免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù).pptVIP

免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù) 一 抗原抗體的檢測技術(shù)二 免疫細胞的檢測三 細胞因子的檢測四 免疫相關(guān)基因分析五 免疫標(biāo)記技術(shù)六 免疫PCR IM PCR 技術(shù)七 雜交瘤技術(shù)與T細胞克隆技術(shù)八 新型抗體的制備技術(shù)九 抗原的制備技術(shù) 一 概述免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計的一系列測定抗原 抗體 免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用 免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛 疾病的診斷 療效評價及理論研究等 二 抗原抗體的檢測技術(shù) 根據(jù)反應(yīng)的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應(yīng) 沉淀反應(yīng)和補體參與的各種反應(yīng) 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計的試驗還有標(biāo)記抗原 或抗體 檢測相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù) 對機體參與免疫應(yīng)答的細胞進行鑒定 計數(shù)及功能測定 一 細胞計數(shù)1 熒光抗體染色2 免疫酶染色技術(shù) ABC法 APAAP法3 免疫金銀染色法 IGSS 4 免疫細胞化學(xué)法5 四聚體法6 TCR 鏈測定 三 免疫細胞的檢測 二 免疫細胞功能的測定1 T細胞功能測定 腫瘤 病毒感染 免疫缺陷 自身免疫病等 1 細胞增殖 轉(zhuǎn)化 試驗 可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類 絲裂原主要有PHA ConA和PWM 抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素 PPD和白色念珠菌等 同種MHC及抗CD3單抗等 腫瘤細胞 自體淋巴細胞混合培養(yǎng) 2 T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗 CTL 3 分泌功能檢測 4 T細胞功能的體內(nèi)檢測法 接觸性超敏反應(yīng) 移植物抗宿主反應(yīng) GVHR 遲發(fā)型超敏反應(yīng) DTH 2 B細胞功能判定 1 B細胞增殖 轉(zhuǎn)化 試驗 PWM SAC LPS 對小鼠B細胞 抗IgM抗體及EB病毒等 2 溶血空斑形成試驗 3 反向溶血空斑試驗 4 酶聯(lián)免疫斑點法 ELISPOT ELISPOT是一種可檢測抗體分泌細胞 又可測定抗體分泌量的體外實驗方法 此法的主要優(yōu)點是 穩(wěn)定 特異 且抗原用量少 可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌 并可定量測定 可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞 3 NK細胞活性測定體外檢測NK細胞活性的方法有形態(tài)學(xué)檢查法 放射性核素釋放法 酶釋放法 化學(xué)發(fā)光法及流式細胞術(shù)等 測定人NK細胞活性常以K562細胞株作為靶細胞 測定小鼠NK細胞活性常用YAC 1細胞為靶細胞 1 形態(tài)學(xué)檢查法 2 放射性核素釋放法 用放射性核素 51Cr 125I UdR 標(biāo)記靶細胞 3 酶釋放法 測定靶細胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質(zhì)中的乳酸脫氫酶 LDH 活性 NAG酶熒光比色法 NAG酶是細胞漿中存在的一種溶酶體酶 與其底物作用后 生成熒光產(chǎn)物 應(yīng)用熒光分光光度計測定 敏感性明顯高于LDH比色法 而且方法簡單 結(jié)果穩(wěn)定 重復(fù)性好 4 化學(xué)發(fā)光法 5 流式細胞術(shù) 應(yīng)用FCM檢測NK細胞活性是根據(jù)PI染料排斥法 