國自然-面上項(xiàng)目標(biāo)書范例.doc

國家自然科學(xué)基金申請(qǐng)書 2010版申請(qǐng)代碼H1606受理部門 收件日期受理編號(hào)國家自然科學(xué)基金申 請(qǐng) 書(2010版) 您現(xiàn)在不能檢查保護(hù)文檔或打印文檔，請(qǐng)根據(jù)以下三個(gè)步驟操作： 1)如果您是Word2000,word XP, word 2003或以上版本用戶，請(qǐng)把Word宏的安全性設(shè)為:中 方法: Word菜單-工具-宏-安全性-安全級(jí),設(shè)置為中 (如果您是Word97用戶，繼續(xù)執(zhí)行以下步驟) (如果您是Office2007用戶，點(diǎn)擊word左上角安全警告處選項(xiàng)中的啟用此內(nèi)容) 2)關(guān)閉本文檔，重新打開本文檔 3)點(diǎn)擊啟用宏按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了資助類別：面上項(xiàng)目亞類說明： 附注說明： 項(xiàng)目名稱：Pyk2促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的一個(gè)新的分子機(jī)制研究：結(jié)合并磷酸化E-cadherin?申 請(qǐng) 人： 電話：依托單位：通訊地址：郵政編碼：266021 單位電話：電子郵箱： 申報(bào)日期： 2010年2月26日國家自然科學(xué)基金委員會(huì)基本信息yoKWT/OQ申 請(qǐng) 人 信 息姓名性別男出生年月1973年4月民族漢族學(xué)位博士職稱副主任醫(yī)師每年工作時(shí)間（月）8 電話電子郵箱傳真 國別或地區(qū)中國個(gè)人通訊地址工作單位主要研究領(lǐng)域腫瘤分子生物學(xué) 依托單位信息名稱聯(lián)系人電子郵箱電話網(wǎng)站地址合作研究單位信息單 位 名 稱項(xiàng) 目 基 本 信 息項(xiàng)目名稱資助類別面上項(xiàng)目 亞類說明 附注說明 申請(qǐng)代碼H1606:腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移H1617:消化系統(tǒng)腫瘤基地類別 研究年限2011年1月 2013年12月研究屬性基礎(chǔ)研究 申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)35.0000萬元摘 要(限400字)：E-cadherin的喪失與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其喪失的主要原因是由于其酪氨酸殘基被磷酸化后蛋白被降解。我們通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的能與E-cadherin相互作用的非受體型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增強(qiáng)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。本課題假設(shè)Pyk2結(jié)合并磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin蛋白降解，細(xì)胞遷移性增加。本課題設(shè)計(jì)首先通過GST pulldown、免疫共沉淀證明二者相互作用可靠；其次通過磷酸化實(shí)驗(yàn)確證Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后應(yīng)用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)確定：Pyk2通過磷酸化E-cadherin而影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移；最后分析在人肝癌標(biāo)本中二者表達(dá)的相關(guān)性以及與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本課題新發(fā)現(xiàn)Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移，具有國際先進(jìn)性。這對(duì)于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機(jī)制有新的理解，對(duì)于藥物研發(fā)提供新的思路。關(guān) 鍵 詞(用分號(hào)分開，最多5個(gè))肝癌；E-cadherin；Pyk2；腫瘤轉(zhuǎn)移 第 4 頁 版本1.003.356經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)表 （金額單位：萬元）科目申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)備注（計(jì)算依據(jù)與說明）一.研究經(jīng)費(fèi)28.75001.科研業(yè)務(wù)費(fèi)7.6000（1）測試/計(jì)算/分析費(fèi)2.1000DNA測序，生物信息分析，統(tǒng)計(jì)分析（2）能源/動(dòng)力費(fèi)（3）會(huì)議費(fèi)/差旅費(fèi)1.0000參加學(xué)術(shù)會(huì)議3-4人次（4）出版物/文獻(xiàn)/信息傳播費(fèi)3.0000文獻(xiàn)檢索，發(fā)表論文，專利申請(qǐng)（5）其他1.5000成果鑒定2.實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)21.1500（1）原材料/試劑/藥品購置費(fèi)17.1500各種試劑盒，脂質(zhì)體，抗體，細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)耗材（2）其他4.0000動(dòng)物飼養(yǎng)，臨床調(diào)研3.儀器設(shè)備費(fèi)0.0000（1）購置（2）試制4.實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi)5.協(xié)作費(fèi)二.國際合作與交流費(fèi)1.50001.項(xiàng)目組成員出國合作交流2.境外專家來華合作交流1.5000邀請(qǐng)美國康奈爾大學(xué)關(guān)軍林教授合作交流三.勞務(wù)費(fèi)3.0000研究生加班補(bǔ)貼四.