干細(xì)胞-成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞Adultstemcells 概述 成體干細(xì)胞分化的可塑性 成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和特性 成體干細(xì)胞研究中的問(wèn)題 成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 概述 一 定義成體干細(xì)胞是指一群分布在成體組織中尚未分化的 具有自我更新 并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞 又稱組織特異性干細(xì)胞 Tissue specificstemcell 傳統(tǒng)觀點(diǎn) 干細(xì)胞一旦分化成熟 就不再分裂增殖了 成體干細(xì)胞的發(fā)育潛能是限能或少能的 成體干細(xì)胞只能分化為特定組織器官若干類型細(xì)胞 轉(zhuǎn)折點(diǎn) 1997年初 英國(guó)科學(xué)家Wilmut等用體外培養(yǎng) 高度分化的母羊乳腺細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞 克隆出了 Dolly 表明某些高度分化的體細(xì)胞核仍具有一套完整的遺傳信息 能指導(dǎo)胚胎發(fā)育成為一個(gè)完整的新個(gè)體 在特定的條件下 分化的體細(xì)胞仍具發(fā)育的全能性 與胚胎干細(xì)胞相比 成體干細(xì)胞具有許多優(yōu)勢(shì) 成體干細(xì)胞不存在組織相容性的問(wèn)題 治療時(shí)可避免長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑對(duì)患者的傷害 胚胎干細(xì)胞能分化成各種細(xì)胞類型 但這種分化是 非定位性 的 目前 尚不能控制胚胎干細(xì)胞在特定的部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞 容易導(dǎo)致畸胎瘤 成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的高度分化能力 二分化 目前 比較一致的看法是 成體干細(xì)胞是一種尚未終末分化的 處于干細(xì)胞 祖細(xì)胞或前體細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞 正常生理?xiàng)l件下 傾向分化為所在特定組織的若干種細(xì)胞 外界條件誘導(dǎo)下 成體干細(xì)胞能超越該特定組織 分化成其他的功能細(xì)胞 補(bǔ)充參與損傷組織的修復(fù)等 三特征 多能性 廣泛性 遷移性 可調(diào)控性 增生活躍組織 如黏膜 骨髓 不活躍組組織 如神經(jīng)脂肪 肺部 體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的中介環(huán)節(jié) Blau等將干細(xì)胞借助于循環(huán)穿梭于組織的特性成為 干細(xì)胞高速公路 高度依賴于干細(xì)胞所處的三維空間結(jié)構(gòu)和多維的分化信號(hào) 微環(huán)境中的細(xì)胞因子 同種或異種細(xì)胞之間的接觸 細(xì)胞外基質(zhì)成分等對(duì)成體細(xì)胞的分化方向與進(jìn)程起到重要的調(diào)控作用 成體干細(xì)胞分化的可塑性 目前對(duì)于可塑性的機(jī)制有幾種假說(shuō) 假說(shuō)1 成熟的組織內(nèi)的確存在由胚胎時(shí)殘留下來(lái)的多能干細(xì)胞 Verfaillie等證實(shí)在成體許多組織中余存著一種稀有數(shù)量的胚胎樣原始干細(xì)胞 表達(dá)胚胎干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志 體外的培養(yǎng)條件也基本類似于胚胎干細(xì)胞 假說(shuō)2 可塑性是細(xì)胞融合的結(jié)果 20世紀(jì)初期 通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生雜合體而改變細(xì)胞命運(yùn) 例如將肌母細(xì)胞與纖維母細(xì)胞融合后 可在纖維母細(xì)胞內(nèi)觀察到肌蛋白表達(dá) 將鼠骨髓細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)后 