各種類型細(xì)胞器探針.doc

各種類型的細(xì)胞器探針線粒體線粒體是細(xì)胞的能量工廠。因其參與了細(xì)胞凋亡，這些年也成為研究的熱門(mén)。線粒體的熒光探針主要有：JC-1、Rhodamine 123等，Invitrogen還推出專門(mén)的MitoTracker 系列探針。JC-1是用得最多的。它在濃度或線粒體膜電位低時(shí)，以單體存在，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm，呈綠色熒光。當(dāng)濃度升高或線粒體膜電位升高時(shí)，JC-1形成J-聚體，呈橙色熒光，此時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm。JC-1最重要的應(yīng)用是檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)線粒體的膜電位，以及追蹤凋亡細(xì)胞中的線粒體變化。Rhodamine 123是一種能滲透入細(xì)胞，帶陽(yáng)離子的熒光探針。它的激發(fā)波長(zhǎng)為505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為534 nm?；罴?xì)胞攝取Rhodamine 123達(dá)到平衡的速度較快，只需5分鐘，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，即可見(jiàn)到線粒體被Rhodamine 123染成綠色。當(dāng)細(xì)胞被反復(fù)沖洗時(shí)，Rhodamine 123通常不被細(xì)胞保留，但許多癌細(xì)胞可較長(zhǎng)時(shí)間保留這種染料，因此，它有助于某些癌癥的診斷。MitoTracker 系列探針則是Invitrogen專為線粒體而設(shè)計(jì)的。MitoTracker是細(xì)胞通透性的，只要與細(xì)胞簡(jiǎn)單孵育，就能被動(dòng)滲透質(zhì)膜，在有活性的線粒體中積累。一旦線粒體被標(biāo)記，細(xì)胞就能用甲醛固定劑固定，一些MitoTracker探針能在固定之后保留在線粒體內(nèi)。這對(duì)致病細(xì)胞格外有用。而一些探針在隨后的去污劑處理后還能保留，這樣就能用在免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交中。盡管傳統(tǒng)的線粒體探針如Rhodamine 123也很容易標(biāo)記線粒體，但是一旦線粒體的膜電位損失，它們就很容易被洗掉。這就限制了某些應(yīng)用。MitoTracker探針又分為好幾種，且有紅色、綠色和橙色。其中還原態(tài)的MitoTracker Orange CM-H2TMRos和MitoTracker Red CM-H2Xros在進(jìn)入細(xì)胞后不發(fā)出熒光，直到它們被氧化成相應(yīng)的線粒體選擇性探針，并聚集在線粒體內(nèi)。紅色的MitoTracker探針都適合于多色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈兊募t色熒光能與其他綠色熒光很好地區(qū)分開(kāi)。盡管有些MitoTracker探針能實(shí)現(xiàn)固定細(xì)胞中的線粒體標(biāo)記，但這些染料還是只推薦給活細(xì)胞。如果你想要標(biāo)記固定細(xì)胞，可以選擇OxPhos的抗體+熒光二抗。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能有哪些？你還記得嗎？復(fù)習(xí)一下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中由膜圍成的分支小管、小囊或扁平囊狀結(jié)構(gòu)連通而成的管道系統(tǒng)，可分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩種。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著有核糖體，是合成蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則功能多樣，比如在肝細(xì)胞中與解毒和糖代謝有關(guān)。常用的DiOC6(3) 及相似的DiOC5(3) 都屬于短鏈羰花菁染料，它們廣泛用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究，包括神經(jīng)元、酵母中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)作用和動(dòng)力學(xué)，以及不同細(xì)胞類型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和微管的形態(tài)關(guān)系。它們不僅可標(biāo)記活細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也可以用于甲醛固定的細(xì)胞。DiOC6(3) 進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，在激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)學(xué)特征很容易識(shí)別。需要注意的是，在相對(duì)低濃度時(shí)，DiOC6(3) 聚集在線粒體中，而在高濃度時(shí)，則可聚集于其他膜性細(xì)胞器，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。長(zhǎng)鏈的羰花菁染料DiIC16(3) 和DiIC18(3) 也可以標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。DiIC16(3) 的激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為564 nm；DiIC18(3) 的激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm，均呈黃色熒光。DiIC16(3) 和DiIC18(3) 的分子結(jié)構(gòu)與DiOC6(3) 大致相同。DiIC16(3)有兩個(gè)更長(zhǎng)的碳鏈，使Dil不能透過(guò)膜。一旦DiI 結(jié)合到膜內(nèi)，它就保留膜中，在膜的兩層內(nèi)自由擴(kuò)散。DII 已經(jīng)用來(lái)標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞和肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。ER-Tracker染料是Invitrogen開(kāi)發(fā)的細(xì)胞通透性的活細(xì)胞染料，是ER高度選擇性的。它們與常規(guī)的ER染料DiOC6(3)不同，很少會(huì)對(duì)線粒體染色，且低濃度下的染色不會(huì)對(duì)細(xì)胞帶來(lái)毒性。