管理費(fèi)1.75005%管理費(fèi)合 計(jì)35.0000與本項(xiàng)目相關(guān)的其他經(jīng)費(fèi)來源國家其他計(jì)劃資助經(jīng)費(fèi)其他經(jīng)費(fèi)資助（含部門匹配）其他經(jīng)費(fèi)來源合計(jì)0.0000報(bào)告正文第 18 頁 一、立項(xiàng)依據(jù)與研究內(nèi)容： （一）項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國的肝癌發(fā)病數(shù)占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我國對(duì)于肝癌的研究顯得非常迫切1。肝癌非常容易轉(zhuǎn)移，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。了解肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，對(duì)于設(shè)計(jì)合理的治療藥物，進(jìn)一步提高我國肝癌的治療水平具有重要意義2。E-cadherin在肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中起到了不可忽視的作用。E-cadherin屬于鈣粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞間的接觸抑制和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。E-cadherin與-catenin、p120等形成復(fù)合體發(fā)揮上述功能3。E-cadherin與多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān) 4-5 。有人認(rèn)為提高E-cadherin的表達(dá)可以成為腫瘤治療的一個(gè)方向6。與其他腫瘤類似，研究表明E-cadherin在肝細(xì)胞癌的陽性率顯著低于癌旁組織及正常肝組織，表達(dá)越低則腫瘤病理分級(jí)越差，也越容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移7-9。有人報(bào)道缺乏E-cadherin表達(dá)的人肝癌細(xì)胞株非常容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，但是轉(zhuǎn)染E-cadherin后這種特性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明E-cadherin在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用10。E-cadherin喪失或低表達(dá)的機(jī)制至今仍然不是完全清楚。目前認(rèn)為可能是由于基因突變導(dǎo)致功能喪失、啟動(dòng)子甲基化后轉(zhuǎn)錄沉默11以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亞洲人群中基因突變和啟動(dòng)子甲基化都不常見12-13 。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文獻(xiàn)證明，酪氨酸殘基磷酸化的E-cadherin能夠與Hakai（一種E3泛素連接酶）結(jié)合，使其泛素化而降解14 。那么有多少酪氨酸激酶參與這個(gè)機(jī)制呢？有報(bào)道EGFR，IGF-1R能夠磷酸化E-cadherin。對(duì)于E-cadherin磷酸化的調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍然不是非常明確。為了解E-cadherin在肝癌細(xì)胞的分子信號(hào)通路，我們以E-cadherin（胞內(nèi)段）為誘餌應(yīng)用酵母雙雜交（CytoTRAP系統(tǒng)）在肝臟的cDNA文庫中篩選到一個(gè)新的能與E-cadherin相互作用的非受體型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin并調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移呢？Pyk2(proline rich tyrosine kinase 2)是一種富含脯氨酸的非受體型酪氨酸蛋白激酶，與FAK同源度較高，屬于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和遷移16方面受到越來越多的關(guān)注。Pyk2信號(hào)通路的活化能夠增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，研究發(fā)現(xiàn)Pyk2在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用17-18。其中Sun等研究表明， Pyk2在59%的肝癌組織中表達(dá)上調(diào)， Pyk2高表達(dá)與肝癌組織體積、Edmonson分級(jí)呈正相關(guān)， Pyk2表達(dá)越高病人預(yù)后越差。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示在侵襲邊緣的肝癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)移到肺結(jié)節(jié)中的肝癌細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)Pyk2高表達(dá)。肝癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Pyk2后，其遷移功能增強(qiáng)；而用裸鼠做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制Pyk2的活性后肝癌腫瘤的大小和肺轉(zhuǎn)移率都較對(duì)照明顯減少19-20。Pyk2調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制是什么呢？