527-RACE心得體會.doc

如果您順的話，一個禮拜足矣！同意，5-RACE確實比較難，但也有順利的時候，我上周做5-RACE也一次就成功了，我覺得關鍵還是RNA 的質量，如果RNA模板質量不好，后面做得再認真也是白費！當時要克隆基因的5GC含量達到了80%，一般的反轉錄酶和PCR都拿不到，后來加了海藻糖60度反轉錄一個小時后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才擴出來，當時就為了這個5端，很是費了力氣。如果RCR產物不是很特異或沒有目的條帶的話，建議用nest PCR。在做5時，對RNA要求比較高，最好用新鮮的組織提，隨即做逆轉錄，擴增。做RACE PCR條帶單一的不多，盡可能的回收與目的片段大小相近的條帶?？寺〉臅r候，一般kit上建議挑8-10個克隆，多一個，多一份希望，因為RACE，尤其是5太難了，我作了約6個月。偶沒有買試劑盒，自己合成了3條引物，買了反轉錄酶。然后一次就出來了。RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，這個方法我也試過很多次了，方法很簡單，但是作出來效果非常的不理想。PCR出來的東西都是雜七雜八的東西，更多的時候是彌散的條帶。SmartRace 既然稱之為Smart，因為它的引物能特異的識別5端帽子位點，因此排除了所有非完全的逆轉錄。再加上使用基因特異性引物，使其做出來的可能性更大。這個方法省錢，但是我不是很看好，祝好運。另，建議你不要用oligodT進行逆轉錄，在基因mRNA300bp處設計一條或幾條基因特異性逆轉錄引物更好。希望你能有好結果。我剛做過5、3 RACE，我個人的經驗如下：1、首先，提的RNA必須完整，最好跑個RNA電泳來驗證一下；2、設計引物時要注意：Tm最好大于70度，兩引物間要有100-200bp的重疊區(qū)；3、用巢氏PCR相對容易出結果；4、如果出現多個條帶，要分別驗證；5、PCR過程中，我一般分兩次，第一次用touchdowm PCR，后產物稀釋50倍，作二次，72度盡量長一點，我們一般用2-3min；6、結果分析，最好是重疊區(qū)吻合，否則，應重新做。這里有兩個原因：1、Tm大于70度，好做touchdown PCR；2、相應加長引物，可以更有效地擴增，尤其是針對豐度低、比較難擴的產物。RACE是采用PCR技術由已知的部分cDNA順序來擴增出完整的cDNA 3 和5 端的方法，又被稱為單邊PCR(one-sided PCR)和錨定PCR(anchored PCR)。3-RA CE的般過程是：以oligo(dT)17和在許多文章中被稱為錨引物(anchor primer)或接頭(adaptor)的序列組成的引物QT逆轉錄mRNA得到第一條cDNA鏈，然后用含部分錨引物序列的引物Q0與基因特異性引物GSP1進行第一輪擴增得到雙鏈cDNA ，第二輪擴增則采用內部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止產生非特異性擴增產物。采用同樣的原理可以進行5-RACE,先用基因特異性引物GSP-RT逆轉錄mRNA 獲得cDNA第一條鏈I然后用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 端加上poly(A)尾巴再使用(1)QT引物合成cDNA第二條鏈；(2)Qo和一個在GSP-RT上游的引物GSP1擴增cDNA,最后采用內部引物Q1和GSP2進行第二輪PCR擴增以提高特異性。擴增后得到的雙鏈cDNA用限制性內切酶酶切和Southern雜交分析并克隆，得到5特異性和3特異性的cDNA文庫。從兩個有相互重疊順序的5和3 RACE產物中可以獲得全長cDNA，或者可以分析5 和3 端順序，合成相應引物擴增出全長cDNA 。目前,對于擴增基因的5端還沒有一種完美的技術,RACE 也不例外,特別是5RACE 對于得到的克隆(經檢測后為陽性克隆),通用的做法是挑選10個以上的單克隆送去測序.就我個人經驗,也是挑了5個才測到我的目的基因的.建議你用clontech 的smart race試劑盒,我以前用的也是TAKARA的,結果做了N 次都沒出來,換試劑盒后一次就做出來了.合成單鏈CDNA后,用TAQ酶來合成第二條鏈,也就是相當于雙鏈DNA中的另一條鏈,用的是上游引物,按照堿基互補的原理,在酶的作用下完成.