醫(yī)學分子生物學資料總結.doc

精品 感謝下載載 醫(yī)學分子生物學資料總結 一 名詞解釋 1 質(zhì)粒 是細菌細胞內(nèi)攜帶的染色體外的 DNA 分子 是共價閉合的環(huán)狀 DNA 分子 能獨立進行復制 質(zhì)粒只有在宿主細胞內(nèi)才能夠完成自己的復制 2 基因 指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或 RNA 序列及表達這些信息所需的全部核苷酸 序列 是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位 3 癌基因 是細胞內(nèi)控制細胞生長和分化的基因 具有潛在的誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的特 性 它的結構異?；虮磉_異常 可以引起細胞癌變 4 基因克隆 是指把一個生物體的遺傳信息 基因片段 轉(zhuǎn)入另一個生物體內(nèi)進行無 性繁殖 得到一群完全相同的基因片段 又稱 DNA 克隆 5 抑癌基因 是指存在于正常細胞內(nèi)的一大類可抑制細胞生長并具有潛在抑癌作用的 基因 當這類基因在發(fā)生突變 缺失或失活時可引起細胞惡性轉(zhuǎn)化而導致腫瘤發(fā)生 6 基因診斷 是以 DNA 和 RNA 為診斷材料 通過檢查基因的存在 缺陷或表達異常 對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程 7 管家基因 是在生命過程都是必需的 是在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表 達的基因 它較少受環(huán)境因素的影響 其表達方式為組成性基因表達 8 klenow 片段 亦稱 DNA 聚合酶 1 大片段 為 DNA 聚合酶 I 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂 解后產(chǎn)生的大片段 它除了保留 5 3 聚合酶活性及 3 5 外切酶活性外 失去了 5 3 外切酶活性 它具有的 3 5 外切酶活性能保證 DNA 復制的準確性 把 DNA 合成過程中 錯誤配對的堿基去除 再把正確的核苷酸接上去 9 核蛋白體 系 rRNA 與蛋白質(zhì)結合生成的一種復合體 是蛋白質(zhì)生物合成的場所 10 限制性內(nèi)切核酸酶 能識別 DNA 的特異序列 并在識別位點或其附近切割雙鏈 DNA 的一類內(nèi)切核酸酶 是基因克隆中最重要的工具酶 通常所說的限制酶是指 2 型酶 主要從原核細胞中提取 大多數(shù)限制性內(nèi)切酶是錯位切割雙鏈 DNA 產(chǎn)生粘性末端 部分 酶則沿對稱軸切割 DNA 而產(chǎn)生平端 11 Tm 值 DNA 變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成的 在這一范圍內(nèi) 紫外吸 收值達到最大值的 50 時的溫度稱為 DNA 的解鏈溫度 又稱融解溫度 Tm 其大小 與 G C 含量成正比 或 雙鏈 DNA 變性一半所需要的溫度叫 DNA 的融解溫度 12 DNA 的甲基化 是指 DNA 的一級結構中 有一些堿基可以通過加上一個甲基而 被修飾 其作用是對自身 DNA 產(chǎn)生保護作用 13 原位雜交 是核酸保持在細胞或組織切片中 經(jīng)適當方法處理細胞或組織后 將標 記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交的方法 14 DNA 微陳列 系直接將大量 DNA 探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表 精品 感謝下載載 面所組成的微陳列 基因芯片 稱為 DNA 微陳列 15 順序作用元件 是指那些與結構基因表達調(diào)控相關 能被基因調(diào)控蛋白異性識別和 結合的 DNA 序列 抱括啟動子 上游啟動子元件 增強子 加尾信號和一些反應元件 16 轉(zhuǎn)位因子 是指能夠在一個 DNA 分子內(nèi)或 2 個 DNA 分子之間移動的 DNA 片段 17 基因治療 是指通過在特定靶細胞中表達該細胞本來不表達的基因 或采用特定方式 關閉和抑制異常表達基因 達到治療疾病目的的治療方法 二 綜合內(nèi)容 1 DNA 的結構 性質(zhì)及特點 一級結構是指 DNA 分子中核苷酸的排列順序 二級結構是指兩條 DNA 單鏈形成 的雙螺旋結構 三股螺旋結構和四股螺旋結構 三級結構是指雙鏈 DNA 進一步扭曲盤旋 形成的超螺旋結構 DNA 一級結構的基本特點 4 種脫氧核糖核苷酸以 3 5 磷酸二 酯鍵相連 形成長鏈 鏈中的脫氧核糖和磷酸都是相同的 組成 DNA 的堿基有腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G 胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T DNA 是由兩條單鏈結合在一起 形成的雙鏈分子 兩條單鏈都是由 A T G C 以千變?nèi)f化的排列組合而形成的 大多數(shù) 生物的遺傳信息都是儲存在 DNA 分子中 DNA 分子主要攜帶兩類遺傳信息 即有功能 活性的 DNA 序列所攜帶的信息和調(diào)控信息 DNA 二級結構是指 DNA 的雙螺旋結構 其特點為 脫氧核糖與磷酸交替排列構成了 DNA 主鏈 兩條脫氧核苷酸鏈是反向平行排 列 一條是 5 3 方向 另一條為 3 5 方向 以右手方向盤繞成雙螺旋構型 A 配 T G 配 C 生物體的閉環(huán) DNA 都以超螺旋形式存在 如細菌質(zhì)粒 一些病毒 線粒體 的 DNA 等 2 RNA 的結構 功能 特點 由 4 種基本的核苷酸以 3 5 磷酸二酯鍵連接而成的長鏈 堿基中沒有 T 而為尿 嘧啶 U 分為 mRNA 信使 RNA tRNA 轉(zhuǎn) RNA 轉(zhuǎn)運氨基酸 和核蛋白體 RNA rRNA mRNA 結構特點 不穩(wěn)定 代謝活躍 更新迅速 壽命短 原核生物 mRNA 具有操縱子結構 主要是多順反子 mRNA5 端無帽子結構 3 端一般無多聚 A 尾 巴 沒有修飾堿基 真核 mRNA5 端有帽子結構 3 端大多有多聚腺苷酸尾巴 分子中可 能有修飾堿基 主要有甲基化 有編碼區(qū)和非編碼區(qū) tRNA 的結構特點及作用 作用 在蛋白質(zhì)合成過程轉(zhuǎn)運氨基酸 參與蛋白質(zhì)的翻譯 一級結構含有稀有堿基如 DHU 3 端 為 3 個同樣的核苷酸序列 CCA 序列 此序列是 tRNA 結合和轉(zhuǎn)運安基酸而生成氨酰 tRNA 所必需的 5 端為 G 具有 T C 二級結構為三葉草形 三級結構為倒 L 形 C rRNA 即核蛋白體 RNA 為細胞內(nèi)含量最豐富的 RNA 約占細胞總 RNA 的 80 以上 參與組成核蛋白體 作為蛋白質(zhì)生物合成的場所 原核生物核糖體的沉降系數(shù)為 70S 由 50S 和 30S 兩個大小亞基組成 30S 小亞基含 16SrRNA 和 21 種蛋白質(zhì) 50S 大亞基含 23S 和 5SrRNA 以及 34 種蛋白質(zhì) 真核生物細胞核糖體的沉降系數(shù)為 80S 由大小亞基 組成 40S 小亞基含 18SrRNA 及 30 多種蛋白質(zhì) 60S 大亞基含 3 種 rRNA 28S 5 8S 5S 以及大約 45 種蛋白質(zhì) hnRNA 即核內(nèi)不均 RNA 為真核生物轉(zhuǎn)錄生成的 mRNA 前體 SnRNA 即小分子核內(nèi) RNA 不單獨存在 常與多種特異的蛋白質(zhì)結合在一起 形成小 精品 感謝下載載 分子核內(nèi)核蛋白顆粒 在 mRNA 的剪接中起重要作用 反義 RNA 又稱調(diào)節(jié) RNA 主 要封閉 RNA 3 參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸在特異的氨基酰 tRNA 合成酶催化下 與其相應的 tRNA 結合成氨基酰 tRNA 真核生物起始 tRNA 結合的氨基酸為蛋氨酸 結合形成 Met tRNAimet 翻譯起始時首先與 40S 核糖體小亞基結合形成復合物 原核生物的起始氨基酸 為甲酰化蛋氨酸 結合形成 fMet tRNAffmet 導致 DNA 變性的常用方法有熱變性 堿變 性和化學試劑變性 DNA 變性的結果 粘性降低 密度增加 A260 紫外吸收值增加 4 蛋白質(zhì)的結構 功能特點 蛋白質(zhì)又稱為 功能分子 根據(jù)功能分為結構蛋白 活性蛋白和信息蛋白 蛋白 質(zhì)的一級結構是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸排列的順序 蛋白質(zhì)一級結構發(fā)生改變 可以使 蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變 嚴重時可導致疾病的發(fā)生 因基因突變而導致的蛋白質(zhì)一級結 構改變后表現(xiàn)出生理功能的異常 使機體出現(xiàn)病態(tài)現(xiàn)象 稱為分子病 蛋白質(zhì)的二級結 構單元 形式 有 a 螺旋 折疊 轉(zhuǎn)角 螺旋和無規(guī)則卷曲 一級結構的化學 鍵是肽鍵及硫鍵 二級結構主要化學鍵為氫鍵 三級結構的主要靠疏水作用 離子鍵 氫 鍵和范得華力等 四級結構的結合力主要是疏水作用 氫鍵和離子鍵 5 端粒的主要特點和功能 特點為 位于真核生物染色體末端 端粒酶催化端粒 DNA 延長 在決定細胞壽命中起重要作用 含短的高度重復序列 其主要功能有 保護線 性 DNA 的完整復制 保護染色體末端 決定細胞的壽命 6 DNA 聚合酶 DNApol 作用是催化 DNA 合成 其活性需要 Mg2 的存在 大腸桿菌 DNA 聚合酶有 I II II3 種 即原核生物 DNA 聚合酶 