有研究表明，在肝癌細(xì)胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，與c-Src形成復(fù)合體激活ERK通路，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲性19-20；也有報(bào)道Pyk2與 PECAM-1（血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子，與E-cadherin一樣都屬于鈣粘附蛋白家族）結(jié)合并且都影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性21 ；還有報(bào)道RhoC通過激活Pyk2促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移18以及與SOCS3、Cyr61有關(guān)等 22-23?？偠灾壳癙yk2調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍不十分清楚。Pyk2與E-cadherin能否結(jié)合并調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移呢？這是我們想要研究的問題。我們繼續(xù)應(yīng)用酵母雙雜交反復(fù)驗(yàn)證、GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀證明二者相互作用是可靠的（具體結(jié)果見研究基礎(chǔ)）。那么，現(xiàn)在的問題是二者在體內(nèi)狀態(tài)下是否結(jié)合？結(jié)合后的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么？二者的結(jié)合位點(diǎn)在什么地方？結(jié)合后如何調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移以及影響腫瘤轉(zhuǎn)移？考慮到Pyk2是一個(gè)激酶蛋白，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)E-cadherin與Pyk2的激酶部分結(jié)合，因此有兩種可能性。一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種就是E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。我們認(rèn)為第一種可能性較大。有文獻(xiàn)報(bào)道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族成員）并且抑制其與Catenin，P120等形成復(fù)合體24-25。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質(zhì)相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應(yīng)該也有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測，由于腫瘤始動(dòng)因素的作用，Pyk2表達(dá)增多，活性增強(qiáng)，從而磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin降解，最終使細(xì)胞遷移性增強(qiáng)。但是也不能排除第二種可能性，E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲性下降。申請(qǐng)人以前的工作就發(fā)現(xiàn)鈣粘附蛋白家族的另外一個(gè)成員- Protocadherins能夠抑制Pyk2的活性26，申請(qǐng)人做這方面工作時(shí)曾取E-cadherin做對(duì)比參照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Pyk2激酶活性不是很明顯（本數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此不支持第二種可能性。二者具體如何調(diào)節(jié)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。本課題的設(shè)計(jì)主要是為了解答上述問題。首先在前期工作基礎(chǔ)上繼續(xù)明確Pyk2與E-cadherin能相互作用以及調(diào)節(jié)機(jī)制；其次應(yīng)用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)確定二者的調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲性的影響；然后應(yīng)用裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)明確二者的調(diào)節(jié)在對(duì)肝癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響；最后分析在肝癌病人組織標(biāo)本中二者表達(dá)的相關(guān)性以及與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。本課題在國際上最新發(fā)現(xiàn)Pyk2與E-cadherin直接相互作用，并且確定其結(jié)合機(jī)制，明確這種調(diào)節(jié)與肝癌細(xì)胞遷移力和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。這對(duì)于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機(jī)制有新的理解。許多新型抗癌藥物如赫賽汀、格列衛(wèi)、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶為治療靶點(diǎn)，取得非常好的療效。本研究對(duì)于確定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做為分子治療靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)合理的治療藥物可以提供更有利的素材。參考文獻(xiàn)：1 He J, Gu D, Wu X, et al. 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J Biol Chem. 2009 Jan 30;284(5):2880-90 （二）項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。.