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分子生物總結(jié)范文 1基因克隆利用酶學(xué)方法，將不同的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割、重新連接，組裝成一個(gè)新的DNA分子。 在此基礎(chǔ)上，將重組的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，形成大量與親代分子完全相同的子代DNA分子的過程。 2基因克隆載體能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的一類DNA分子3核酸分子雜交具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過程。 4復(fù)性變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或退火或雜交。 5核酸探針指帶有放射性同位素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的某種特定的DNA或RNA片段6Southern印跡將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。 7Northern印跡是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 8原位雜交即將細(xì)胞涂片或組織切片適當(dāng)處理后，用探針直接與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交9PCR技術(shù)體外酶促合成大量特異DNA片段的方法，由高溫變性、低溫退火和適溫延伸反應(yīng)組成一個(gè)周期循環(huán)進(jìn)行，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。 10基因表達(dá)生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，合成具有特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)的全過程。 11基因表達(dá)調(diào)控機(jī)體各種細(xì)胞中含有的相同遺傳信息，根據(jù)機(jī)體不同的發(fā)育階段、組織細(xì)胞及功能狀態(tài)，選擇性、程序性地表達(dá)特定數(shù)量的特定基因的過程12操縱子一個(gè)多順反子轉(zhuǎn)錄單位與其調(diào)控序列即構(gòu)成操縱子13順式作用元件指某些能影響基因表達(dá)但不編碼新的蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列，按照功能分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、負(fù)調(diào)控元件等。 14啟動(dòng)子是在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)近端的一組具有獨(dú)立功能的DNA序列。 15增強(qiáng)子指位于啟動(dòng)子上游或下游并通過啟動(dòng)子增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄效率的DNA順序。 16沉默子（衰減子）指在真核基因內(nèi)能抑制基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列,與反式作用因子相互結(jié)合而起作用。 17反式作用因子指能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各順式作用元件核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)。 18癌基因細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長和分化的基因，它的結(jié)構(gòu)異常或表達(dá)異常，可以引起細(xì)胞癌變19抑癌基因是指能抵消癌基因作用，阻止細(xì)胞癌變的基因。 20細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋21基因診斷是一種新的臨床診斷方法，是在基因水平上對(duì)疾病或人體狀態(tài)進(jìn)行診斷。 22基因治療就是將外源性正常基因?qū)氲讲∽兗?xì)胞或體細(xì)胞中，以替代或補(bǔ)償缺陷基因的功能，或抑制基因的過盛表達(dá)，從而達(dá)到治療遺傳性或獲得性疾病的目的。 亡小體，而被其他細(xì)胞吞噬。 23基因重組某些基因片段改變?cè)瓉泶嬖陧樞蚨匦屡帕薪M合，成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。 調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物多樣性24TM變性DNA占DNA總量的50時(shí)的溫度稱為這種DNA的溶解溫度（TM值）。 25質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子26反轉(zhuǎn)錄PCR以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板來擴(kuò)增，即為反轉(zhuǎn)錄PCR。 ）27限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）中國性突變?cè)斐闪诵蛄猩系亩鄳B(tài)性，不少序列多態(tài)性在限制酶識(shí)別位點(diǎn)上，產(chǎn)生限制酶酶切位點(diǎn)的多態(tài)性，用該限制酶水解DNA就會(huì)產(chǎn)生長度不同的片段，稱為RFLP。 28引物RFLP。 