PI滲入死亡細胞內(nèi)與DNA和RNA結(jié)合 在488nm波長激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光 此法既可以測定單個細胞毒活性 也可以用于總細胞毒活性試驗 還可利用熒光染料法 細胞光掃描法 雙標(biāo)記細胞毒法測定細胞毒性細胞的殺傷效應(yīng) 4 吞噬細胞功能測定 1 中性粒細胞趨化功能測定 一般采用濾膜滲透法 Boyden小室法 或瓊脂糖平板法 2 中性粒細胞吞噬 殺菌功能測定1 顯微鏡檢法2 NBT試驗 此項試驗是測定中性粒細胞吞噬 殺菌功能的一種簡易方法 3 化學(xué)發(fā)光測定法 中性粒細胞在吞噬過程中出現(xiàn)呼吸爆發(fā) 產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物 此類活性氧化基團與細胞內(nèi)殺菌作用密切相關(guān) 同時又能激發(fā)細胞內(nèi)某些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 4 巨噬細胞細胞毒測定 通常取小鼠腹腔巨噬細胞 以 干擾素為激活劑使其活化 作為效應(yīng)細胞 用125I UdR標(biāo)記的DBA 2小鼠肥大細胞瘤P815作為靶細胞 3 巨噬細胞吞噬功能測定 中藥斑蝥酒精浸液敷貼法誘發(fā)無菌性皮炎 從皮膚水泡滲出液中收集巨噬細胞 在體外進行雞紅細胞吞噬試驗 計算吞噬率和吞噬指數(shù) 作為判斷巨噬細胞吞噬功能的指標(biāo) 四 細胞因子的檢測 一 免疫學(xué)檢測法免疫學(xué)檢測的基本原理是將細胞因子作為抗原進行定量檢測 如免疫斑點法 ELISA法 RIA法和免疫印跡法等均已用于細胞因子的檢測 某些細胞因子含量甚微的樣品 如腦脊液 可用免疫聚合酶鏈反應(yīng) immuno PCR 進行檢測 二 生物學(xué)測定法根據(jù)細胞因子對特定的生物學(xué)活性 應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng) 同時與標(biāo)準(zhǔn)品對比測定 從而得知樣品中細胞因子的活性水平 一般以活性單位 U ml 表示 靶細胞可直接從組織中分離 如骨髓細胞的集落形成試驗和胸腺細胞 脾細胞 的增殖試驗 或用體外培養(yǎng)的依賴細胞因子才能生長的細胞因子依賴株及對細胞因子殺傷敏感的細胞作為靶細胞 1 促進細胞增殖和增殖抑制法 多種IL 表皮生長因子 轉(zhuǎn)化生長因子 神經(jīng)生長因子 血小板衍生生長因子 成纖維細胞生長因子 血管內(nèi)皮細胞生長因子 各種CSF作用于造血系統(tǒng)的不同細胞 可促進其增殖及在半固體瓊脂凝膠系統(tǒng)中克隆培養(yǎng)骨髓細胞的集落形成 故可采用集落形成試驗研究CSF的水平 常用的檢測細胞增殖的方法有3H TdR摻入法 比色法 染色法和直接計數(shù)法等 其中測定細胞代謝酶反應(yīng)細胞增殖數(shù)的比色法包括MTT XTT MTS和NAG等方法 2 細胞毒活性測定法許多細胞因子 TNF 針對轉(zhuǎn)化的細胞及病毒感染的細胞具有溶細胞或抑制細胞生長的活性 3 抗病毒活性測定法常用于檢測抗病毒活性的細胞株有WISH Hep2 c L929 A549和MDBK等 其中WISH和Hep2 c細胞株用以檢測人干擾素 L929細胞株用于檢測小鼠干擾素 Ratec細胞株用于檢測大鼠干擾素 而MDBK細胞株則可用于檢測多種族的IFN 和IFN 常用于攻擊細胞的病毒有濾泡性口炎病毒 VSV 鼠腦心肌炎病毒 EMCV 以及Sindbisvirus等病毒 檢測抗病毒活性的方法 測定細胞因子抑制病毒的致細胞病變效應(yīng) CPE 抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量等 4 趨化活性測定法多種細胞因子具有趨化活性 分別能誘導(dǎo)中性粒細胞 單核 巨噬細胞和淋巴細胞定向遷移趨化因子誘導(dǎo)細胞移動的方式包括趨化性和化學(xué)增活現(xiàn)象 趨化性 chemotaxis 是指誘導(dǎo)細胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向作定向移動 可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗測定細胞因子的趨化活性 化學(xué)增活現(xiàn)象 chemokinesis 