我剛剛做過RACE，其實當時本來買試劑盒準備建cDNA文庫的，但是庫建的不好，雜交了好幾次都沒雜出東西來，后來用它的接頭引物和基因特異性引物擴增，最初只設計了特異性引物的巢式引物，最初擴不出東西來，后來把接頭引物也設計了內部引物，而且pcr時把模板的量加大，因為可能模板少也很難擴出來，我們都用該方法擴的，都出來了，當然有時有多條帶需驗證是否單引物擴增產物。這是我做實驗的體會，祝大家早日出結果。SMARTTM 5-RACE的原理是先是利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準第一鏈cDNA。利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到第一鏈的5末端時自動加上3一5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后，轉換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭(figure 2 )。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物，用一個基因特異引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5末端的cDNA片段擴增出來。最終，從2個有相互重疊序列的3 / 5-RACE產物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產物的3和5端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。我們在實驗中發(fā)現，要做好RACE反應實驗不容易，實際操作中仍存在不少困難。因此，對RACE反應條件進行反復摸索是實驗必須要做地。這是因為:第一，在5-RACE包含了有3個連續(xù)的酶反應步驟(反轉錄、同聚物加尾和PC R擴增)，每一步都可能導致失敗;第二，擴增。DNA末端的特異性完全依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品不均一性，因而特異性一般很低，常呈現不清晰的成片條帶或截短的產物背景。因此，使用RACE技術擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆最好能夠全部測序，以排除RACE實驗結果中擴增產物假陽性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。我們相信，第一鏈，同時利用它的加尾特性在合成的cDNA鏈3加上3-4個dCTP，而且當帽子結構存在時該酶的加尾活性最高（對全長分子的富集機制），隨后這3-4個堿基與體系中事先加入的引物（該引物的3端有3-4個dGTP）配對，MMLV繼而以聚合酶活性將配對引物補成雙鏈。目前基于該技術的試劑盒只有Clontech公司生產，全名為SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程見圖：該方法的突出優(yōu)點就是操作簡便，成功率較高，全場分子的比例較高。cDNA第一鏈的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中對mRNA和cDNA鏈的反復操作，降低了mRNA降解和合成產物丟失的風險，使本來就含量甚微的全長分子得到最大保存，所以這種方法得到了廣泛認可，應用最多。如果加上RNA提取時間，這種技術可以在3個小時內得到加上接頭的cDNA產物，最大限度地降低了mRNA的降解風險。2、Oligo capping method方法（又稱RLM-RACE）是由日本東京大學鈴木等人開發(fā)，可以更精確的定位轉錄起始位點。我們知道真核生物的mRNA具有一個3尾巴和一個5帽子結構，該技術正是利用5端的帽子特性對全長分子進行富集和擴增。降解的mRNA5端都有一個磷酸基，用堿性磷酸酶去掉該磷酸基，隨后用煙草酸性焦磷酸酶去掉帽子結構，則全長分子的5端會暴露出磷酸基，隨后的連接步驟中錨定引物將特意的加在全長分子的5端而不會和降解的分子連接（全長分子的富集機制）。