28引物由人工合成的，與擴(kuò)增片段兩翼互補(bǔ)的兩段寡核苷酸單鏈，其特征是單鏈DNA片段。 29載體是指攜帶有目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的一類DNA分子。 簡答題1基因表達(dá)調(diào)控的研究技術(shù)簡答題1基因表達(dá)調(diào)控的研究技術(shù)1電泳遷移率改變分析；2DNase足跡法；3甲基化干擾足跡法4氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶分析；5Run-on分析。 2RB基因功能1可以和腫瘤抗原相互作用；2RB產(chǎn)物可抑制部分致癌蛋白；3RB還有抑制細(xì)胞增殖的作用3P53功能1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及抑制細(xì)胞生長的作用；2抑制DNA復(fù)制；3參與程序性細(xì)胞凋亡。 4細(xì)胞凋亡的生物形態(tài)學(xué)改變4細(xì)胞凋亡的生物形態(tài)學(xué)改變1凋亡的起始；微絨毛消失，細(xì)胞間接觸消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中，線拉體大體完整，染色質(zhì)固縮。 2細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面3凋亡小體的形成。 核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍4凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。 5細(xì)胞凋亡的研究方法1形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡；熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡；電子顯微鏡。 2生物化學(xué)法檢測(cè)3分子生物學(xué)檢測(cè)6基因治療二步法指外源基因克隆至合適的載體，首先導(dǎo)入體外培養(yǎng)的自體或異體細(xì)胞，經(jīng)篩選后將能表達(dá)外援基因的受體細(xì)胞重新輸回受試者體內(nèi)。 方法包括磷酸鈣共沉淀法；脂質(zhì)體介導(dǎo)法；電穿孔法；基因槍；受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；顯微注射法。 7EMSA(電泳遷移率改變分析)技術(shù)原理和簡要流程原理同位素標(biāo)記的DNA片段與核蛋白提取物孵育一定時(shí)間,用電泳檢測(cè),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與DNA片段結(jié)合后,分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離的核苷酸片段,其電泳遷移率下降,出現(xiàn)滯后條帶流程1)提取核蛋白2)合成探針:3)標(biāo)記探針4)結(jié)合反應(yīng)5)電泳6)放射自顯影8細(xì)胞癌變的分子機(jī)制1致癌病毒的轉(zhuǎn)化作用2原癌基因的激活3抑癌基因的失活9復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)遺傳物DNA-DNA DNA-RNA RNA-DNA酶DNA聚合酶等RNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶底物dNTP4種NTP dNTP引物RNA引物不需要RNA引物10原癌基因產(chǎn)物的基本功能1正常情況下參與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)，促進(jìn)增殖2與某些細(xì)胞分化相關(guān)11載體的種類,載體應(yīng)該滿足的條件分類1按功能分為克隆載體表達(dá)載體整合載體2按分為質(zhì)粒載體噬菌體載體病毒載體條件 1、有復(fù)制起點(diǎn) 2、有選擇性標(biāo)記 3、有一段多克隆位點(diǎn) 4、分子量小5容易分離純化 6、表達(dá)載體要有調(diào)控元件12基因克隆的特點(diǎn)和技術(shù)路線特點(diǎn)1跨物種性；2大量擴(kuò)增；3無生命到有生命路線分（分離制備目的DNA片段和載體）切（目的DNA與載體的剪切）接（目的DNA與載體的連接）轉(zhuǎn)（重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞）篩（篩選并鑒定陽性克隆，大量擴(kuò)增）擴(kuò)（重組體的大量擴(kuò)增和目的基因表達(dá)）13Southern印跡基本方法定義將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。 方法DNA標(biāo)本提取消化標(biāo)本電泳分離堿變性中和轉(zhuǎn)印烘干固定預(yù)雜交與32P標(biāo)記探針雜交放射自顯影確定探針互補(bǔ)DNA的位置，從而確定在酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 14Northern印跡基本方法定義將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 方法提取組織細(xì)胞總RNARNA定量變性膠電泳轉(zhuǎn)膜干膜預(yù)雜交雜交洗膜壓片洗片圖像分析。 15提取RNA的注意事項(xiàng)1避免外源性RNase的污染高壓滅菌離心管；戴手套操作；三蒸水配試劑。 2避免內(nèi)源性RNase的污染應(yīng)用RNase抑制劑；應(yīng)用蛋白變性劑；應(yīng)用非特異性變性劑。 16Western免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。 