主要研究內(nèi)容1）確定E-cadherin與Pyk2體外、體內(nèi)相互作用、作用位點(diǎn)以及調(diào)節(jié)關(guān)系。A取E-cadherin與Pyk2不同結(jié)構(gòu)域和不同突變體，應(yīng)用酵母雙雜交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法確定二者相互作用的結(jié)構(gòu)域，以及作用位點(diǎn)。B.選取二者表達(dá)量都適中的肝癌組織，行內(nèi)源性免疫共沉淀，證明在體內(nèi)二者也相互作用。C.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和蔗糖密度梯度超速離心方法分析細(xì)胞組分的方法確定E-cadherin與Pyk2在細(xì)胞中共定位。D.應(yīng)用磷酸化實(shí)驗(yàn)，確定E-cadherin是否是Pyk2的底物，應(yīng)用定點(diǎn)突變的方法，確定酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)。（同時(shí)再次確證E-cadherin能否影響Pyk2激酶活性。）2）從細(xì)胞水平確定Pyk2對(duì)E-cadherin的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞遷移。A.篩選Pyk2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，然后應(yīng)用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)Pyk2的細(xì)胞其遷移性、侵襲性的變化，檢測過表達(dá)Pyk2時(shí)E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的變化，確定Pyk2對(duì)E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞遷移。B.取高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-H 、HCCLM3 (購自上海中山醫(yī)院肝癌研究所)，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Pyk2的表達(dá)，觀察細(xì)胞遷移性、侵襲性的變化，檢測相應(yīng)狀態(tài)下E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和表達(dá)水平的變化。從相反方向確定Pyk2的表達(dá)抑制后對(duì)E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)，以及這種調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。3）從動(dòng)物模型水平確定Pyk2對(duì)E-cadherin的調(diào)節(jié)影響腫瘤轉(zhuǎn)移。應(yīng)用Pyk2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移肝轉(zhuǎn)移情況，分析Pyk2的過表達(dá)對(duì)E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)關(guān)系，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4）從肝癌病人標(biāo)本中尋找Pyk2與E-cadherin磷酸化狀態(tài)的相關(guān)性，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的的相關(guān)性。收集肝癌標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化和Western等方法確定Pyk2的表達(dá)水平的變化與E-cadherin磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的相關(guān)性，以及二者與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。.研究目標(biāo)1）確定Pyk2結(jié)合E-cadherin相互作用的結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)，并闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制。2）確定Pyk2與E-cadherin的調(diào)節(jié)可影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。.擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題E-cadherin酪氨酸殘基的磷酸化導(dǎo)致其被降解，增加細(xì)胞侵襲性。本課題能夠確定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2與E-cadherin的調(diào)節(jié)是否是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新的分子機(jī)制。（三）擬采取的研究方案及可行性分析。.研究方法GST-pull down，熒光共定位，內(nèi)源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速離心，磷酸化實(shí)驗(yàn)，定點(diǎn)突變，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，RNAi抑制Pyk2表達(dá)，細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，免疫組化，定量PCR，Western檢測等。.關(guān)鍵技術(shù)說明：1）磷酸化實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為陽性參照，以純化的GST-E-cadherin蛋白為底物，以GST蛋白作為陰性對(duì)照，觀察Pyk2 是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin則應(yīng)用生物信息分析，定點(diǎn)突變，尋找磷酸化位點(diǎn)；如果不能磷酸化E-cadherin，則以通用底物E4Y1作為底物，加入不同量的E-cadherin觀察是否可以影響Pyk2的激酶活性。