DNApolI 的功能有 a 聚合作用 使 DNA 鏈 沿 5 3 方向延伸 b 3 5 外切酶活性 即能從 DNA 鏈 3 端開始沿 3 5 進行水解反 應 產(chǎn)生 5 單核苷酸 糾正復制過程中的錯誤 保證 DNA 復制的正確性 因而具有校對 功能 C 5 3 外切酶活性 參與 RNA 生物的切除 填補岡崎片段間的空隙以及 DNA 損傷的修復 DNApolII 具有 5 3 DNA 聚合酶活性及 3 5 外切核酸酶活性 可能 參與 DNA 損傷的應急狀態(tài)修復 DNApolII 亞基具有催化合成 DNA 的功能 亞 基具有 3 5 外切酶活性及編輯和校對功能 則為裝配所必需 是原核生物復制延長中 真正起催化作用的酶 DNA 聚合酶的共同性質(zhì)是 需要 DNA 模板 RNA 或 DNA 作為引 物 ATP 與 Mg2 的參與 以 dNTP 作底物 DNA 合成的方向是 5 3 反應特點 新生 鏈的延伸方向為 5 3 半保留方式合成子代 DNA 雙鏈 反應需要 DNA 引物 共同具有 的酶活性 5 3 聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性 7 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶也稱依賴 DNA 的 RNA 聚合酶 能以 DNA 為模板 四種核苷三磷酸 為底物 按照堿基配對原則 從 5 3 方向延長 RNA 鏈 原核生物的 RNA 聚合酶只有 一種 是由四種亞基 2 組成的五聚體蛋白質(zhì) 稱為全酶 去掉 亞基后 剩下的 2 稱為核心酶 活細胞的轉(zhuǎn)錄起始 需要全酶 而核心酶負責催化 RNA 鏈的延伸 真核生物 RNA 聚合酶有三種 即 RNA 聚合酶 I II III RNA 聚合酶 I 定位在核仁 主要轉(zhuǎn)錄 5 8S 18S 28S rRNA 基因 酶 II 定位在核漿 主要轉(zhuǎn)錄編碼蛋白質(zhì)的基因 精品 感謝下載載 即主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 mRNA 酶 III 定位在核漿 主要轉(zhuǎn)錄 tRNA 和 5S rRNA 基因 RNA 聚合酶催化聚合反應時需要有 Mg2 或 Mn2 的存在 無 3 5 外切酶海性 無校對功 能 8 密碼子分為起始密碼和終止密碼 起始密碼為 AUG 終止密碼為 UAA UAG 和 UGA 共有 64 種不同的密碼 可作為原核生物起始密碼的是 AUG GUG UUG 9 遺傳密碼具有以下特點 A 連續(xù)性 兩個密碼子之間沒有任何核苷酸加以分隔 即密碼是無標點的 B 方向 性 mRNA 中密碼子的排列是有方向性的 即起始密碼子總是位于編碼區(qū) 5 末端 而終 止密碼子位于 3 末端 每個密碼子的三個核苷酸也是 5 3 方向閱讀 不能倒讀 C 簡并性 是指遺傳密碼中除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個密碼子外 其余氨基酸有 2 6 個密碼子為其編碼 以密碼子的第三位堿基和反密碼子的第一位堿基常見 D 通用性 從 最簡單的病毒 原核生物 直至人類 都使用同一套遺傳密碼 E 擺動性 翻譯過程中 氨基酸的正確加入 要靠 mRNA 上的密碼子與 tRNA 上的反密碼子相辯認 密碼子與反 密碼子配對辯認時 有時不完全遵守堿基互補規(guī)律 即使不嚴格互補也能辯認配對 這種 現(xiàn)象稱為擺動 以密碼子的第三位堿基和反密碼子的第一位堿基常見 10 轉(zhuǎn)錄的過程及特點 轉(zhuǎn)錄是以 DNA 為模板 以 4 種 NTP 為原料 依堿基配對規(guī)律 在 DNA 指導的 RNA 聚合酶催化下合成 RNA 的過程 其過程包括 起始 延長和終止三個階段 轉(zhuǎn)錄 的特點 A 對于一個基因組來說 轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因 而且每個基因的轉(zhuǎn)錄都受 到相對獨立的控制 B 轉(zhuǎn)錄是不對稱的 C 轉(zhuǎn)錄時不需要引物 而且 RNA 鏈的合成是 連續(xù)的 D 轉(zhuǎn)錄的單向性 即 RNA 生物合成時 只能向一個方向進行聚合 所依賴的模 板 DNA 鏈的方向為 3 5 而 RNA 鏈的合成方向為 5 3 E 有特定的起始和 終止位點 參與轉(zhuǎn)錄終止的因素為 因子或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 3 端發(fā)夾結構 轉(zhuǎn)錄終止的修飾點 AATAAA GT 序列 11 原核生物 DNA 復制的過程及特點 復制過程包括 起始 復制起始位點識別 解螺旋酶解開 DNA 雙鏈 引發(fā)體合成 RNA 引物 延伸 DNA 聚合酶催化聚合反應 連續(xù)合成前導鏈 不連續(xù)合成隨從鏈 終止 RNA 引物去除 岡崎片段連接 