對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測(cè)。 是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法17探針的標(biāo)記方法、原理1缺口平移法（利用大腸桿菌聚合酶1的活性將標(biāo)記的dNTP摻入到新合成的DNA鏈中，合成高比活的均勻標(biāo)記的DNA探針）；2隨機(jī)引物法（DNA聚合酶可利用隨機(jī)引物，沿單鏈模板進(jìn)行DNA的合成）；3末端標(biāo)記法（只將DNA片段一端進(jìn)行標(biāo)記，來得到全長DNA片段，活性不高）；18PCR引物設(shè)計(jì)原則1引物長度為15-30個(gè)核苷酸2G+C含量在40-60%之間3堿基隨機(jī)分布4自身不應(yīng)存在互補(bǔ)系列5兩引物之間也不存在多于4個(gè)以上同源或互補(bǔ)系列。 6保守性與特異性73端不能進(jìn)行修飾，不能形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)。 8引物5端可以修飾9避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。 19PCR原理1高溫變性通過加熱使DNA雙鏈間的氫鏈斷裂，形成單鏈DNA。 2低溫退火將反映混合液冷卻至某一溫度，使引物與靶序列退火，引物與其互補(bǔ)的模塊在局部形成雜交鏈。 3適溫延伸在DNA聚合酶和四種dNTP底物及Mg存在的條件下，退火引物沿53方向得以延伸。 以上每三步為一循環(huán)，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增量為2的30次方個(gè)拷貝。 基因攜帶遺傳信息的一段特定的核苷酸序列，可自我復(fù)制并指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。 基因組一個(gè)生物體所包含的全部遺傳信息的總和，即全部DNA序列。 遺傳密碼DNA堿基序列與蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間存在的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 起始密碼AUG終止密碼UAA UAGUGA變性定義通過加熱、化學(xué)因素（尿素或者甲酰胺）等外力作用DNA解螺旋，由雙鏈變成單鏈稱為DNA變性，Tm值變性DNA占DNA總量的50時(shí)的溫度稱為這種DNA的溶解溫度復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代DNA為模板，以dNTP為原料，在相關(guān)酶的催化下，按照堿基互補(bǔ)原則，半保留復(fù)制方式合成子鏈DNA的過程。 半保留復(fù)制不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。 底物:4種NTP53方向，通過磷酸二酯鍵連接重組DNA利用酶學(xué)方法，將不同的DNA分子（目的DNA分子和載體）在體外進(jìn)行特異切割、重新連接，組裝成一個(gè)新的DNA分子。 基因克隆總體的技術(shù)路線1.分離制備目的DNA片段和載體2.目的DNA與載體的剪切3.目的DNA與載體的連接4.重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞5.篩選并鑒定陽性克隆，大量擴(kuò)增6.重組體的大量擴(kuò)增和目的基因表達(dá)定向克隆使目的基因片段定向插入載體分子中的方案。 復(fù)性變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或退火或雜交。 Southern印跡將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。 1、提取基因組DNA 2、定量1OD260=50?gDNA 3、酶切 4、進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳 5、變性用變性液（含NaOH）浸泡。 6、中和Tris.cl（pH8.0）中和強(qiáng)堿。 7、轉(zhuǎn)移到固相支持物上虹吸法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法 8、固定、干燥可選擇下述方法進(jìn)行固定紫外線固定使用短波紫外線（254nm）照射10-20分鐘，簡單漂洗后干燥備用。 尼龍膜置+120烘烤30分鐘。 NC膜置真空烤箱中，80減壓烘烤2-2.5小時(shí)，以避免硝纖膜自熔。 若無真空烤箱，亦可在普通烤箱中65-70烘烤3-4小時(shí)，也能達(dá)到固定目的。 固定后，將膜封于塑料袋中，保存于干燥處待雜交。 9、保存4保存?zhèn)溆谩?Northern印跡原理RNA經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上。 經(jīng)過雜交，分析mRNA的大小及含量。 方法提取組織細(xì)胞總RNARNA定量變性膠電泳轉(zhuǎn)膜干膜預(yù)雜交雜交洗膜壓片洗片圖像分析。 1、提取RNA 2、RNA定量A.定量1OD260=40?gRNA B.純度OD260/OD2801.8C.完整性電泳檢查，判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳的主要目的之一。 完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應(yīng)可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶，且28s rRNA的亮度應(yīng)為18s rRNA的兩倍。 3、變性電泳RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。 