骨髓細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生明顯的逆向分化 獲得胚胎干細(xì)胞特征 最近有研究人員將熱休克的小氣道上皮細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng) 觀察到間質(zhì)干細(xì)胞與損傷的氣道細(xì)胞融合新生出氣道上皮 而且融合率大于1 推測(cè)在體內(nèi)出現(xiàn)急性器官衰竭和組織壞死時(shí)有可能通過(guò)細(xì)胞融合完成組織修復(fù) 假說(shuō)3 細(xì)胞由成熟狀態(tài)去分化為較原始狀態(tài) 隨后再分化為成熟的其他類型細(xì)胞 克隆羊多利 明確顯示細(xì)胞的遺傳信息可以被再程序化 體細(xì)胞可以去分化成為多能干細(xì)胞 低等脊椎動(dòng)物的研究 顯示損傷部位可以出現(xiàn)與胚胎發(fā)育類似的未分化細(xì)胞進(jìn)行修復(fù) 嶸螺的研究表明其通過(guò)局部已分化終末細(xì)胞去分化完成修復(fù)功能 分化就是受精卵發(fā)育成成體的過(guò)程中 細(xì)胞完成結(jié)構(gòu)功能定向改變的過(guò)程 實(shí)質(zhì)是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果 去分化就是脫分化 分化細(xì)胞失去其特有結(jié)構(gòu)而變成具有未分化細(xì)胞特征的過(guò)程 在動(dòng)物中 去分化細(xì)胞具有胚胎間質(zhì)細(xì)胞的功能 在植物中 去分化細(xì)胞成為薄壁細(xì)胞 稱為愈傷組織 callus 去分化往往隨之又發(fā)生再分化 redifferentiation 1 骨髓干細(xì)胞 2 神經(jīng)干細(xì)胞 4 骨骼肌干細(xì)胞 3 肝干細(xì)胞 1 骨髓干細(xì)胞 骨髓由不同類型多種細(xì)胞成分組成的組織 除了分化的血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等 還存在兩類成體干細(xì)胞 一類是造血干細(xì)胞 hematopoieticstemcell HSC 能生成各種血細(xì)胞 另一類是間質(zhì)干細(xì)胞 mesenchymalstemcell MSC 能生成內(nèi)皮細(xì)胞 脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等 體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞 HSC細(xì)胞呈懸浮集落生長(zhǎng) 而MSC細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng) 通過(guò)換液很容易把兩者分開(kāi) 間質(zhì)干細(xì)胞 證明可分化為包括骨細(xì)胞 軟骨細(xì)胞 脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等 也能分化成內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞 當(dāng)MSC細(xì)胞移植入小劑量射線照射的宿主 則造血系統(tǒng)和胃腸道組織有所增多 表明MSC細(xì)胞在異常環(huán)境中 細(xì)胞分化的可塑性增加 造血干細(xì)胞 HSC移植至不同的體內(nèi)微環(huán)境 可分化為3個(gè)胚層的各種類型細(xì)胞 包括心肌 骨骼肌 血管內(nèi)皮系統(tǒng) 肝細(xì)胞 肺泡 食道 腸道 胃 膽管以及皮膚和神經(jīng)細(xì)胞等 HSC細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí) 發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞系之間 即淋巴細(xì)胞系與髓性細(xì)胞系之間和系內(nèi)也存在分化方向的轉(zhuǎn)變 Hematopoiesis造血 Hematopoieticstemcell Commonlymphoidprogenitor 淋巴系 Commonmyeloidprogenitor 髓系 NKcell Bcell Tcell Gran Macprogenitor Erythro Pltprogenitor RBC Platelet macrophage neutrophil basophil