在特殊的終止結構區(qū)域停止 復制的共同特點 為 半保留復制和半不連續(xù)復制 聚合反應都需要模板 底物 DNA 聚合酶及其它酶和蛋 白質(zhì) 12 真核生物染色體 DNA 復制的特點 原核相反 復制起始點為多個 復制叉移動速度慢 復制方向大多數(shù)為雙向 RNA 引物 短 岡崎片段短 不可連續(xù)復制 13 翻譯的主要過程及特點 起始 形成翻譯起始復合物 延長 指每加一個氨基酸經(jīng)過進位 成肽和轉(zhuǎn)位 使 肽鏈從 N 端向 C 端延長 終止 當 mRNA 分子中的終止密碼子出現(xiàn)后 多肽鏈合成停 止 肽鏈從肽酰 tRNA 中釋出 mRNA 核蛋白體等分離 蛋白制合成是一個耗能過程 每生成一個肽鍵 要消耗 2 個高能磷酸鍵 氨基酸活化要消耗 2 個高能磷酸鍵 整個過程 精品 感謝下載載 可能多于 4 個高能磷酸鍵 14 原核生物 mRNA 的加工 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA 分子不需加 工 tRNA 結構基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要加工 才能成為具有生物功能的成熟分子 tRNA 前體的加工包括剪切作用 切除多余核苷酸 添加和修復 3 端 CCA 序列 某些堿基的 化學修飾 成熟 tRNA 分子中有稀有堿基 15 翻譯后的加工修飾 加工包括 A 去掉 N 甲?；?N 蛋氨酸或 N 端序列 B 個別氨基酸的修飾 羥 化 磷酸化形成 S S 等 C 多蛋白水解修飾 D 分子伴侶 蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶 肽 脯氨酰順反異構酶輔助折疊成空間構象 E 亞基聚合 F 輔基的結合 糖基化等 其中 A B C 屬一級結構修飾 D E F 屬空間結構修飾 多肽鏈形成后 氨基酸殘 基可進行多種共價修飾 包括 磷酸化 羥基化 ADP 核糖基化 形成胱氨酸及乙?；?翻譯過程涉及多種分子之間的相互作用 可以歸納為 RNA 蛋白質(zhì)相互作用 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用及 RNA RNA 相互作用 參與翻譯終止的蛋白質(zhì)因子包括 RF PR IF 廣義的核蛋白體循環(huán)包括 翻譯起始 進位 成肽 轉(zhuǎn)位和翻譯終止 16 真核生物 mRNA 的加工包括 5 端加帽 由加帽酶催化 5 端加入 7 甲苷烏苷酸 形成帽子結構 m7GpppmNP 3 端加入 Poly A 尾 A 組蛋白的成熟 mRNA 無需加 polyA 尾 B 加尾信號包括 AAUAAA 和富含 GU 的序列 C 加尾不需模板 D 剪切過程需要多種蛋白質(zhì)因子的輔助 mRNA 前體的剪接 剪接加工以除去內(nèi)含子序列 并將外顯子序列連接成為成熟的有 功能的 mRNA 分子 內(nèi)含子兩端的結構通常是 5 GU AG 3 選擇性剪接的作用機制 包括 A 使用不同的剪接位點 B 選擇使用外顯子 C 反式剪接 D 使用不同的啟動子 E 使用不同的多腺苷酸化位點 RNA 的編輯 發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平 改編 mRNA 序 列 C U 或 A G 增加遺傳信息容量 17 基因表達是指生物基因組中結構基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄 翻譯等一系列 過程 合成特定的蛋白質(zhì) 進而發(fā)揮特定的生物學功能和生物學效應的全過程 但并非所 有基因表達過程都產(chǎn)生蛋白質(zhì) tRNA rRNA 編碼基因轉(zhuǎn)錄生成 RNA 的過程也屬于基因 表達 基因表達受到多級水平的調(diào)控 具有階段特異性 時間特異性 和組織特異性 空 間特異性 基因表達分為幾個階段 基因活化 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄后加工 翻譯 翻譯后加工 等 產(chǎn)物是 RNA 和有功能的蛋白質(zhì) 18 原核生物基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié) 主要在轉(zhuǎn)錄水平 其次是翻譯水平 原核生物基 因多以操縱子的形式存在 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控涉及到啟動子 因子 能與 RNA 聚合酶結合 阻遏蛋白 負調(diào)控 正調(diào)控蛋白 倒位蛋白 RNA 聚合酶抑制物 衰減子等多種因素 而翻譯水平的調(diào)控涉及到 SD 序列 位于 AUG 前 mRNA 的穩(wěn)定性 不穩(wěn)定 其 5 端 和 3 端的發(fā)夾結構可保護其不被酶水解 mRNA 的 5 端與核糖體結合 可明顯提高其穩(wěn)定 性 翻譯產(chǎn)物及小分子 