是指增強細胞的隨機運動 可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動力學(xué)試驗檢測 三 分子生物學(xué)測定法RNA印跡法 核酸酶保護分析 原位雜交 PCR和RealTimePCR等 亦可通過檢測細胞內(nèi)細胞因子的基因組成或mRNA量 推算出細胞因子的合成量 四 單個細胞產(chǎn)生細胞因子測定法常用的方法有反向溶血空斑試驗 RHPA 和反向ELISA斑點試驗 1 反向溶血空斑試驗 RHPA RHPA是一種體外檢測抗體分泌細胞的試驗 亦可用于檢測細胞因子 2 酶聯(lián)免疫斑點試驗 ELISPOT 所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對細胞因子的不同抗原決定簇 五 細胞內(nèi)細胞因子的檢測采用FCM免疫熒光技術(shù)可從單細胞水平檢測不同細胞亞群中的細胞因子 用兩種標(biāo)記的熒光抗體可在一種細胞內(nèi)同時測定兩種不同的細胞因子 細胞因子受體檢測的基本技術(shù) 細胞因子的廣泛生物學(xué)活性是通過與各自相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮的 因此細胞因子受體的檢測與細胞因子檢測一樣 已成為基礎(chǔ)理論和臨床免疫學(xué)研究的一個重要內(nèi)容 五 粘附分子的檢測 某些粘附分子除表達于細胞膜表面外 還以可溶性形式存在于體液中 粘附分子的檢測方法目前大多采用免疫學(xué)技術(shù)檢查其在細胞膜上的分布和測定某些樣品中的含量 六 免疫相關(guān)基因分析 包括各種類型的雜交技術(shù) 如轉(zhuǎn)印雜交 斑點雜交 原位雜交等以及PCR技術(shù)等 雜交技術(shù)主要工具是核酸探針 它是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物 生物素 熒光素 地高辛等 標(biāo)記 并與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA RNA 分為cDNA探針 寡核苷酸探針 基因組DNA探針及RNA探針等 核酸探針技術(shù)的操作主要包括 質(zhì)粒DNA的提取 靶DNA片段的分離 靶DNA片段的標(biāo)記 待測樣品mRNA的提取 標(biāo)記cDNA探針與待測樣品進行雜交 放射自顯影或顯色分析 一 細胞因子基因組DNA或mRNA的檢測1 Northern雜交分析2 斑點雜交法3 原位雜交法4 PCR擴增產(chǎn)物雜交分析是將細胞因子的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 用特異性細胞因子引物進行PCR擴增 通過Southernblot后 再用標(biāo)記探針檢測特異細胞因子DNA的水平 5 Southern印跡雜交6 斑點及狹縫印跡雜交 將DNA變性后直接點樣于硝酸纖維膜上再進行雜交7 細胞因子mRNA表達的測定還可采用RT PCR 原位雜交與原位PCR RNA半壽期的檢測 進行中的轉(zhuǎn)錄分析等 二 BCR及TCR克隆性基因重排分析1 Southern印跡雜交法 僅適用于科研 而不適用于臨床診斷 2 PCR擴增技術(shù) 正常多克隆淋巴細胞群DNA的擴增產(chǎn)物含有不同長度的片段 電泳檢查呈現(xiàn)彌漫涂片狀結(jié)構(gòu)或多條帶 而單克隆性基因重排經(jīng)PCR擴增后 產(chǎn)生明顯相同長度的片段 電泳呈現(xiàn)單一緊密折帶狀結(jié)構(gòu) 應(yīng)用PCR擴增技術(shù)進行基因診斷具有特異 敏感 1 104 1 105克隆性細胞 快速 24h可完成 等優(yōu)點 用于惡性淋巴瘤和白血病等的臨床診斷以及白血病治療后微小殘留病灶的檢測 三 HLA基因分型技術(shù)1 序列特異性寡核苷酸探針PCR PCR SSOP 或PCR ASO PCR SSOP是目前應(yīng)用最多的一種簡單 快速而又精確的HLA 類抗原分型方法 能鑒定所有已知序列的HLA DR DQ DP等位基因 精確地分析DNA的多態(tài)性 2 限制性片段長度多態(tài)性 PCR RFLP 技術(shù) 此項技術(shù)特別適用于個別標(biāo)本和小樣本的檢測 3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR PCR SSCP 藉此可鑒別編碼HLA 