eosinophil 2 神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)系統(tǒng)中一類能自我更新 并產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞 主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兩個(gè)神經(jīng)發(fā)生區(qū)域 腦的海馬區(qū)和次腦室區(qū) 以及包括脊髓等其他非神經(jīng)性的區(qū)域 通過(guò)個(gè)體發(fā)育不同階段的神經(jīng)干細(xì)胞移植至宿主不同部位 發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能具有發(fā)育階段的依賴性 說(shuō)明成體中的神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能受到一定的限制 1999年 Bjornson將從成年小鼠腦組織分離的神經(jīng)干細(xì)胞移植入經(jīng)X射線照射過(guò)的小鼠骨髓部位 分化出血液細(xì)胞 開(kāi)創(chuàng)了成體干細(xì)胞跨越組織或胚層分化研究的先例 3 肝干細(xì)胞 對(duì)肝干細(xì)胞存在與否的問(wèn)題一直有爭(zhēng)論 對(duì)發(fā)育中的肝臟具有自我更新能力的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和分析 證明其內(nèi)的卵圓形細(xì)胞在體外能大量增殖 細(xì)胞移植后可分化 表明肝卵圓形細(xì)胞是肝干細(xì)胞 具有分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙潛能性 肝干細(xì)胞的鑒定 肝干細(xì)胞本身缺乏特異性標(biāo)志 分離和鑒定帶來(lái)了困難 雙潛能的肝干細(xì)胞同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞的標(biāo)志物 細(xì)胞角蛋白CK7和CK19為膽上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志 白蛋白 ALB 甲胎蛋白 AFP 和肝代謝酶細(xì)胞色素P450可作特異性標(biāo)志物 細(xì)胞角蛋白CK8和CK18在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞都有表達(dá) 肝干細(xì)胞一般除了其特有的形態(tài)學(xué)外 常結(jié)合上述特有標(biāo)志 通過(guò)免疫組織化學(xué) 流式細(xì)胞檢測(cè)和原位雜交等方法予以鑒定 肝干細(xì)胞的可塑性 雙潛能卵圓形細(xì)胞不僅能分化為肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞 當(dāng)分別移植到胰腺和十二指腸時(shí) 還能跨組織分化為胰腺細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞 表明肝干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的其他組織細(xì)胞 目前 還未見(jiàn)有跨胚層分化的直接例證 卵圓形細(xì)胞異常分化或分化突然停止有可能發(fā)生肝細(xì)胞癌 4 骨骼肌干細(xì)胞 肌肉的生長(zhǎng) 更新和修復(fù)是由衛(wèi)星細(xì)胞 satellitecells 介導(dǎo)的 一般認(rèn)為這就是骨骼肌干細(xì)胞 近年的研究表明 從肌肉分離的干細(xì)胞不僅能分化出肌肉 還能產(chǎn)生血液細(xì)胞成分 骨骼肌干細(xì)胞不僅存在于骨骼肌組織 而且具有分化的可塑性 甚至跨越胚層分化為肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞 成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和特性 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 造血干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 1 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 