目前基于該方法的試劑盒有TaKaRa（5-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）兩家都有生產，步驟如圖：該方法的最大優(yōu)點就是全長分子的比率高，可以說只要是擴增產物就肯定是全長分子。但是該方法的最大缺點是操作復雜，而且都是針對mRNA分子進行操作，使mRNA分子降解的風險極大提高，所以成功率不是很高。對于新手和實驗室條件較差者不推薦使用該試劑盒。3、Self-ligation技術?；蛱禺愋裕ɑ蛘逴ligodT）反轉錄合成cDNA第一鏈，RNase H降解雜合鏈中的RNA，連接酶連接純化后的cDNA鏈，在已知片段上設計反向PCR引物進行未知片段的擴增。該試劑盒寶生物以前有售，現在已停產，原理如圖：該試劑盒想法十分好，但是由于沒有全長分子的富集機制，得到全長分子的幾率比較低。而且在實際使用中它的擴增片段都比較短，不能滿足實驗要求。4、Anchored PCR方法。利用一條基因特異性反轉錄引物，在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，將RNA-DNA雜合鏈中的RNA降解純化后，利用末端轉移酶在cDNA鏈的3端加入PolyC尾巴（尾巴長度不能確定），然后利用abridged anchored primer和一條基因特異性引物擴增（可能需要巢式PCR才能得到結果）。該試劑盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5RACEsystem for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作簡圖如下：該法最大的缺點是全長分子的比率較低，而且操作復雜，整個實驗流程需要耗費超過一天的時間。這種方法沒有像SMART和Oligo capping method中那樣采取對完整分子的富集機制，所以它依賴于高質量的反轉錄酶（具有通讀復雜二級結構的能力、具有較高的反應溫度）和高質量的RNA，否則得到全長分子的幾率會很低。你這個就是利用的invitrogen的5RACE試劑盒的原理啊。自己只需要買TdT和dCTP就行了，既方便又省錢，我們實驗室就是這樣做的。RT產物的純化只需要用普通的膠回收試劑盒就行了，我們實驗室用的是Omega的。至于第二點的話當然可行啊，你有什么顧慮呢？呵呵，300bp應該不難。建議你，做每一步時都有個證明每個步驟是否出錯得對照。模版的質量應該要高。我做了一次，每次溫度都有條帶，也包括我要的大小的這不回收了，準備節(jié)后測序呢。有人告訴我，第一輪的溫度只要是軟件建議的溫度就可以了，第二輪則比你一輪高3-5度，然后多5-10個循環(huán)就可以了。我覺得做race關鍵就是提rna，只要這部沒有問題，其他的都好說了。恭喜sos888151000，5做完了，3就容易多了。我們實驗室根據Invitrogen的5RACE原理，自己買試劑，也能做出5RACE。也就是做個錨定PCR。模板RNA的質量非常重要。略有不好，5-RACE就很難出結果；3容易一些RACE在我們實驗室也做了一些,目前擴了8個FL,還算有點經驗和教訓.TAKARA和INVTROGEN的都試過,感覺INVITRO的好些,但是都做出來了.首先,我認為mRNA質量很關鍵,但是最重要的你的目標基因的豐度,如果豐度夠高,還是比較容易做的,所以一般來說我們在做RACE之前都會做個TISSUE DISTRIBUSION.其次,5-RACE的關鍵是出帶,帶出來了,一般情況都是特異性的,不需要過多的驗證.3-RACE不一樣,需要一對存在于已知片斷里面的保守引物做驗證和篩選,這可以節(jié)省很多的時間和金錢.千萬不要試圖用AUAP這種通用引物做驗證和篩選,成功率很低.最后說說試劑的選擇吧,TAKARA用的是試劑盒,感覺比較便宜,但是成功幾率較小(做3次才成功).不過它配的RT-PCR酶比較好,是AMV.而INVITRO的感覺沒必要買他的試劑盒,因為價格貴,而且里面大多數東西都用不到.INVITRO的我是單獨買的tdt,SUPERSCRIPT III,以及AAP,其余的用其他公司的代替,引物直接合成(如AUAP).這樣成本會大大下降.不過記住,在做5-RACE的時候,產物純化試劑盒一定用進口的,國產的效率太低,而且DTT似乎去不干凈.這兩個試劑盒的PROTOCOL條件似乎都不怎么好(不知道是不是在我們實驗室水土不服),需要自己摸索條件,特別是在MG濃度和TM上面,我們一般都是用GRADIENT.PCR的酶一般的就可以,我們都是用國產的.