農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 摘要 采用不同 D600 nm 值的農(nóng)桿菌菌液浸泡甘藍 種子 研究農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的 影響 并檢測其轉(zhuǎn)化效果 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 農(nóng)桿菌浸種對甘藍 種子的發(fā)芽率 發(fā)芽指數(shù) 活力指數(shù)均有抑制作用 且 D600 nm 值越高 抑制作用越明顯 此外 農(nóng)桿菌浸種對甘 藍幼苗的株高 葉面積 根莖比 鮮質(zhì)量均有顯著抑制作 用 葉綠素含量隨 D600 nm 值增大 呈先增加后降低的趨 勢 D600 nm 為 0 8 時 葉綠素含量最高 為 7 86 mg g D600 nm 為 1 6 時 葉綠素含量最低 為 5 64 mg g 農(nóng)桿菌浸種不影響 SOD 活性 但 POD CAT 活性均 隨著 D600 nm 值的升高而升高 農(nóng)桿菌浸種能獲得一定的 PPT 抗性苗 其中 D600 nm 為 0 8 時獲得的抗性苗最多 達到 10 32 PCR 結(jié)果顯示農(nóng)桿菌浸種能實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化 其中 D600 nm 為 1 6 時轉(zhuǎn)化率最高 達到 2 33 關(guān)鍵詞 甘藍 農(nóng)桿菌浸種 種子萌發(fā) 幼苗 轉(zhuǎn)化 中圖分類號 S635 04 文獻標志碼 A 文章編號 1002 1302 2015 03 0139 03 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是目前較廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因方 法 但是常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法依賴于組織培養(yǎng) 1 2 導(dǎo)致其 應(yīng)用受到一定的限制 農(nóng)桿菌浸種法是近年誕生的一種轉(zhuǎn) 基因方法 是將萌發(fā)的種子直接浸在農(nóng)桿菌菌液中 利用 農(nóng)桿菌的浸染特性和植物細胞自身的物質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把外源 基因?qū)胧荏w細胞并整合到基因組中穩(wěn)定表達 從而實現(xiàn) 遺傳轉(zhuǎn)化 3 如 Feldmann 等首次利用農(nóng)桿菌浸種法將 npt QX Y15 QX 基因?qū)肓藬M南芥 4 該方法后來相 繼在水稻 小麥 黃瓜 番茄 中華結(jié)縷草等植物遺傳轉(zhuǎn) 化中取得了成功 5 8 甘藍的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步早 目前已 相繼導(dǎo)入抗蟲基因 Bt 蛋白酶抑制劑基因 育性基因 抗 病基因 生長素基因等 9 縱觀甘藍的遺傳轉(zhuǎn)化 最常采 用的方法還是依賴于組織培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 筆者所在實驗室采用該傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法獲得了部分激活標 簽突變體 10 但是轉(zhuǎn)化效率低下 且需要在無菌條件下進 行離體操作 因此 本研究將采用農(nóng)桿菌浸種法 將含激 活標簽 pSKI015 的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘藍 調(diào)查浸種對甘藍種子萌 發(fā)及幼苗生長的影響 并探討其轉(zhuǎn)化效果 以期獲得一種 甘藍激活標簽突變體材料的簡便轉(zhuǎn)基因方法 1 材料與方法 1 1 供試材料 供試甘藍為夏光種子 供試農(nóng)桿菌為 GV3101 含質(zhì)粒 pSKI015 1 2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 用 LB 培養(yǎng)基接種農(nóng)桿菌 28 220 r min 振蕩培養(yǎng) 過夜 分光光度計測定 600 nm 下的 D 值 1 3 農(nóng)桿菌浸種 取成熟飽滿發(fā)芽率 85 以上的種子 用 0 4 KMnO4 浸 種 6 min 無菌水沖洗 3 4 次 25 催芽 待種子 80 露 白時 再用無菌水沖洗干凈 