽離子以及 HPLC 流動相組分 水 乙腈 醋酸等 離子源進一步從溶液組分中分離肽離子 將離子轉(zhuǎn)移到質(zhì)量分析器 ESI 優(yōu)點 能與 HPLC CZE 聯(lián)用 能形成多價離子 可更為準確地測定分子量 質(zhì)量分辨率為 2000 以上 可以直接從水相觀察非共價復(fù)合物 敏感度為 fmol pmol 質(zhì)量測定精確度 為 0 01 缺點 在分析混合物時 多價離子形成會使結(jié)果分析比較困難 僅在低鹽 1mmol L 條 件下給出理想信號 樣品組成過于復(fù)雜時可能不產(chǎn)生信號信號 55 什么是串聯(lián)質(zhì)譜 碰撞誘導(dǎo)解離 什么是串聯(lián)質(zhì)譜 碰撞誘導(dǎo)解離 串聯(lián)質(zhì)譜 兩個或更多的質(zhì)譜連接在一起稱為串聯(lián)質(zhì)譜 最簡單的是由兩個質(zhì)譜串聯(lián)而成 其中第一個質(zhì)量分析器將離子預(yù)分離或加能量修飾 由第二級質(zhì)量分析器分析結(jié)果 常見 的有串聯(lián)四級桿質(zhì)譜 四級桿離子阱質(zhì)譜等 作用 作用 1 誘導(dǎo)第一級質(zhì)譜產(chǎn)生的分子離子裂解 有利于研究子離子和母離子的關(guān)系 進而 給出該分子離子的結(jié)構(gòu)信息 2 從干擾嚴重的質(zhì)譜中抽取有用數(shù)據(jù) 大大提高質(zhì)譜檢測的選擇性 從而能夠測定混合物 中的痕量物質(zhì) 碰撞誘導(dǎo)解離 碰撞誘導(dǎo)解離 CID 碰撞活化解離在碰撞室內(nèi)進行 帶有一定能量的離子進入碰撞室后 與室內(nèi)情性氣體的分子或原子發(fā)生碰撞 離子發(fā)生碎裂 為了使離子碰撞碎裂 必須使離 子具有一定動能 對于磁式質(zhì)譜儀 離子加速電壓可以超過 1000V 而對于四極桿 離子 阱等 加速電壓不超過 100V 二者得到的子離子譜是有差別的 56 肽質(zhì)量指紋圖譜是如何鑒定蛋白質(zhì)的 肽質(zhì)量指紋圖譜是如何鑒定蛋白質(zhì)的 PMF 原理 將由質(zhì)譜獲得的肽段實驗質(zhì)量數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白的肽段理論數(shù)