2）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)首先分別用空載體PCDNA3.1， PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株（PRNK為Pyk2的C段，為Pyk2的失活突變體），用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。并檢測穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株P(guān)yk2蛋白表達(dá)量的不同。然后應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株做Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，比較細(xì)胞遷移率的變化；檢測細(xì)胞遷移率的變化與Pyk2蛋白表達(dá)量的關(guān)系。同時(shí)取相應(yīng)細(xì)胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測磷酸化狀態(tài)來比較E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化以及這些變化與腫瘤遷移的關(guān)系，與Pyk2蛋白表達(dá)量的關(guān)系。3）裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)取上述三組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株分別接種裸鼠，待腫瘤直徑約1-1.5cm時(shí)取出腫瘤重新接種于另外一批裸鼠的肝左葉。接種5星期左右處死裸鼠，收集肝臟和肺臟，觀察肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況和肺轉(zhuǎn)移情況。檢測三組腫瘤Pyk2蛋白表達(dá)量的不同以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。同時(shí)取相應(yīng)腫瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測磷酸化狀態(tài)來比較E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化，確定這些變化與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，與Pyk2蛋白表達(dá)量的關(guān)系。4）蔗糖密度梯度超速離心定位和內(nèi)源免疫共沉淀取肝癌腫瘤的癌旁組織，裂解離心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速離心。取離心后的不同組分樣品做Western，分別用E-cadherin抗體和Pyk2抗體作為一抗檢測。如果二者表達(dá)最多的峰值是在同一個(gè)組分中，則提示我們二者在細(xì)胞內(nèi)是共定位的。取上述二者的表達(dá)較多的組分，用Pyk2單抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作對(duì)照），然后用E-cadherin單抗雜交檢測E-cadherin是否能與Pyk2共沉淀下來。相反方向則是：用E-cadherin單抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作對(duì)照），然后用Pyk2單抗雜交檢測Pyk2是否能與E-cadherin共沉淀下來。.技術(shù)路線（見下圖）定點(diǎn)突變，GST-pull down，免疫共沉淀等方法驗(yàn)證確定相互作用的結(jié)構(gòu)域以及位點(diǎn)熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等方法驗(yàn)證在細(xì)胞以及腫瘤組織中共定位收集肝癌病人標(biāo)本和臨床資料免疫組化、Western等方法檢測E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2表達(dá)量的相關(guān)性，以及與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。磷酸化實(shí)驗(yàn)確定E-cadherin是否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點(diǎn)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):測Pyk2蛋白過表達(dá)和RNAi抑制時(shí)與E-cadherin磷酸化水平、細(xì)胞遷移的關(guān)系。篩選穩(wěn)定表達(dá)Pyk2肝癌細(xì)胞株，檢測Pyk2蛋白表達(dá)量與E-cadherin磷酸化水平的關(guān)系。裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):Pyk2蛋白表達(dá)量、E-cadherin磷酸化水平與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。匯總分析數(shù)據(jù)：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin機(jī)制；揭示Pyk2通過磷酸化E-cadherin影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。1. 左側(cè)部分：取E-cadherin與Pyk2不同結(jié)構(gòu)域和不同突變體，應(yīng)用酵母雙雜交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法確定二者相互作用的結(jié)構(gòu)域，以及作用位點(diǎn)。熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等方法驗(yàn)證二者在細(xì)胞以及腫瘤組織中共定位；磷酸化實(shí)驗(yàn)確定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點(diǎn)。這部分內(nèi)容從生化的角度確定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子機(jī)制。2. 