加入農(nóng)桿菌液 農(nóng)桿菌菌液 D600 nm 分別為 0 未加入農(nóng)桿菌的 LB 溶液 對照 0 4 0 8 1 2 1 6 浸種 2 h 倒掉菌液 25 黑暗條件下 培養(yǎng) 2 d 后轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿 濾紙使用 1 mg L 的 PPT 浸濕 適時補加 置于 20 14 h d 光照的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng) 觀察記載發(fā)芽情況 1 4 幼苗移栽 種子發(fā)芽后統(tǒng)計發(fā)芽率 發(fā)芽勢 活力指數(shù) 用自來 水將幼苗沖洗干凈 移栽于穴盤培養(yǎng) 1 6 生理指標測定 取移栽 30 d 的苗 測定各生理指標 11 采用丙酮提取 法測定葉綠素含量 氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧 化酶 SOD 活性 紫外吸收法測定過氧化氫酶 CAT 活 性 愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶 POD 活性 1 7 PPT 抗性苗篩選 浸種后的種子播種在含 1 mg L PPT 的培養(yǎng)皿中發(fā)芽 移栽穴盤后后噴施 10 mg L Basta 溶液 1 8 PCR 檢測 CTAB 提取 PPT 抗性苗葉片基因組 DNA 以 BarF 5 TCGACTCTAGCGAATTC 和 BarR 5 ATAGGCGTCTCGCATATCTC 為引物擴增長度為 700 bp 的 bar 基因 未轉(zhuǎn)化的甘藍為陰性對照 pSKI015 為陽性對照 擴 增方法和程序參照王愛榮等的方法 12 PCR 反應(yīng)總體積 25 L 擴增程序 5 預(yù)變性 5 min 95 變性 30 s 60 退火 30 s 72 延伸 35 s 30 個循環(huán) 72 延伸 5 min 取擴增產(chǎn)物 10 L 于 1 瓊脂糖凝膠上電泳 1 9 數(shù)據(jù)處理 用 SPSS 系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)處理 Microsoft Excel 軟件作 圖 P 0 05 作為顯著性檢測標準 2 結(jié)果與分析 2 1 農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子萌發(fā)的影響 由表 1 可知 隨著農(nóng)桿菌 D600 nm 的升高 甘藍種子 發(fā)芽率基本呈現(xiàn)下降趨勢 其中 D600 nm 為 0 4 時 與對 照差異不顯著 但是 D600 nm 為 0 8 1 2 1 6 時的發(fā)芽率 顯著低于對照 D600 nm 為 1 6 時 發(fā)芽率最低 D600 nm 為 0 8 和 D600 nm 為 1 2 處理之間差異不顯著 發(fā)芽指數(shù) 的變化與發(fā)芽率的變化類似 隨著 D600 nm 的升高而降低 除 D600 nm 為 0 4 與對照差異不顯著外 其他各處理的種 子發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照 種子活力指數(shù)的變化也是隨 著 D600 nm 的升高而降低 除 D600 nm 為 0 4 與對照差異 不顯著外 其他各處理的種子活力指數(shù)均顯著低于對照 不同的 D600 nm 之間也存在差異 其中 D600 nm 為 1 6 處 理下 種子的活力指數(shù)最低 僅為 53 6 由此可知 農(nóng)桿 菌的 D600 nm 過高 對甘藍種子的萌發(fā)有抑制作用 2 2 農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗生長的影響 由表 2 可知 對照組的根莖比最大 且隨著 D600 nm 值的增加 根莖比逐漸減小 所有處理的根莖比均顯著低于對照 D600 nm 為 0 4 0 8 1 2 3 者之間差異不大 D600 nm 為 1 6 處理時的根莖比最低 僅為 0 70 比對照降低了約 18 因此 農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗的根莖比有抑制作用 甘藍 幼苗的葉面積也隨著 D600 nm 值的增加而降低 其中 D600 nm 為 0 4 與對照差異并不顯著 對照組的葉面積最大 D600 nm 為 1 6 的葉面積最小 由此可知 農(nóng)桿菌浸種對甘 藍幼苗葉面積有抑制作用 在 D600 nm 高于 0 8 時開始表現(xiàn) 較明顯的抑制效應(yīng) 