我也做RACE呢,也是沒有出來，我覺得引物最重要,侃侃你的引物合適么?還有cDNA,作個內參;dNTP不能反復凍溶;最好分裝,等液體完全融化后在加樣品!簡要整理了一些基本的東西，希望有用。RACE（cDNA末端快速擴增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一種獲得轉錄本5或3未知序列的方法。不象普通RT-PCR那樣使用兩個序列特異性的引物，RACE使用一個序列特異性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3 RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚體（5RACE）。RACE的產物可以用來克隆，直接測序，制備探針或連接在一起得到全長cDNA。其中一個連接5 和3 RACE產物的方法是使用由5 及3 RACE得到的序列信息設計新的引物，以擴增全長的cDNA。使用RNaseH-的逆轉錄酶和高保真的熱穩(wěn)定聚合酶可以對較長的序列進行高保真的擴增，從而得到全長cDNA克隆。RACE已經被用于擴增和克隆稀有mRNA。5 RACE步驟概要 ：第一鏈引物，GSP1，同mRNA退火使用SuperScript將mRNA轉錄成cDNA使用RNase混合物降解RNA純化cDNA （可以使用試劑盒）使用dCTP和TdT對純化的cDNA加尾使用簡并的錨定引物和巢式GSP2 PCR擴增帶有dC尾的cDNA使用巢式GSP重新擴增初步PCR產物。5 RACE的產物可能是單一產物、多個產物，甚至是不能分辨的連續(xù)條帶。結果的質量取決于用來合成第一鏈和擴增的GSP的特異性、擴增所使用錨定引物的特異性、目的mRNA的復雜度和豐度及產物的長度。使用巢式引物擴增（最多可以三輪巢式擴增），并在連續(xù)幾輪擴增中使用長度選擇性的擴增產物作為模板可以增加5 RACE的特異性。增加逆轉錄保溫溫度和PCR退火溫度，并降低擴增反應中的鎂離子濃度可以促進特異性。5 RACE的靈敏度受所使用的逆轉錄酶和cDNA 3 末端抑制cDNA加尾的二級結構影響。cDNA的不完全合成降低了全長產物的產量，并導致某些模板產生連續(xù)條帶。因為SuperScript產生更多的全長cDNA，所以可以提高5 末端序列檢測的水平，尤其是對于小于1kb的轉錄本。雙鏈3 末端和發(fā)卡結構會通過減少用于加尾的3 羥基而破壞cDNA的加尾。cDNA的起始保溫溫度在94并隨后在冰上冷卻有助于破壞二級結構。一些困難模板可能需要加入DMSO輔助加尾。加尾酶末端脫氧核苷轉移酶可以耐受最多20的DMSO。各位GGJJ:我初次做RACE,我老板資金有限我沒有用試劑盒.用的自己的方法.第一次P用的降落PCR,出來的條帶呈彌散狀.我用這個產物做巢式PCR,結果沒有條帶.怎么辦呢?是不是引物不行?望各位大蝦賜教啊!我用的方法是（1）用oligo dT 得到 cDNA，用的寶生物的試劑盒；（2）純化 cDNA，用的申能博采的PCR純化試劑盒；（3）用 TdT（末端脫氧核糖核酸轉移酶）將 cDNA 的 3 末端加上 dCTP；（4）以 3 末端加上 dCTP 的 cDNA 為模板進行第一輪 PCR，上游引物使用從 5 至 3 依次為含有酶切位點的通用引物序列 + 10 個 dG，比如 5- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3下游引物使用基因特異的引物；（5）為提高特異性，第一輪 PCR 使用含有多個 dG 的通用引物和比較靠近基因 3 末端的特異引物，第二輪 PCR 以第一次 PCR 產物為模板，引物則使用含有多個 dG 的通用引物和比較靠近基因 5 末端的特異引物；（6）PCR 產物電泳，回收，連接相應載體1 首先考慮你RACE基因的大小，1.5kb左右的片段按照這個方法作出來的可能性比較大，超過1.5kb就不太容易了。2 cDNA的純化建議使用寶生物的核酸共沉劑，用PCR純化試劑盒回收cDNA效率應該不會太好。3 PCR酶的選用和引物設計也很重要，你選用的5- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3在5端存在二級結構，開鍵的自由能較大，建議該為5-CGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG -34 RT-PCR的模版含量可能過高，建議稀釋十倍后使用。