MSC 近年的研究已表明間質(zhì)干細(xì)胞 MSC 能向軟骨 骨 脂肪 造血基質(zhì)和神經(jīng)元樣等細(xì)胞分化 使其首選為組織工程中的種子細(xì)胞 最初 用含血清的完全培養(yǎng)基或無(wú)血清化學(xué)限定性培養(yǎng)液使孵化4 5日齡雞胚肢芽的骨髓MSC原代培養(yǎng)獲得成功 隨后 大鼠 人和兔的骨髓MSC原代和繼代培養(yǎng)也有進(jìn)展 大鼠骨髓MSC細(xì)胞體外培養(yǎng) 取大鼠股骨 Tyrode s液洗滌干凈 用注射器吸10ml含血清的DMEM LG培養(yǎng)液 將針頭插入除去骨骺后的股骨一端的骨髓腔 注入培養(yǎng)液 從骨的另一端收集 反復(fù)抽吸 打散成細(xì)胞懸液 調(diào)節(jié)有核細(xì)胞密度至5 107個(gè) ml 接種到直徑為10mm的培養(yǎng)皿中 37 5 CO2 每隔3 4天換液一次 一般經(jīng)2周左右可形成一些較大的細(xì)胞克隆 體外生長(zhǎng)特性 原代培養(yǎng)物中多為成纖維樣細(xì)胞 紅細(xì)胞在此培養(yǎng)液中不能存活 而且不貼壁 通過(guò)換液而洗除 MSC中混雜的巨噬細(xì)胞 單核細(xì)胞 造血細(xì)胞等 由于它們的貼壁黏附能力不同 通過(guò)調(diào)整胰蛋白酶 EDTA的消化時(shí)間 保證在短暫消化時(shí)間內(nèi) 使MSC與培養(yǎng)皿底脫離 而其他細(xì)胞仍貼附于培養(yǎng)皿底 從而使MSC在傳代期間進(jìn)一步得到純化 MSC生長(zhǎng)呈長(zhǎng)梭形 成索密集排列 鑒定包括人在內(nèi)的MSC的直接標(biāo)志物SH2 SH3 CD44 CD71 CD94 CD124 CD14 CD34 等 還可通過(guò)檢測(cè)它們成骨和成軟骨能力予以鑒定 2 造血干細(xì)胞 胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)造血功能的組織是卵黃囊 胎兒出生前 胚胎肝臟是主要的造血組織 內(nèi)含較多的造血干細(xì)胞 人胚發(fā)育至6個(gè)月后 骨髓組織造血功能逐漸明顯 而肝臟的造血功能逐漸減少 出生后 造血細(xì)胞主要存在于紅髓內(nèi) 紅髓 脾臟白髓周圍的區(qū)域 包括脾索和脾竇 脾索含大量B細(xì)胞 漿細(xì)胞 巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞 由脾索圍成的脾竇內(nèi)充滿血液 脾索和脾竇壁的巨噬細(xì)胞能吞噬和清除血液中衰老紅細(xì)胞和病原體 脾臟內(nèi)部可分為紅髓及白髓 紅髓的主要功能是過(guò)濾和儲(chǔ)存血液 由脾索及血竇組成 但因?yàn)槠洳缓斎肓馨凸?所以脾臟不能過(guò)濾淋巴的功能 而白髓的主要功能則為對(duì)抗外來(lái)微生物及感染 在正常狀態(tài)下一般摸不到脾臟 如果仰臥或右側(cè)臥位可能觸摸到脾臟邊緣即可認(rèn)為是脾大 近年來(lái)B超在臨床的廣泛應(yīng)用 引起脾大的原因有 1 感染性脾大 各種急 慢性感染如傷寒 副傷寒 黑熱病 血吸蟲病 瘧疾 病毒性肝炎 敗血癥 晚期梅毒等 2 郁血性脾腫大 斑替氏綜合征 肝硬化 慢性心力衰竭致心原性肝硬化 慢性縮窄性心包炎 門靜脈或脾靜脈血栓形成 3 增生性脾大 見(jiàn)于某些血液病如白血病 溶血性貧血 惡性淋巴瘤等 4 其它 脾臟惡性腫瘤較罕見(jiàn) 脾臟囊腫 播散性紅斑狼瘡 皮肌炎 結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎 高雪氏病等 因脾臟大原因較復(fù)雜 除少數(shù)人為生理性外 都應(yīng)在醫(yī)生指導(dǎo)下尋找病因 并要定期復(fù)查 3 神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和建系 必須滿足兩個(gè)基本條件 具有永生化特性 即在細(xì)胞周期內(nèi)不斷地復(fù)制增殖 產(chǎn)生大量子代細(xì)胞 具有神經(jīng)干細(xì)胞世系遺傳顯性特性 即神經(jīng)干細(xì)胞表型 在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和條件下 它可分化為神經(jīng)元和包括星形細(xì)胞 少突膠質(zhì)細(xì)胞及Schwann s細(xì)胞等在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 