株高的變化與根莖比和葉面積的變化 有所不同 僅在 D600 nm 為 1 2 1 6 下表現(xiàn)抑制效應(yīng) 在 D600 nm 達到 1 6 時 株高僅為對照的 72 所有單株鮮質(zhì) 量中 對照組最大 與各處理之間差異顯著 D600 nm 值為 1 6 時單株鮮質(zhì)量最低 僅為對照的 56 D600 nm 為 0 4 0 8 1 2 3 組之間差異不顯著 由此可見 農(nóng)桿菌浸種 對甘藍幼苗生長存在一定的抑制作用 2 3 農(nóng)桿菌浸種對甘藍生理指標的影響 由表 3 可以看出 在農(nóng)桿菌 D600 nm 低于 0 8 時 隨 D600 nm 的增大 葉綠素含量增加 D600 nm 為 0 8 時 葉 綠素含量達到最大值 之后隨著 D600 nm 的進一步增大 葉綠素含量開始下降 且明顯低于對照 在 D600 nm 達到 1 6 時 葉綠素含量最低 由此可知 高濃度農(nóng)桿菌菌液浸 種會降低甘藍的葉綠素含量 表 3 還顯示 各處理之間 SOD 活性差異并不顯著 說 明農(nóng)桿菌浸種并不影響 SOD 活性 POD 活性均隨著 D600 nm 值的增大而升高 對照組的 POD 活性最低 當(dāng) D600 nm 值大于 0 8 時 POD 活性顯著提高 說明農(nóng)桿菌已經(jīng)對甘藍 造成脅迫 POD 活性提高 其清除自由基的能力也提高 從而避免植株受到傷害 CAT 活性的變化也是隨著農(nóng)桿菌菌 液濃度升高而增加 當(dāng) D600 nm 大于 0 4 時 其與對照的差 異已經(jīng)達到顯著水平 由此可見 農(nóng)桿菌菌液浸種對甘藍 是一種脅迫 為了提高其適應(yīng)逆境的能力 POD 活性升高 以清除產(chǎn)生的自由基 2 4 農(nóng)桿菌浸種對 PPT 抗性苗率及轉(zhuǎn)化率的影響 由表 4 可以看出 采用農(nóng)桿菌浸種甘藍能獲得一定的 PPT 抗性苗 其中 D600 nm 為 0 8 時獲得的抗性苗最多 PPT 抗性苗率可以達到 10 32 D600 nm 為 1 6 時獲得的 抗性苗最少 僅為 8 34 提取 PPT 抗性植株葉片的基因組 DNA 進行 PCR 擴增 部分植株擴增到了長約為 700 bp 的片段 圖 1 B C D G H 與從質(zhì)粒 Pski015 擴增出的片段基本相 同 圖 1 J 說明基因已經(jīng)整合到了轉(zhuǎn)化植株中 但也有例 外 如圖 1 E 擴增出的片段明顯比對照大 具體原因有待進 一步研究 經(jīng) PCR 檢測 統(tǒng)計轉(zhuǎn)化率結(jié)果如表 4 由表 4 可以看出 轉(zhuǎn)化率的大小依次為 D600 nm 0 4 D600 nm 0 8 D600 nm 1 2 D600 nm 1 6 該結(jié)果顯示 轉(zhuǎn)化率隨著 D600 nm 值增 大而增加 但是抗性苗率并不隨 D600 nm 值的增大而增加 原因可能是 D600 nm 值過高 本試驗中的 D600 nm 1 6 對 甘藍幼苗生長造成抑制 甚至死亡 從而導(dǎo)致獲得的抗性 苗數(shù)量減少 3 討論 植物在逆境條件下通常會表現(xiàn)出衰老癥狀 如葉綠素 含量降低 蛋白質(zhì) 核酸等大分子水解加速 原生質(zhì)膜以 及內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化 膜脂過氧化產(chǎn)物 MDA 含量增加 POD 酶促防御系統(tǒng)活性下降等 13 本研究結(jié)果表明甘藍幼 苗葉片中的葉綠素含量隨菌液 D600 nm 值的增加成先升高 后降低的趨勢 在 D600 nm 為 0 8 時 葉綠素含量達到最 大值 之后開始下降 這與徐開杰等的研究結(jié)果 14 有所不 同 他們發(fā)現(xiàn)隨著農(nóng)桿菌菌液濃度升高 小麥幼苗葉片中 葉綠素含量呈下降趨勢 徐開杰等的結(jié)果顯示小麥 POD 活 性隨農(nóng)桿菌菌液濃度升高呈先升后降的趨勢 14 而本研究 證實甘藍的 POD 隨著 D600 nm 的增加一直成上升趨勢 本 研究結(jié)果還表明隨著農(nóng)桿菌菌液濃度升高 甘藍種子發(fā)芽 率 發(fā)芽勢 幼苗株高 鮮質(zhì)量含量呈下降趨勢 這與徐 開杰等的結(jié)果 14 一致 因此 農(nóng)桿菌浸種對甘藍是一種脅 迫作用 特別是高濃度的農(nóng)桿菌會影響萌發(fā)和幼苗的生長 代謝 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效果的重要指標 本研究結(jié)果表明 在低 D600 nm 值時 D600 nm 0 8 轉(zhuǎn)化率為零 這與陳 明利等的結(jié)果 15 類似 