中間部分：通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平、動(dòng)物模型確定：Pyk2通過磷酸化E-cadherin影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。3. 右側(cè)部分：收集肝癌病人標(biāo)本和臨床資料，通過免疫組化、Western等方法檢測E-cadherin /Pyk2蛋白水平、磷酸化狀態(tài)，分析二者表達(dá)量的相關(guān)性，以及與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4. 最下面部分為匯總數(shù)據(jù)，總結(jié)分析。4.可行性分析1） 前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)從酵母雙雜交、GST-Pull Down、免疫共沉淀等證實(shí)了E-cadherin與Pyk2相互作用(見研究基礎(chǔ)部分)，而且二者功能上密切相關(guān)。E-cadherin作為一種細(xì)胞黏附分子在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和接觸抑制方面具有作用。而Pyk2能通過各種信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、擴(kuò)散和遷移等過程。因此，二者在功能上是有互相作用基礎(chǔ)的?？紤]到Pyk2是一個(gè)激酶蛋白，且前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Pyk2激酶區(qū)域結(jié)合E-cadherin，因此有兩種可能，一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種是E-cadherin抑制Pyk2激酶活性。我們認(rèn)為第一種可能性較大。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且抑制其與Catenin、P120等形成復(fù)合體，從而影響細(xì)胞遷移。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質(zhì)相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應(yīng)該就有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測，由于腫瘤始動(dòng)因素的作用，Pyk2表達(dá)增多，活性增強(qiáng)，從而磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin降解，最終使細(xì)胞遷移性增強(qiáng)。我們上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本基于這個(gè)邏輯。磷酸化實(shí)驗(yàn)證實(shí)Pyk2磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin蛋白減少。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)邏輯是通過Pyk2過表達(dá)，檢測E-cadherin磷酸化增強(qiáng)，蛋白量減少，導(dǎo)致細(xì)胞遷移增強(qiáng)或者腫瘤轉(zhuǎn)移增加；RNAi抑制Pyk2的表達(dá)，則出現(xiàn)相反的結(jié)果，E-cadherin磷酸化減弱，蛋白量增加，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲性減弱和腫瘤肺轉(zhuǎn)移減少。事實(shí)是否如此，需要實(shí)驗(yàn)來證明。申請(qǐng)人以前的工作曾發(fā)現(xiàn)鈣粘附蛋白家族的另外一個(gè)成員- Protocadherins能夠抑制Pyk2的活性，因此從邏輯上講也不能完全排除第二種可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是這樣的話，則可能的假設(shè)是：在正常細(xì)胞中，E-cadherin抑制Pyk2的活性，在腫瘤條件下，由于其他原因E-cadherin減少或消失，而不能抑制Pyk2活性，導(dǎo)致Pyk2活性增強(qiáng)，因而腫瘤細(xì)胞遷移性增強(qiáng)。如果基于這個(gè)邏輯的話，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)就要改變?yōu)椋毫姿峄瘜?shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為底物，觀察E-cadherin對(duì)Pyk2激酶活性是否有抑制作用。然后篩選E-cadherin過表達(dá)、功能失活突變體和空載體的穩(wěn)定表達(dá)肝癌細(xì)胞株，然后行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察E-cadherin蛋白過表達(dá)或功能失活突變后與細(xì)胞遷移或者腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時(shí)檢測其與Pyk2蛋白表達(dá)量及磷酸化水平相關(guān)性。但是申請(qǐng)人在完成- Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做對(duì)比參照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明顯，因此這種可能性不大。從上面的分析來看，本課題在理論和邏輯上是可行的。2）本課題是本人前期工作的延續(xù)，本人對(duì)E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體等為本課題的下一步研究提供了很多有利的條件。本課題組的成員對(duì)所需要的技術(shù)方法都很熟練，且都有相應(yīng)的工作基礎(chǔ)，可以在各個(gè)方面進(jìn)行協(xié)作。 3）本課題所涉及的技術(shù)均為較成熟的技術(shù)，所需的設(shè)備和條件本校都具備。（四）本課題的特色與創(chuàng)新之處1.本課題通過酵母雙雜交新發(fā)現(xiàn)一個(gè)與E-cadherin相互作用的蛋白-非受體型酪氨酸激酶Pyk2，并證明兩者的相互作用可靠，國內(nèi)外研究至今未曾見過報(bào)道，具有國際先進(jìn)性和獨(dú)創(chuàng)性。