體外培養(yǎng)建系 早期胚胎的神經(jīng)管和神經(jīng)嵴或胎兒的腦組織是體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的最理想材料來(lái)源 首要問(wèn)題是維持其分裂 增殖的能力 基本培養(yǎng)基是一種特定的N2液 添加因子有葡萄糖 人胰島素 人轉(zhuǎn)鐵蛋白 黃體酮 二氫氯丁二胺 硒酸鈉 谷氨酰胺和肝素等 細(xì)胞傳代時(shí) 用手術(shù)刀片沿著神經(jīng)球中間的縱橫軸切割成四等份 則神經(jīng)干細(xì)胞可維持穩(wěn)定而快速的生長(zhǎng) 生物學(xué)特性 未分化的神經(jīng)干細(xì)胞一般每隔7 10天細(xì)胞數(shù)可增加一倍 一般可傳35代 歷時(shí)一年 在這期間 細(xì)胞系可分化為神經(jīng)元 少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞等多能性 成體干細(xì)胞研究中的問(wèn)題 限制成體干細(xì)胞應(yīng)用的主要因素是來(lái)源困難 成體干細(xì)胞在體外傳代中端粒酶活性很快下降 可能是造成成體干細(xì)胞不能在體外大量擴(kuò)增的主要原因 1 異質(zhì)性 2 干細(xì)胞所處環(huán)境 3 可塑性的調(diào)控 4 分化細(xì)胞的功能 5 體外增殖 1 異質(zhì)性 heterogeneity 指由于不同遺傳機(jī)制而產(chǎn)生相同或類似的表現(xiàn)型 異質(zhì)性在某種程度上是干細(xì)胞固有的特性 成體干細(xì)胞的可塑性是否與干細(xì)胞異質(zhì)性直接相關(guān) 一種干細(xì)胞與其組織來(lái)源及歸宿之間的確切關(guān)系 等 還需要深入的研究 2 干細(xì)胞所處環(huán)境 環(huán)境的信號(hào)對(duì)干細(xì)胞的分化命運(yùn)有著重要影響 如 小鼠造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞都能分化出肝細(xì)胞 并能修復(fù)小鼠受損的肝組織 但 移植造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞對(duì)修復(fù)小鼠受損的肝組織的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)比移植成熟肝干細(xì)胞本身差得多 干細(xì)胞在接受亞致死劑量照射等異常環(huán)境下被觀察到 可塑性 現(xiàn)象 人們還難以解釋 3 可塑性調(diào)控 外源性 內(nèi)源性 體液因子 同種或異種細(xì)胞的接觸 細(xì)胞外基質(zhì)等的作用大多數(shù)干細(xì)胞的可塑性研究是基于組織損傷而造成的微環(huán)境 一般認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子在其中起著重要的作用 尚在起步階段 成體干細(xì)胞 可塑性 調(diào)控的解釋 4種 機(jī)體中存在著多種來(lái)源和不同分化方向的成體干細(xì)胞群體 能定向地向各自的組織來(lái)源的細(xì)胞分化 機(jī)體中存在著一種多潛能的成體干細(xì)胞 在不同的微環(huán)境信號(hào)刺激下 可向不同組織的細(xì)胞方向分化 特定組織來(lái)源的成體干細(xì)胞 除了向該組織的細(xì)胞分化外 在特殊信號(hào)的刺激下 可重新編程 繼續(xù)分化為其他類型的細(xì)胞 某種成體干細(xì)胞與特定組織來(lái)源的干細(xì)胞發(fā)生融合 產(chǎn)生具有兩種細(xì)胞的遺傳物質(zhì)且染色體數(shù)量也是正常細(xì)胞兩倍的 雜交細(xì)胞 因而獲得了后者的分化潛能 4 分化細(xì)胞的功能 檢測(cè)終末分化細(xì)胞的特定蛋白或標(biāo)志物的表達(dá) 很少檢測(cè)終末分化細(xì)胞的功能 有些不同類型的細(xì)胞卻具有相同的標(biāo)志 檢測(cè)到某種標(biāo)志就證明該細(xì)胞或組織具有正常功能持有質(zhì)疑 特別是干細(xì)胞的異質(zhì)性和類型以及環(huán)境的復(fù)雜性使得人們對(duì)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞移植入體內(nèi)能否發(fā)揮預(yù)期功能表示懷疑 要確定供