他們認為農(nóng)桿菌濃度 D600 nm 值小 于 0 5 時 即使采用長時間侵染 轉(zhuǎn)化效率也不高 但是農(nóng) 桿菌菌液濃度也不宜過高 如本研究中在 D600 nm 為 1 6 時 獲得的轉(zhuǎn)化率雖然較高 但是在此處理下甘藍幼苗生長嚴 重受抑 甚至死亡 陳明利等發(fā)現(xiàn) 當(dāng)農(nóng)桿菌菌液 D600 nm 超過 1 5 時 對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育產(chǎn)生了較為嚴 重的傷害作用 小麥種子發(fā)芽率顯著降低 幼苗出現(xiàn)生長 減慢 停止甚至出現(xiàn)白化 最終死亡的現(xiàn)象 15 他們認為 從獲得轉(zhuǎn)基因植株的規(guī)模方面考慮 農(nóng)桿菌菌液 D600 nm 不超過 1 5 這與本研究結(jié)果是一致的 目前 依賴于組織培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化仍然 是甘藍轉(zhuǎn)基因研究的主要手段 但是這種方法操作繁瑣 需要高頻率的再生系統(tǒng) 特別是組織培養(yǎng)要求無菌 而農(nóng) 桿菌本身又是一種細菌 這增加了無菌操作的難度 因此 探索一種簡單 快捷 高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法勢在必行 種 子浸泡法是最近誕生的一種用于植物轉(zhuǎn)化的方法 已經(jīng)取 得了一定的成功 本研究證實采用農(nóng)桿菌浸種甘藍也可以 實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移 雖然轉(zhuǎn)化率僅為 2 33 但今后深入研究 將有助于獲得轉(zhuǎn)化率更高的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體系 參考文獻 1 劉 凡 王國英 曹鳴慶 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位轉(zhuǎn) 基因方法研究進展 J 分子植物育種 2003 1 1 108 115 2 鄭 杰 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系 的研究 J 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2008 2 6 7 10 3 張慶祝 韓天富 植物非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法研究的進 展 J 分子植物育種 2004 2 1 85 91 4 Feldmann K A Marks M D Agrobaterium mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana a non tissue culture approach J Molecular General Genetics 1987 208 1 9 5 許 耀 王 艇 李寶健 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因 轉(zhuǎn)化植物萌動種胚的研究 J 實驗生物學(xué)報 1991 24 2 109 117 6 奚亞軍 張啟發(fā) 林擁軍 等 利用農(nóng)桿菌浸種法將 葉片衰老抑制基因 PSAG12 IPT 導(dǎo)入普通小麥的研究 J 中國 農(nóng)業(yè)科學(xué) 2004 37 8 1235 1238 7 雷江麗 王 丹 吳燕民 等 農(nóng)桿菌浸種法介導(dǎo)中 華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 J 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報 2009 17 5 865 871 8 林擁軍 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究 D 武漢 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2001 9 秦耀國 雷建軍 曹必好 等 甘藍類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化 研究進展 J 中國蔬菜 2004 4 61 63 10 王鳳華 陳雙臣 李光遠 等 激活標簽轉(zhuǎn)化結(jié)球 甘藍的研究 J 西北植物學(xué)報 2009 29 5 905 909 11 張立軍 樊金娟 植