有很多時候采用濃度低的cDNA反而刻意達到較為滿意的試驗結果。1、想知道你的已知片斷是多大的，要是很大，設計反轉錄引物的時候應該考慮從已知cDNA序列片斷中靠近5端設計特異性引物，控制已知部分反轉錄產物500bp-600bp。當然，如果你的未知片斷很大，還要適當縮小已知片斷。特異性反轉錄可以去掉好多干擾。2、不買試劑盒，也可以按照試劑盒的方法去做，考慮環(huán)化，比加尾效率要高。3、 模板量要稀釋。5RACE最重要的是RNA沒有問題。然后再做后來的工作，不知道你用的是什么樣的試劑盒，我覺得逆轉錄酶很重要，我嘗試了用各種方法，包括你的末端加尾的方法都沒有成功，可能這種方法真的得不償失。后來用了clonetech的逆轉錄酶和它的寡核苷酸鏈，很快就做出來了，其他的引物自己設計就可以了。經驗：1?？俁NA質量要高，先電泳看28s18s，28s亮度應該是18s的2倍。2?？俁NA的量可遠大與其要求的上限5ug，但要相應延長酶反應時間。3。pcr條件要自己摸，gsp的量可參考其要求的量，但其要求的dNTP量似乎偏大，自己要摸一下的dNTP量。4。一定要用高保真酶taq酶。附上我的race pcr電泳圖。第一你的這段序列是來在實際測序還是從預測序列得到的？如果是從網上下載的，那你就要注意這里面就有不可信了。我作5race，根據預測序列設計的引物就有問題如果是你實際測的序列，那么你就要考慮引物設計的因素了。不知道你用的是那個公司的試劑盒。我是參照bd公司的smart race kit manual做的。我作race的時間也不長，只能把我的感受到的有限的經驗教訓告訴你，不對之處請大家指正。1.引物設計要遵循一般引物設計的原則。盡量避免發(fā)夾結構（實在避免不料了要選取發(fā)夾形成堿基不超過5個的）。瞅了一下你的引物，我認為引物的5盡量以g/c開頭，但是按照分子克隆上說，5最前端不要連著出現gc，這樣結合特異性會降低。2，我采用的是bd公司的策略，他要求設計的引物Tm最好大于65度。后來在實驗中證明這一點還是有道理也比較關鍵的。因為按照試劑盒說明書，它作5race時3gsp是和上游的通用引物配對的，通用引物中有一種長引物，tm很高，也很長，這就要求特異引物tm高一點。3 5race確實存在難度，加之race技術本來有說不清的東西。你沒有作出來未必是因為引物的問題。如果你普通的pcr沒有結果，可以試試touchdown pcr但是實際上我倒覺得touchdown 不好作，我拿普通的pcr作出來了，touchdown條件一直掌握不好，易出現彌散4，建議你設計引物不要設計一條，最好設計幾條，尤其是針對5race你可以設計幾條有一定間隔、但是距離不很遠的引物。好處在于，a）萬一拿一條作不出來可以試試其他的，節(jié)省時間；b）可以拿最下游的引物與5通用引物配對先擴，如果擴出來得效果不好，可以拿這一輪pcr產物作模板，以該3gsp稍微上游一點的引物再和通用引物配對擴增更多的情況是，race很容易出現非特異性帶，拿這種類似與巢式pcr的策略可以減少非特異帶，或者判斷條代5 最后建議你5race時，3gsp接近5端為好，但是我?guī)熜纸ㄗh我擴增條代短一點擴增的效率和幾率要大一些。好的引物所具有的令人滿意的特點：* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。* 選擇GC含量為40到60或GC含量反映模板GC含量的引物。* 設計5端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。* 避免引物對3末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。* 避免3末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。* 避免3末端的錯誤配對。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。5Race是很難做呀。你這種情況我覺得是特異引物不特異。我的建議是先按照一般pcr的優(yōu)化方式試試看。比如：降低模板濃度（梯度），用降落PCR，熱啟動，降低酶濃度