（有報(bào)道二者的表達(dá)量與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，但是二者直接相互作用未見報(bào)道。）2. 本課題新發(fā)現(xiàn)Pyk2磷酸化E-cadherin影響肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)于E-cadherin在肝癌轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制有新的理解，因此具有獨(dú)創(chuàng)性和先進(jìn)性。（五）年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果1.年度研究計(jì)劃2011.01-2011.12 磷酸化實(shí)驗(yàn)確定二者的調(diào)節(jié)關(guān)系，肝癌組織內(nèi)源免疫共沉淀確定相互作用可靠，同時(shí)確定二者結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，磷酸化位點(diǎn)。蔗糖密度梯度超速離心，熒光共定位等相關(guān)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證二者共定位。同時(shí)收集病例標(biāo)本，收集臨床資料。純化蛋白制備抗體。2012.01-2012.12 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測Pyk2的表達(dá)與E-cadherin的磷酸化狀態(tài)，以及細(xì)胞遷移的關(guān)系，確定其調(diào)節(jié)機(jī)制。同時(shí)完成E-cadherin/Pyk2的表達(dá)以及磷酸化狀態(tài)與肝癌的分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、復(fù)發(fā)等臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析。2013.01-2013.12 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)遺漏，整理實(shí)驗(yàn)資料，統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫論文。2.預(yù)期研究結(jié)果1)確定Pyk2能夠磷酸化E-cadherin，以及二者相互作用的結(jié)構(gòu)域以及磷酸化位點(diǎn)。2)確定Pyk2通過磷酸化E-cadherin，從而影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。3)確定在肝癌組織中E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2表達(dá)量的相關(guān)性，以及二者的表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4)在國外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表SCI論文2-4篇，其中影響因子大于5的有一篇以上。在國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文2-4篇，并在國內(nèi)外學(xué)術(shù)會(huì)議交流。5)培養(yǎng)研究生2-3名。二、研究基礎(chǔ)與工作條件（一） 研究基礎(chǔ)第一步：為了研究肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，首先選取E-cadherin（胞內(nèi)段，以下實(shí)驗(yàn)同）為誘餌在肝臟的cDNA文庫中做酵母雙雜交，尋找與E-cadherin相互作用的蛋白。我們先選取的是LACZ系統(tǒng)藍(lán)白斑篩選，但是因?yàn)楸尘案叨艞?。后來選取CytoTRAP系統(tǒng)，背景明顯減低，測序后有意義的基因有31個(gè)。其中有4個(gè)為Pyk2片段。通過克隆Pyk2基因全長驗(yàn)證，確定二者在酵母中的相互作用是強(qiáng)陽性的（圖1）。（同時(shí)驗(yàn)證Pyk2的同源蛋白FAK與E-cadherin相互作用為可疑弱陽性）。圖1 酵母雙雜交（CytoTRAP系統(tǒng)）驗(yàn)證Pyk2與E-cadherin相互作用pMyr-Lamin為陰性對(duì)照，pMyr-SB為陽性對(duì)照，E-Cad為E-Cadherin縮寫，以下圖示與此相同。Psos-E-Cad為誘餌蛋白。CytoTRAP系統(tǒng)酵母雙雜交特點(diǎn)為兩個(gè)蛋白如果不相互作用在25時(shí)可以生長，而在37則不能生長,如陰性對(duì)照pMyr-Lamin所示。兩個(gè)蛋白如果相互作用則在兩個(gè)溫度下都能生長,如陽性對(duì)照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2與陽性對(duì)照相似。第二步：原核表達(dá)E-cadherin和His-Pyk2進(jìn)行GST-Pulldown。為了驗(yàn)證二者是直接結(jié)合，我們分別細(xì)菌中表達(dá)純化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全長非常難純化，得不到純化的蛋白。我們表達(dá)純化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Pyk2的激酶部分能夠與E-cadherin直接結(jié)合（圖2）。 泳道 1 2 3圖2 原核表達(dá)E-cadherin和His-Pyk2激酶部分進(jìn)行GST-Pulldown。 分別原核表達(dá)GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分別與相同量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育，重復(fù)洗三次，用his抗體Western檢測，結(jié)果顯示His-Pyk2激酶部分能夠與GST-E-cadherin結(jié)合（泳道3），而不能與GST結(jié)合（泳道2），泳道1上圖是純化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作為檢測標(biāo)準(zhǔn)。第三步：原核表達(dá)