類抗原基因的多態(tài)性 應(yīng)用PCR SSCP可以直接比較供 受體之間HLA 類基因是否完全一致 且可精確到1 2個堿基之差 具有相對簡捷而精確的特點 在異基因骨髓移植的配型中已初步應(yīng)用于臨床 4 序列特異性引物PCR技術(shù) PCR SSP 該法操作簡單 快速 實驗結(jié)果容易判斷 雜合子也很易檢出 不足之處在于 為檢出所有的等位基因必須用多個引物進行擴增 5 指紋圖譜 PCR fingerprinting 技術(shù) 進行HLA 基因分型鑒定時 將供 受體的DNA擴增產(chǎn)物混合 電泳后得出一指紋圖 再與二者各自的PCR指紋圖譜進行比較 從中選擇出指紋圖一致的供 受體進行移植 PCR指紋圖譜在選擇非親緣關(guān)系的供 受體進行骨髓和器官移植配型時 可以節(jié)省大量時間 6 SNP 單個核苷酸多態(tài)性 分析 四 補體基因分析 五 抗體基因分析 六 細胞膜分子基因分析 七 免疫標(biāo)記技術(shù) 一 免疫熒光技術(shù) 二 放射免疫分析法 三 酶免疫技術(shù) 四 發(fā)光免疫測定 八 免疫PCR IM PCR 技術(shù) 免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與PCR技術(shù)結(jié)合起來 用以檢測微量蛋白質(zhì)的方法 免疫PCR是用DNA分子標(biāo)記特異性抗體 利用PCR可大量擴增DNA片段的特點 從而將檢測靈敏度大大提高 最低檢測值可達10 21mol L 1 直接免疫PCR是將抗原包被在固相載體上 用特異性單抗結(jié)合此抗原 再用生物素化抗體通過親合素連接生物素化DNA 然后將后者進行PCR2 間接免疫PCR系將所測物的單抗包被在固相載體上 然后使所測抗原與之結(jié)合 再將特異性抗體生物素化 并通過親合素連結(jié)生物素化DNA分子而將后者進行PCR 九 新型抗體的制備技術(shù) 一 對鼠源性抗體的改造1 人 鼠嵌合抗體 chimericantibody 鼠源性單抗的V區(qū) 人免疫球蛋白的C區(qū) 2 人源化抗體將鼠抗體的互補決定區(qū) CDR 與人IgFR和C連接構(gòu)建 人源化抗體 1 模板替換 使用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR區(qū) 例如可通過CDR移植構(gòu)建 改型抗體 2 表面重塑 對鼠CDR及FR表面殘基進行重塑或鑲飾 使之類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的型式 3 補償變換 在人FR選擇與CDR有互補作用 與抗體的親和力有密切關(guān)系或?qū)R空間結(jié)構(gòu)折疊起關(guān)鍵作用的殘基進行改變 以補償完全的CDR移植 4 定位保留 通過計算機模建從現(xiàn)有的人源抗體保守序列中搜尋與鼠FR區(qū)最類似的序列 根據(jù)最簡位置模板確定鼠可變區(qū)的關(guān)鍵位置殘基 并保留所有這些位置而將其余部分進行人源化 3 小分子抗體 1 ScFv 由VH和VL中間連以14 15個小肽 常用的連接肽為 Gly4Ser 3 2 VH與VL適當(dāng)部位各引入一個半胱氨酸形成以二硫鍵固定的Fv段而構(gòu)成的DsFv 3 將ScFv中兩個可變區(qū)之間的接頭縮短 使兩分子間VH和VL配對形成雙價小分子抗體 Diabody 4 將兩種不同特異性的V基因交叉配對 則可得到雙特異性Diabody 5 在ScFv的一端加上一個雙聚化結(jié)構(gòu)亦可構(gòu)建不同類型的雙價或雙特異性小分子抗體 如Minibody等 二 抗體庫技術(shù) 三 產(chǎn)生嵌合抗體的小鼠和產(chǎn)生人抗體的小鼠利用基因打靶和取代的方法以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生嵌合抗體 通過轉(zhuǎn)基因 基因缺失及雜交和選擇等一系列過程 獲得雙轉(zhuǎn)染基因 人H 鏈基因 的純合小鼠 其脾 淋巴結(jié) 骨髓中的B細胞可表達人的 鏈 四 細胞內(nèi)抗體 細胞內(nèi)抗體是指在細胞內(nèi)合成并作用于細胞內(nèi)組分的抗體 亦稱為內(nèi)抗體 intrabody 若在抗體基因的N端或C端加入引導(dǎo)序列就能使抗體表達定位亞細胞部位 如胞漿 線粒體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細胞核部位 