鎳柱蛋白純化.doc

鎳柱蛋白純化一、原理鎳柱里面含有瓊脂糖微球體，在瓊脂糖鰲合介質(zhì)的作用下微球體與Ni2+發(fā)生螯合，螯合后的Ni2+能與HIS上的咪唑環(huán)發(fā)生特殊的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。影響蛋白質(zhì)/多肽與金屬離子鰲合力大小的因素主要是蛋白質(zhì)表面可結(jié)合的氨基酸（種類、數(shù)目和分布）、金屬離子的種類和密度、層析條件（pH、鹽的種類和濃度、添加劑等）二、緩沖液的配制(500ml PH=7.4)Binding buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 20mM咪唑 1.8g （550mM）Washing buffer: PB 50 mM Nacl 14.625g 5mM 0.45g 10 mM 0.9g 15 mM 1.35g 20 mM 1.8g 40Mm 3.6gElution buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 100 mM 9g 200mM 18g400mM咪唑 45g 600mM咪唑 63g三、操作步驟 此步驟過鎳柱的所有溶液、上清蛋白都要先用濾膜過濾，所有液體過鎳柱的速度要嚴(yán)格控制2.5ml /min，中間鎳柱不能進(jìn)氣泡1、5倍鎳柱體積去離子水洗滌，去除空氣和20%乙醇 (5ml /min)2、510倍鎳柱體積Binding buffer平衡3、上蛋白樣品4、5倍鎳柱體積Wsahing buffer 洗脫雜蛋白(HIS標(biāo)簽含有6個(gè)組氨酸，結(jié)合能力強(qiáng)于含有單個(gè)組氨酸的雜蛋白)，此步驟設(shè)洗脫梯度5、5倍鎳柱體積Elution buffer洗脫目的蛋白，此步驟設(shè)洗脫梯度6、5倍體積去離子水清洗掉緩沖液7、20%乙醇保存于 4注意：洗脫可能會(huì)把金屬離子和蛋白質(zhì)的復(fù)合物一起洗下來四、鎳柱重生（介質(zhì)使用約3-20次，具體與原料來源、樣品體積等有關(guān)）1. 鎳柱用去離子水清洗2. 5倍鎳柱體積EDTA 重生鎳柱(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA，pH 7.4)3. 5倍體積 Binding buffer 平衡4. 5倍體積去離子水清洗5. 20倍體積 1M NaoH 洗滌6. 水洗至中性7. 5倍柱體積掛鎳8. 用5倍體積以上的純水清洗層析柱，去除游離的金屬離子9. 20% 乙醇保存 4五、注意事項(xiàng)1、推薦在中性至弱堿性的條件下（PH 78）結(jié)合重組蛋白，磷酸鹽Buffer是常用的緩沖液，Tric-cl在一般情況下可用，但要注意它會(huì)降低結(jié)合強(qiáng)度2、避免在Buffer中包含EDTA或檸檬酸鹽等螯合劑3、若重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，在所有Buffer中添加6M鹽酸胍或8M尿素4、避免緩沖液中有高濃度的供電子基團(tuán)，如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris5、各種Buffer中不能含有高濃度的強(qiáng)還原劑，比如DTT，防止二價(jià)NI被還原6、不能含有離子型的去垢劑，比如SDS,防止Ni流失7、Buffer里可加入甘油，防止蛋白之間由于疏