RNA 的調(diào)控作用 19 真核生物基因表達的調(diào)控環(huán)節(jié)較多 在 DNA 水平可通過染色體丟失 基因擴增 基因重排 DNA 甲基化以及染色體結構改變影響基因表達 在轉(zhuǎn)錄水平則主要通過反式作 用因子的作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與 TATA 盒的結合 RNA 聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子 DNA 復合物的結 合及轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成 在轉(zhuǎn)錄后水平主要通過 RNA 修飾 剪接及 mRNA 運輸?shù)目?精品 感謝下載載 制來影響基因表達 影響翻譯水平的因素有影響起始翻譯的阻遏蛋白 5 AUG 5 端非編 碼區(qū)的長度 mRNA 的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)及小分子 RNA 等 真核基因調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)是基 因轉(zhuǎn)錄 真核生物基因表達需要轉(zhuǎn)錄因子 啟動子 沉默子和增強子 20 反式作用因子 指能直接或間接辨認和結合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段 DNA 的蛋白質(zhì) 其主 要特點包括三個功能結構域 DNA 識別結合域 轉(zhuǎn)錄活性域 結合其它蛋白的結合域 能識別并結合上游調(diào)控區(qū)的順式作用元件 對基因表達有正性和負性調(diào)控作用 其活性調(diào) 節(jié)方式 表達式調(diào)節(jié) 共價修飾 配體結合及蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用 作用方式 成環(huán) 扭曲 滑動 Oozing DNA 結構域包括 鋅指 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋 亮氨酸拉鏈和螺旋 環(huán) 螺旋 轉(zhuǎn)錄激活域富含 酸性氨基酸 脯氨酸和谷氨酰胺 21 參與 DNA 復制 合成 的物質(zhì)包括 模板 解開成單鏈的 DNA 母鏈 引物 提供 3 OH 未端使 dNTP 可以依 次聚合 底物 dATP dGTP dCTP 和 dTTP 聚合酶 依賴 DNA 的 DNA 聚 合酶 DNA pol 其它的酶和蛋白質(zhì)因子 DNA 復制的基本過程包括 DNA 雙鏈解開 RNA 引物的合成 DNA 鏈的延長 切除引物 填補缺口 連接相鄰 DNA 片段 切除和修復錯配堿基 22 結構基因突變的類型包括點突變 缺失 插入和倒位四類 遺傳密碼的改變分為 錯義突變 無義突變 同義突變和移碼突變 23 癌基因惡性激活的機制包括 原癌基因點突變 原癌基因獲得外源啟動子而 激活 原癌基因因甲基化程度降低而激活 基因易位或重排使原癌基因激活 24 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基因治療中最常用的載體 造血肝細胞是基因治療中最重要的 靶細胞 禁用生殖細胞 基因轉(zhuǎn)移技術 基因治療技術 包括生物學方法和非生物學方法 生 物學方法有 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 腺病毒載體 腺相關病毒載體 單純皰疹病毒載體 非生物學方法 有 脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)移技術 DNA 直接注射法 磷酸鈣沉淀法 電穿孔法 顯微注射 基因槍技術 DEAE 葡聚糖法 25 DNA 甲基化的一個特點是它們經(jīng)過細胞許多代分裂之后仍保持穩(wěn)定 在真核生 物 DNA 中 幾乎所有甲基化均發(fā)生于二核苷酸序列 5 mCG 3 上 26 一個基因所包括的序列有 編碼蛋白質(zhì)肽鏈或 RNA 的核酸序列 保證轉(zhuǎn)錄所必 需的調(diào)控序列 位于編碼區(qū) 5 端上游的非編碼序列 內(nèi)含子 位于編碼區(qū) 3 端下游的非 編碼序列 27 啟動子是 RNA 聚合酶特異性識別和結合的 DNA 序列 啟動子具有方向性 真核 生物的啟動子必須與轉(zhuǎn)錄因子結合后 才能被 DNA 聚合酶識別和結合 真核生物的啟動 子元件是 TATA 蓋 TATA 盒的核心序列是 TATA A T A A T 位于轉(zhuǎn)錄起始點上游 25bp 處 啟動子決定轉(zhuǎn)錄方向 模板鏈及轉(zhuǎn)錄效率 上游啟動子元件包括 CAAT 盒 CACA 盒和 GC 盒 28 逆轉(zhuǎn)錄 是指以 RNA 為模板 利用宿主細胞中 4 種 