若在細胞內(nèi)表達特異識別與腫瘤發(fā)生有關(guān)的癌基因編碼的抗體 即可抑制癌基因編碼產(chǎn)物的表達 可用于腫瘤的治療 細胞內(nèi)免疫用于病毒性疾病的治療 抗EGFR胞外區(qū)的ScFv RIR 并在ScFv RIR的C 末端連接KDEL肽 提供ER滯留 五 基因工程抗體衍生技術(shù)1 雙特異性抗體 BsAb 或稱雙功能抗體 BfA 2 抗體的抗原化技術(shù) 借助人源化抗體的構(gòu)建方法 以抗體V區(qū)作為分子載體來表達生物學(xué)相關(guān)的多肽或外源性抗原表位 即抗原化抗體 antigenizedantibody AbAg 3 抗體重組免疫毒素4 催化抗體 catalyticantibody 或抗體酶 abzyme 將催化活性引入抗體的結(jié)合部位 產(chǎn)生一種具有抗體和酶雙功能的蛋白質(zhì) 稱為抗體酶或程序性酶 programmableenzyme 十 雜交瘤技術(shù)與T細胞克隆技術(shù) 一 雜交瘤技術(shù)1 B細胞雜交瘤技術(shù)與單抗的制備2 T細胞雜交瘤技術(shù)與其功能的研究二 T細胞克隆技術(shù) 按其特異性分為抗原特異性和非特異性T細胞克隆 按其功能則可分為輔助性和細胞毒性T細胞克隆 一 抗原特異性T細胞克隆 二 抗原非特異性T細胞克隆的制備 三 同種反應(yīng)性TH和CTL克隆的制備 四 腫瘤抗原特異性CTL克隆 細胞凋亡的檢測 一 概述細胞凋亡 apoptosis Apo 是生物體內(nèi)無用的 老化的一些損傷細胞自動死亡的一種形式 是指在一定的生理和病理情況下 機體為維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定 通過基因調(diào)控而使細胞自動消亡的過程 二 細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別 細胞壞死是細胞膜 線粒體膜結(jié)構(gòu) 流動性 滲透性及受體等均受損 進而細胞溶解 壞死 而細胞凋亡時上述結(jié)構(gòu)和功能均保持不變 細胞壞死時 ATP和蛋白質(zhì)合成抑制及終止 細胞凋亡時 ATP mRNA和蛋白質(zhì)合成依舊 細胞第二信號系統(tǒng)仍活動 細胞壞死時 細胞DNA隨機降解 電泳不呈梯狀圖譜 細胞凋亡時 DNA多降解成180 200bp或其倍數(shù)的梯狀片段 電泳呈梯狀圖譜 細胞壞死時 細胞內(nèi)容物外溢 引起局部炎癥反應(yīng)或組織損傷 細胞凋亡時 細胞內(nèi)容物不外溢 所以不引起炎癥反應(yīng)或局部損傷 細胞壞死時 往往是成團細胞死亡 細胞凋亡時 在組織中呈分散狀態(tài)分布 三 研究細胞凋亡的意義1 細胞凋亡在腫瘤形成和治療中具有重要作用 凋亡基因與抗凋亡基因突變 易形成腫瘤 免疫效應(yīng)細胞表達FasL 腫瘤細胞表達Fas 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡 抗腫瘤 腫瘤細胞高表達FasL 誘導(dǎo)免疫細胞凋亡 抑制免疫功能 逃避免疫監(jiān)視 腫瘤細胞低表達或不表達Fas 逃避免疫監(jiān)視 2 細胞凋亡與免疫學(xué)的關(guān)系 細胞凋亡與T細胞在胸腺的發(fā)育 細胞凋亡與成熟T細胞 AICD 細胞凋亡與與B細胞 細胞凋亡與胞毒效應(yīng)3 細胞凋亡參與自身免疫病的發(fā)生4 細胞凋亡與病毒感染 抗病毒免疫防御 細胞凋亡與AIDS 細胞凋亡與病毒性肝炎 細胞凋亡的檢測方法 一 形態(tài)學(xué)方法1 普通光學(xué)顯微鏡檢測法2 熒光顯微鏡檢測法材料 石蠟切片 冰凍切片 細胞學(xué)涂片 方法一 PI染液 碘化丙啶 propidiumiodide PI DAPI染液 AO染液 熒光顯微鏡下觀察 PI染色選用 600nm的激發(fā)光 DAPI選用460 500nm的激發(fā)光 AO染色選用520nm的激發(fā)光 HE染色核DNA呈藍色 而PI染色呈紅色 DAPI染色呈藍白色 AO染色呈黃綠色 凋亡細胞呈現(xiàn)核濃縮 染色加深 或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊 晚期凋亡細胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體被細胞膜包繞 即凋亡小體 方法二 Hoechst33342 PI雙標(biāo)記