12《基因工程的基本操作程序》課件.ppt

1 2基因工程的基本操作程序 1 目的基因的獲取 2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 3 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 4 目的基因的檢測(cè)與鑒定 基因工程基本操作的四個(gè)步驟 有了目的基因 我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并可進(jìn)行遺傳 表達(dá)和發(fā)揮作用 載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) 才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化 才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá) 一 目的基因的獲取 一 目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子 二 獲取目的基因的常用方法有哪些 1 從基因文庫(kù)中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 3 人工合成 請(qǐng)閱讀P9第一和二兩段 一 目的基因的獲取 一 從基因文庫(kù)中直接獲取 1 基因文庫(kù) 概念見(jiàn)P9 2 基因文庫(kù)的分類 按外源DNA片段的來(lái)源分類 種類 基因組DNA文庫(kù) 含有一種生物的全部基因 部分基因文庫(kù) 只包含了一種生物的部分基因 如 cDNA文庫(kù) 3 基因文庫(kù)的目的 為了在不知目的基因序列的情況下 便于獲得所需的目的基因 4 獲取目的基因的根據(jù) 見(jiàn)課本P9 提取某種生物的全部DNA 用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段 將DNA片段與載體連接 導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存 基因組文庫(kù) 5 基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一 1 直接分離法 鳥(niǎo)槍法 某種生物的單鏈mRNA 單鏈互補(bǔ)DNA 雙鏈cDNA片段 導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存 與載體連接 cDNA文庫(kù) 反 逆 轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄法 cDNA的合成流程圖解 5 基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之 基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù) cDNA文庫(kù) 比較 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 四種脫氧核苷酸 dNTP 一對(duì)引物 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 Taq酶 模板DNA 需含有目的基因 Mg2 激活劑 條件 緩沖溶液 一對(duì)寡核苷酸序列 與目的基因的起始段互補(bǔ) 一段已知目的基因的核苷酸序列 以便根據(jù)這一序列合成引物 前提 過(guò)程 高溫變性 解旋為單鏈 低溫退火 引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合 適溫延伸 在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈 重復(fù)循環(huán) 預(yù)變性 增加DNA變性的概率 2 具體過(guò)程 PCR 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 概念 PCR全稱為 是一項(xiàng)在生物 復(fù)制 的核酸合成技術(shù) 條件 等 原理 方式 以 方式擴(kuò)增 即 n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù) 結(jié)果 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定DNA片段 DNA復(fù)制 四種脫氧核苷酸 一對(duì)引物 DNA聚合酶 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 前提條件 過(guò)程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 65 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補(bǔ)的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較 堿基互補(bǔ)配對(duì) 四種脫氧核苷酸 模板 能量 酶 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化 體外復(fù)制 細(xì)胞核內(nèi) 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整個(gè)DNA分子 目的基因的mRNA 單鏈DNA cDNA 雙鏈DNA 即目的基因 反轉(zhuǎn)錄 合成 1 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 目的基因 推測(cè) 推測(cè) 化學(xué)合成 2 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 3 人工合成的目的基因 二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心 1 目的 所需物質(zhì) 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用 它們各自的作用是什么 2 基因表達(dá)載體的組成 復(fù)制原點(diǎn) 目的基因 啟動(dòng)子 終止子 標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 啟動(dòng)子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái) 載體與表達(dá)載體的區(qū)別 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段 表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動(dòng)子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子 終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞 必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去 注意 三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 一 轉(zhuǎn)化 二 方法 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞 目的基因進(jìn)入 內(nèi) 并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持 和 的過(guò)程 受體細(xì)胞 穩(wěn)定 表達(dá) 1 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn) 易感染雙子葉植物和裸子植物 對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上 過(guò)程 優(yōu)點(diǎn) 2 基因槍法 3 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法 顯微注射法 程序 目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵 顯微注射受精卵新性狀動(dòng)物 3 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點(diǎn) 繁殖快 單細(xì)胞 遺傳物質(zhì)少 方法 用Ca2 處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 四 目的基因的檢測(cè)與鑒定 檢查是否成功 一 檢測(cè) 1 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 關(guān)鍵步驟 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記 以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交 若顯示出雜交帶 表明染色體已插入染色體DNA中 1 方法 DNA分子雜交 2 過(guò)程 歸納步驟 DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段 將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起 如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列 那么 互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起 形成雜合雙鏈區(qū) 在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位 仍然是兩條游離的單鏈 P15思考與探究 二 鑒定 個(gè)體生物學(xué)水平 2 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 3 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲(chóng)鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 方法 分子雜交 方法 抗原抗體雜交 過(guò)程 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交 若出現(xiàn)雜交帶 表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA 歸納步驟 四 目的基因的檢測(cè)與鑒定 檢查是否成功 檢測(cè) 鑒定 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲(chóng)鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 方法 方法 方法 DNA分子雜交 分子雜交 注意與上不同之處 抗原抗體雜交 歸納 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因 啟動(dòng)子 終止子 標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè) 是否插入 轉(zhuǎn)錄 翻譯鑒定 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注 我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 1 獲得耐鹽基因后 構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處 DNA連接酶作用于處 填 a 或 b a a 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注 我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 2 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法 3 由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù) 該技術(shù)的核心是和 4 為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè) 又要用方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性 基因槍法 花粉管通道法 植物組織培養(yǎng) 脫分化和再分化 耐鹽基因 一定濃度鹽水澆灌 1 以下說(shuō)法正確的是 A 所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C 運(yùn)載體必須具備的條件之一是 具有多個(gè)限制酶切點(diǎn) 以便與外源基因連接D 基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái) C 練習(xí) 2 不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A 能復(fù)制 B 有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C 具有標(biāo)記基因D 它是環(huán)狀DNA D 練習(xí) 3 有關(guān)基因工程的敘述中 錯(cuò)誤的是 A DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)B 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C 目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶 A 練習(xí) 4 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A 限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B 重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C 質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料 D 練習(xí) 5 基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的 在基因操作的基本步驟中 不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 A 人工合成目的基因B 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D 目的基因的檢測(cè)和表達(dá) C 練習(xí) 知識(shí)點(diǎn)一 1 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 啟動(dòng)子 終止子 啟動(dòng)子 位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列 沒(méi)有啟動(dòng)子 基因就不能轉(zhuǎn)錄 終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng) 并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái) 使轉(zhuǎn)錄終止 RNA聚合酶 能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì) 以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA 能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列 在該序列中 最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子 終止子 編碼區(qū) 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