在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，但是無法確定分子量。 只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動(dòng)率才與分子量成正比。 NC結(jié)合RNA的能力遠(yuǎn)比DNA差，但當(dāng)有變性劑嵌入RNA中后，NC結(jié)合其能力大大增強(qiáng)。 4、轉(zhuǎn)膜 5、固定提取RNA應(yīng)注意避免外源性RNase的污染1用新的離心管等都是新的，高壓滅菌的2干凈的玻璃器皿，戴手套操作3試劑用DEPC處理的高壓滅菌的三蒸水配試劑0.1%焦碳酸二乙酯（100ml水中加入0.1g）,37過夜后,高壓滅菌避免內(nèi)源性RNase的污染a.應(yīng)用RNase抑制劑RNasin（特異性抑制劑）b.應(yīng)用蛋白變性劑酚、SDS、氯仿c.其他硫氰酸胍，異硫氰酸胍（非特異性抑制劑）探針用于檢測(cè)的帶有標(biāo)記的已知核苷酸片段。 核酸探針的標(biāo)記方法缺口平移法先用DNA酶在雙鏈DNA分子的一條鏈上制造一些缺口。 大腸桿菌DNA聚合酶I具有53DNA聚合酶活性，以相對(duì)應(yīng)的鏈為模板，從切口處3-OH端逐個(gè)加入新的核苷酸，此酶還具有53外切核酸酶活性，可從切口的5端逐個(gè)切去核苷酸，造成切口平移。 若反應(yīng)體系中存在一種或多種標(biāo)記的核苷酸，如-32PdNTP，則隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些標(biāo)記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標(biāo)記的DNA探針。 缺口平移法適用于標(biāo)記大于1kb的雙鏈DNA。 2、隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用隨機(jī)引物，沿單鏈模板進(jìn)行DNA的合成。 原理是使長68nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以每一個(gè)退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應(yīng)時(shí)將-32PdNTP摻入合成鏈，即得到標(biāo)記。 變性處理后，新合成鏈（探針片段）與模板解離，即得到無數(shù)各種大小的探針DNA。 因?yàn)樗霉押塑账崞魏芏蹋诘蜏貤l件下可與模板DNA隨機(jī)發(fā)生退火反應(yīng)，因此被稱為隨機(jī)引物（random primer）。 這種隨機(jī)引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。 3、末端標(biāo)記只將DNA3端或5端標(biāo)記的方法3端標(biāo)記、DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法(圖7-3)。 用該酶將含有核素標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平切口或粘性末端。 、T4DNA聚合酶標(biāo)記法。 加入dNTP后抑制外切活性可將標(biāo)記的dNTP進(jìn)行填充標(biāo)記。 PCR技術(shù)是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，亦稱為無細(xì)胞分子克隆技術(shù)。 它是以待擴(kuò)增的雙鏈DNA為模板，以一對(duì)人工合成的寡核苷酸為引物，以四種dNTP為底物，通過耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，經(jīng)過變性、退火、延伸的循環(huán)快速特異地?cái)U(kuò)增出特定的DNA片斷。 簡單的講，PCR技術(shù)即體外酶促大量合成特異DNA片段的方法，由高溫變性、低溫退火和適溫延伸反應(yīng)組成一個(gè)周期循環(huán)進(jìn)行，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。 高溫變性9430s1min低溫退火55(Tm-510)30s適溫延伸7230s1min PCR循環(huán)過程引物是人工合成的兩段寡核苷酸單鏈，一個(gè)引物與目的基因的一條DNA模板鏈的一端互補(bǔ)，另一個(gè)引物與目的基因的另一條DNA模板鏈另一端互補(bǔ)。 順式調(diào)控元件真核基因的順式調(diào)控元件是基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄的DNA序列。 增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)增強(qiáng)子提高DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離起作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。 增強(qiáng)子的作用與其序列的正反方向無關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。 增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，沒有啟動(dòng)子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。 增強(qiáng)子必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。 沉默子負(fù)性調(diào)節(jié)元件，起阻遏作用。 沉默子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對(duì)基因的表達(dá)起作用。 