dNTP 為原料 在引物的 3 端以 5 3 方向合成與 RNA 互補的 DNA 鏈的過程 此過程與中心法則方向相反 故稱為逆轉(zhuǎn) 錄 29 原癌基因產(chǎn)物的類型及細胞定位 精品 感謝下載載 生長因子及其類似物 由細胞分泌 如 C sis 家族 sis 編碼血小板源生長因子 表達產(chǎn)物與 PDGF 鏈結構同源 跨膜生長因子受體型的酪氨酸蛋白激酶 如 erb B 表 皮細胞生長因子 EGF 受體 fims 巨噬細胞集落刺激因子受體 定位于質(zhì)膜 細胞內(nèi) 信號傳導分子 定位于胞夜 包括 A 低分子量 G 蛋白 如 H ras 等基因表達產(chǎn)物 B 胞 內(nèi)蛋白激酶 包括與膜結合的蛋白酪氨酸激酶和胞漿絲氨酸 蘇氨酸蛋白激酶 如 src abl 等基因表達產(chǎn)物 核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 如 myc fos 等基因表達產(chǎn)物 定位于細胞 核內(nèi) 胞漿調(diào)節(jié)蛋白 如 crk 的產(chǎn)物是存在于胞漿中的調(diào)節(jié)蛋白 定位于胞漿 可溶 性蛋白酪氨酸激酶受體和非蛋白激酶受 30 細胞周期的主要調(diào)控點 細胞周期的運行受多種因素所調(diào)控 有 2 個主要調(diào)控點 亦稱為檢測點 G1 S 期 檢測點 在酵母中稱起點 在哺乳細胞中稱限制點 是控制細胞進入 S 期檢測點 G1 期檢 測點 cyclinB 與 CDK4 和 CDK6 結合 cyclinE 與 CDK2 CDK3 結合 通過磷酸化使它 們活化 cyclin CDK 復合物可使 Rb 蛋白磷酸化 從而釋放轉(zhuǎn)錄因子 E2F 促進 DNA 復 制相關基因的表達 CDK2 也可和 cyclinA cyclinA1 結合 促進早 S 期 DNA 合成的起 始 G2 M 期檢測點 是控制細胞進入 M 期檢測點 G2期檢測點 促有絲分裂因子 MPF 由 cyclinB 和 CDK1 組成 是啟動有絲分裂的關鍵因子 細胞何時進入 M 期取 決于 Cdc2 的磷酸化狀態(tài) 31 真核細胞轉(zhuǎn)染的基本方法 磷酸鈣沉淀法 電穿孔法 脂質(zhì)體介導的基因?qū)敕?DEAE 葡聚糖法 顯微注射法 32 DNA 損傷的主要類型 堿基和糖基破壞 錯配 DNA 鏈斷裂 電離輻射致 DNA 損傷的主要形式 DNA 交聯(lián) 上述 DNA 損傷可導致 DNA 模板發(fā)生堿基的置換 插入 缺失 鏈的斷裂 并可 影響到染色體的高級結構 DNA 鏈中一種嘌呤被另一種嘌呤取代 或嘧啶被另一種嘧啶所 取代 稱為轉(zhuǎn)換 嘌呤被嘧呤取代 或反之 稱為顛換 轉(zhuǎn)換和顛換在 DNA 復制時可引 起堿基錯配 導致基因突變 堿基的插入和缺失可引起移碼突變 基因突變包括 點突變 缺失 插入 倒位 突變的后果包括 錯義突變 一種氨基酸變?yōu)榱硪环N氨基酸 無義 突變 一種密碼變?yōu)榻K止密碼如 UGU 顛換成 UGA 同義突變和移碼突變 33 DNA 修復機制的主要類型 光修復 切除修復 重組修復 SOS 修復 錯配修復 34 基因文庫篩選的主要方法及原理 1 根據(jù)抗藥性標志篩選 對于帶有某種抗藥性標志基因 只有轉(zhuǎn)化成功的受體菌才可 能在含該抗生素的培養(yǎng)基中生存并形成菌落 而沒有轉(zhuǎn)化成功的受體菌 不能在培養(yǎng)基中 生長 以此可選擇陽性菌 2 根據(jù)菌落的呈色反應篩選 互補 藍 白篩選 根椐菌落 的顏色并結合插入片段的序列測定篩選 3 營養(yǎng)缺陷型標記法 4 核酸分子雜交法 即采 用與目的基因部分互補的 DNA 片段作為探針 與含有重組體的細菌菌落進行雜交 以確 定重組體中帶目的基因 包括原位雜交和 southern 印跡雜交 5 遺傳互補法 載體上 精品 感謝下載載 的營養(yǎng)代謝標記可以對宿主細胞的營養(yǎng)代謝缺陷進行互補 以此作為篩選重組體的標記 6 免疫學方法 如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的 并且在菌落或噬菌斑中表達 因而可 以用相應的抗血清或單克隆抗體 通過放射免疫 化學發(fā)光或顯色反應進行篩選 35 PCR 的主要步驟及引物設計的基本要求 PCR 的主要步驟 PCR 又稱聚合酶鏈式反應 是在體外進行的 DNA 復制反應過程 其基本過程包括 A 雙鏈 DNA 模板加熱變性成單鏈 變性 溫度 95 度左右 B 在低溫 下引物與單鏈 DNA 互補配對 退火 85 90 度 C 延伸 在四種 DNTP 底物及 Mg2 存在 條件下 TaqDNA 聚合酶在最適作用溫度 70 75 下 根據(jù)堿基互補配對原則 催化 引物 3 OH 端摻入單核苷酸 合成新的 DNA 分子 引物設計的基本要求 A 引物長 度一般為 15 30 個核苷酸 B 引物中的堿基組成盡可能隨機分布 避免出現(xiàn)嘌呤 嘧啶 