反式作用因子(trans-acting factor)1為DNA結(jié)合蛋白，可使鄰近基因開放（正調(diào)控）或關(guān)閉（負(fù)調(diào)控）2通用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)因子。 TFA、TFB、TFD、TFE等3轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合在上游啟動(dòng)子元件上的蛋白質(zhì)因子反式作用因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域DNA識(shí)別結(jié)合域；轉(zhuǎn)錄活性域；結(jié)合其他蛋白的結(jié)合域反式作用因子的特點(diǎn):能識(shí)別并結(jié)合順式作用元件一種反式作用因子與多種DNA元件作用,發(fā)揮不同的調(diào)控功能。 一種元件與多種蛋白相互作用，少數(shù)直接結(jié)合，多數(shù)為反式因子之間相互作用再與DNA結(jié)合。 都是通過構(gòu)象的細(xì)微變化來實(shí)現(xiàn)的。 反式因子的構(gòu)象具有很大的可變性和可塑性，可通過不同的組合程序來發(fā)揮多種調(diào)控效應(yīng)。 電泳遷移率改變分析（e lectrophoreticMobility ShiftAssay,EMSA）1.原理:同位素標(biāo)記的DNA片段與核蛋白提取物孵育一定時(shí)間,用電泳檢測(cè),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與DNA片段結(jié)合后,分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離的核苷酸片段,其電泳遷移率下降,出現(xiàn)滯后條帶。 2.目的1）可檢測(cè)目的基因調(diào)控序列是否存在反式因子的結(jié)合位點(diǎn)。 2）可檢測(cè)核內(nèi)是否存在與順式作用元件結(jié)合的反式因子。 3.基本過程:1)提取核蛋白2)合成探針:合成所需的順式作用元件(8-12bp的DNA片段)3)標(biāo)記探針:末端標(biāo)記(37,10分鐘)4)結(jié)合反應(yīng):核蛋白+標(biāo)記探針室溫反應(yīng)30分鐘5)電泳:高壓電泳,低溫下進(jìn)行6)放射自顯影:-70DNase足紋法是一種測(cè)定DNA結(jié)合蛋白在DNA上的精確結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法。 1.原理及操作過程DNA結(jié)合蛋白與其特異的DNA序列結(jié)合，可保護(hù)其結(jié)合序列免受DNase的作用。 首先將待測(cè)雙鏈DNA片段中的某一條單鏈的一端進(jìn)行標(biāo)記，然后用適當(dāng)濃度的DNase與其作用，使DNA雙鏈上形成隨機(jī)的切口，經(jīng)變性電泳分離和放射自顯影后，在X光片上可見只差一個(gè)堿基的梯形DNA條帶。 但當(dāng)DNA結(jié)合蛋白與標(biāo)記的DNA作用后，結(jié)合的序列未受DNase的作用，因而在放射自顯影圖譜上就形成一個(gè)空白區(qū)。 甲基化干擾足跡法甲基化干擾法原理與DNase足紋法正好相反，即DNA先用甲基化試劑進(jìn)行隨機(jī)修飾，然后用DNA結(jié)合蛋白與此DNA進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，由于被修飾的DNA結(jié)合位點(diǎn)，不能與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，這樣就可以分離并回收結(jié)合和未結(jié)合蛋白的DNA，并用特殊方法將DNA從被修飾的堿基處進(jìn)行切割，而結(jié)合蛋白的DNA由于未被修飾而不能被切割，但結(jié)合位點(diǎn)外的被修飾區(qū)域仍有切割，這樣結(jié)果與DNase足紋法相同，在結(jié)合位點(diǎn)形成一個(gè)空白區(qū)。 癌基因(oncogene)細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長和分化的基因，它的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常，可以引起細(xì)胞癌變。 命名3個(gè)字母，如abl、myc、ras等病毒癌基因(virus oncogene，v-onc)病毒攜帶的，能引起靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化（癌變）的基因。 原癌基因的表達(dá)特性 1、具有細(xì)胞周期特異性 2、具有組織特異性 3、具有分化特異性P53蛋白的分子功能A、分子警察阻止含有受損DNA的細(xì)胞進(jìn)入分裂期B、作用于轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞周期抑制細(xì)胞生長、觸發(fā)凋亡、為cyclin A的負(fù)調(diào)控因子細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，而被其他細(xì)胞吞噬。 凋亡時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變? （1）凋亡的起始；微絨毛的消失，細(xì)胞間接觸的消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中，線拉體大體完整，染色質(zhì)固縮。 ? （2）細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面。 ? （3）凋亡小體的形成。 核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，被反折的細(xì)胞膜所包圍。 ? （4）凋亡小體逐漸被周圍專