堿基堆積現(xiàn)象 尤其在 3 端避免連續(xù) 3 個 G 或 C C 引物自身不應存在互補序列以避免 折疊成發(fā)夾結構 引物自身存在的連續(xù)互補序列 一般不超過 3bp D 兩個引物之間不 應存在互補序列 尤其應避免 3 端的互補重疊 E 引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性 不要超過 70 引物 3 末端連續(xù) 8 個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列 F 引物 與模板結合時 引物的 5 端可以修飾 如附加陷制酶位點 引入突變位點 用生物素 熒光 物質(zhì) 地高辛標記 36 乳糖操縱子的正 負調(diào)節(jié)機制 乳糖操縱子包含 3 個結構基因 Z Y A 編碼 半乳糖苷酶 半乳糖苷通透酶和轉(zhuǎn)乙 ?；?3 個調(diào)控元件 啟動子 操縱基因和 CAP 結合位點 和 1 個調(diào)節(jié)基因 編碼阻 遏蛋白 乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始是由 CAP 和阻遏蛋白兩種調(diào)控因子來調(diào)控的 1 阻 遏蛋白的負調(diào)控 無乳糖時 阻遏蛋白結合操縱基因 妨礙 RNA 聚合酶結合啟動子 從 而抑制結構基因轉(zhuǎn)錄 有乳糖時 生成半乳糖 誘導劑 結合阻遏蛋白 使阻遏蛋白構象 改變 變構的阻遏蛋白不能與操縱序列結合 阻遏機制解除 結構基因可以轉(zhuǎn)錄 基因得 以表達 cAMP CAP 復合物的正調(diào)控 無葡萄糖時 cAMP 濃度高 形成的 cAMP CAP 復合物結合于 CAP 結合位點 增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性 促進下游基因得以表達 有葡萄糖時 cAMP 濃度低 cAMP CAP 復合物形成受阻 影響轉(zhuǎn)錄活性 正 負調(diào)控機制相輔相成 cAMP CAP 復合物是轉(zhuǎn)錄必需的 同時阻遏蛋白進一步控制轉(zhuǎn)錄啟動 綜上 乳糖操縱子 最強的表達條件是有乳糖而無葡萄糖 37 雙脫氧末端終止法 DNA 測序的主要步驟 雙脫氧末端終止法是以單鏈或雙鏈 DNA 為模板 采用 DNA 引物引導新生 DNA 的合成 又稱為引物合成法 或酶促引物合 成法 其主要步驟為 制備單鏈模板 模板與測序引物結合 摻入法標記反應 延伸 終止反應 變性膠電泳 放射自顯影 閱讀測序結果 38 常用的分子生物學技術的原理 過程及特點 核酸分子雜交技術 基本原理是 具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下 堿基互補配對結合 重新形成雙鏈 在這一過程中 核酸分子經(jīng)歷了變性和復性的變化 以及復性過程中各分子間鍵的形成和斷裂等 特點 直接檢測血清中病毒基因組 無須擴 增 靈敏度較 PCR 低 在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針 聚合酶鏈反應 PCR PCR 的原理是根據(jù)待測 DNA 片段兩端的核苷酸序列 設 精品 感謝下載載 計并人工合成兩個分別與 DNA 片段兩端互補的寡聚核苷酸引物 在有過量的引物 過量 的底物 4 種 dNTP DNA 聚合酶以及模板 待擴增片段的 DNA 分子 的反應體系中 經(jīng)過高溫變性 使 DNA 鏈解開 低溫退火 使引物與模板結合 和適溫延伸 新合成 的 DNA 片段 三個階段的循環(huán)周期 對 DNA 分子進行擴增 特點 極強的擴增能力 度高 靈敏性 高度特異性 只需微量模板 只需數(shù)小時 擴增產(chǎn)物量大 變性 復性 延伸三個步聚循環(huán) 進行 操作簡便 適用廣泛 但可出現(xiàn)假陽性 DNA 序列測定 DNA 序列測定是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎 上建立起來的 包括 Sanger 雙脫氧鏈末端終止法和化學降解法 Sanger 法的基本原理是 雙脫氧核苷酸 ddNTP 在 DNA 合成過程中代替相應的脫氧核苷酸 dNTP 作為底物 不能形成 3 5 磷酸二酯鍵而導致鏈延伸終止 化學降解法 是采用化學試劑處理末端放 射性標記的 DNA 單鏈片段 造成堿基特異性切割 由此產(chǎn)生一組具有不同長度的 DNA 鏈的反應混合物 經(jīng)凝膠電泳按分子大小分離和放射自顯影 直接讀出待測 DNA 的核苷 酸順序 DNA 芯片技術 DNA 芯片技術是一種大規(guī)模集成的固相核酸分子雜交 以大量已 知堿基序列的寡核苷酸片段為探針 檢測樣品中哪些核酸序列與其互補 然后通過定性 定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息 DNA 芯片的主要技術流程包括 芯片的 設計與制備 靶基因的標記 常用熒光色素 生物素或放射性核素標記 dNTP 芯片雜交 與雜交信號檢測 特點 高通量 鑒別診斷 酶 DNA 聚合酶 所需探針 合成的寡核苷 酸片段 cDNA 已克隆的基因片段 雙鏈或單鏈 DNA 或 RNA 肽核酸 基因克隆技術 重組 DNA 技術 基因克隆是指某種目的基因的擴增與分離過程 具體是從基因組或 DNA 大片段中分離并獲得某一特定的基因或 DNA 片段 再通過 DNA 序列擴增形成由眾多拷貝組成的 DNA 拷貝群體的過程 其基本過程為 A 目的基因的制 備 栽體的選擇與制備 B DNA 分子的體外連接 C 將外源 DNA 導入宿主細胞 D 目 的基因的篩選與鑒定 E DNA 重組體的擴增與表達 39 原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點比較 兩者均涉及 RNA 聚合酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列 啟動子等 的相互作用 真核需要多 種轉(zhuǎn)錄因子輔助 原核不需要 真核以正調(diào)控為主 原核以負調(diào)控為主 真核 3 種 RNA 聚合酶負責不同種類基因的轉(zhuǎn)錄 原核只有 1 種 RNA 聚合酶 40 原核生物和真核生基因表達調(diào)控特點的比較 相同點 轉(zhuǎn)錄起始是基因表達調(diào)控的關鍵環(huán)節(jié) 不同點 A 原核基因表達調(diào)控主 要包括轉(zhuǎn)錄和翻譯水平 真核基因表達調(diào)控主要包括染色質(zhì)活化 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄后加工 翻 譯 翻譯后加工多個層次 B 原核基因表達調(diào)控主要為負調(diào)節(jié) 真核主要為正調(diào)節(jié) C 原核轉(zhuǎn)錄起始不需要轉(zhuǎn)錄因子 RNA 聚合酶直接結合啟動子 由 因子決定基因表達的特 異性 真核轉(zhuǎn)錄起始需要基礎 特異兩類轉(zhuǎn)錄因子 依賴 DNA 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相 互作用 調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活 D 原核基因表達調(diào)控主要采用操縱子模型 轉(zhuǎn)錄出多順反子 RNA 實現(xiàn)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) 真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子 RNA 功能相關蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達 機制更為復雜 精品 感謝下載載 41 質(zhì)粒的特征 原核細胞中染色體外的共價閉合的環(huán)狀 DNA 分子 能獨立于細胞的染色體而進 行復制 并依賴于宿主細胞 在同一宿主中具有不相容性 即具有相同復制起始位點和 分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個宿主菌 具有嚴格的遺傳控制系統(tǒng) 復制調(diào)控系統(tǒng) 分配系統(tǒng) 細胞分裂控制系統(tǒng) 位點特異重組系統(tǒng) 其所攜帶的遺傳信息能賦予宿主 細胞特定的遺傳性狀 是 DNA 重組技術中所使用的主要載體 作為克隆載體的質(zhì)粒具 有的特點 分子量較小 能在細菌內(nèi)穩(wěn)定存在 有較高的拷貝數(shù) 具有一個以上的遺傳標 志 具有多個限制酶的單一切點 稱為多克隆位點 便于外源基因的插入 42 真核生物基因組結構與功能的特點 每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目 體細胞一般為雙倍體 真核基因組遠 遠大于原核生物的基因組 具有許多復制起點 真核基因組由一個結構基因與相關的調(diào) 控區(qū)組成 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子 即一分子 mRNA 只能翻譯一種蛋白質(zhì) 真核生物分 子含有大量重復順序 真核生物基因組內(nèi)非編碼的順序占 90 以上 真核基因是斷裂 基因 功能相關的基因構成各種基因家族 真核生物基因組中也存在一些可移動的遺 傳因素 43 蛋白質(zhì)生物合成后的靶向輸送過程及特點 蛋白質(zhì)合成后 定向地被輸送到最終發(fā)揮生物學功能的部位稱為靶向輸送 靶向輸送 的蛋白質(zhì)的 N 端往往有一些特異的氨基酸序列 稱為信號序列 是決定蛋白質(zhì)靶向輸送特 性的重要元件 通過信號序列引導蛋白質(zhì)從胞漿進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 線粒體 葉