ER-Tracker Blue-White DPX屬于Dapoxyl染料家族中的一員，因此有著相當(dāng)大的斯托克斯位移，長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)，以及高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。它的熒光對(duì)環(huán)境極其敏感，當(dāng)溶劑極性增加，熒光發(fā)射峰會(huì)移向更長(zhǎng)的波長(zhǎng)-從430 nm到640 nm，量子產(chǎn)率下降。Invitrogen推薦用標(biāo)準(zhǔn)的DAPI或UV longpass濾光片來(lái)觀察它的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色。ER-Tracker Green和ER-Tracker Red的激發(fā)/發(fā)射峰分別為504/511 nm和587/615 nm。真菌代謝物brefeldin A (BFA) 是解析多個(gè)胞內(nèi)進(jìn)程的重要工具，包括參與運(yùn)輸新合成蛋白的囊泡形成及驅(qū)動(dòng)蛋白分布。將細(xì)胞暴露在BFA中，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的失常，最終導(dǎo)致高爾基體形態(tài)的喪失，而去除BFA后，這些作用會(huì)完全逆轉(zhuǎn)。除了天然的BFA外，Invitrogen還提供了綠色和橙紅色的BFA衍生物。綠色的BODIPY FL和橙紅色的BODIPY 558/568 BFA衍生物能夠在幾種細(xì)胞系中對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)行選擇性染色。BODIPY 558/568 BFA可與NBD C6-ceramide共同使用，來(lái)同時(shí)了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。高爾基體高爾基復(fù)合體的功能主要是將由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)來(lái)的蛋白類物質(zhì)進(jìn)行加工、濃縮、儲(chǔ)存和運(yùn)送，最后形成分泌泡排除。高爾基復(fù)合體的熒光探針主要有NBD C6-Ceramide 和BODIPY FL C5-Ceramide 兩種。NBD C6-Ceramide呈綠色熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為464 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為532 nm，是目前應(yīng)用較廣泛的選擇性染色高爾基復(fù)合體的探針。它適用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。將熒光ceramide與BSA混合，有助于細(xì)胞標(biāo)記，而無(wú)需使用有機(jī)溶劑來(lái)溶解探針。NBD C6-Ceramide 目前應(yīng)用在以下方面的研究：檢測(cè)BFA對(duì)高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的作用效果；一種遺傳性脂代謝異常的疾病（Farbers疾?。┑难芯?；細(xì)胞內(nèi)凝血酶受體的轉(zhuǎn)運(yùn)和標(biāo)記等等。另外，NBD C6-Ceramide的熒光對(duì)高爾基體的膽固醇含量特別敏感，這個(gè)現(xiàn)象是BODIPY FL C5-Ceramide所沒(méi)有的。如果含有NBD C6-Ceramide的細(xì)胞是膽固醇饑餓的，那么高爾基體中積累的熒光特別不穩(wěn)定。不過(guò)，膽固醇合成的刺激會(huì)降低這種NBD光漂白。因此，NBD C6-Ceramide在監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中高爾基體的膽固醇含量時(shí)很有用。BODIPY FL C5-Ceramide也呈綠色熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為511 nm。它比NBD衍生物更加明亮，且不容易衰減，因此在很多應(yīng)用中都能夠替代NBD C6-Ceramide。BODIPY FL C5-Ceramide表現(xiàn)出濃度依賴的熒光特性。在高濃度，非極性的BODIPY FL熒光基團(tuán)形成受激準(zhǔn)分子，使熒光基團(tuán)的發(fā)射峰從515 nm（綠色）轉(zhuǎn)移到620 nm（紅色）。反面高爾基體上的BODIPY FL C5-Ceramide積累足夠形成受激準(zhǔn)分子，而周圍的細(xì)胞質(zhì)不會(huì)。利用紅光的濾光片就能選擇性觀察高爾基體。而且，這種二色性還能通過(guò)比例成像定量BODIPY FL C5-Ceramide的積累。溶酶體溶酶體為單層膜蛋白包圍的內(nèi)含一系列酸性水解酶的小體。溶酶體中含有多種酶，如糖苷酶、酸性磷酸酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶等等，是物質(zhì)代謝的場(chǎng)所。弱堿性胺選擇性聚集在胞內(nèi)低pH值的小室中，可用于研究溶酶體的生物合成和發(fā)病機(jī)理。其中最常用的就是DAMP，它不發(fā)熒光，需要和抗DNP的抗體共同使用，來(lái)觀察染色模式。中性紅、吖啶橙等熒光探針也常用于酸性細(xì)胞器的染色，不過(guò)它們?nèi)狈μ禺愋?。LysoTracker探針就是Invitrogen開(kāi)發(fā)的向酸性熒光探針，用于標(biāo)記和追蹤活細(xì)胞中的酸性細(xì)胞器。這些探針有幾個(gè)重要的特征：對(duì)酸性細(xì)胞器的高選擇性，在納摩爾濃度下能對(duì)活細(xì)胞有效標(biāo)記。而且，LysoTracker探針有幾種不同的顏色，適合多色標(biāo)記。LysoTracker探針是細(xì)胞膜通透性的，一般聚集在球形的細(xì)胞器中。研究人員發(fā)現(xiàn)探針在極低濃度（50 nM）下選擇性最佳。此外，較大的酸性細(xì)胞器在LysoTracker Red DND-99染色后，經(jīng)過(guò)甲醛固定仍保留其染色模式。對(duì)于那些想研究溶酶體生物發(fā)生動(dòng)力學(xué)的研究人員來(lái)說(shuō)，LysoSensor探針可謂量身定做。LysoSensor染料是向酸性的探針，由于質(zhì)子化作用聚集在酸性細(xì)胞器中。質(zhì)子化也緩解了染料的熒光淬滅，使熒光強(qiáng)度增加。因此，LysoSensor在酸化的環(huán)境中表現(xiàn)出pH依賴的熒光強(qiáng)度增加，而LysoTracker探針的熒光則沒(méi)有明顯變化。Invitrogen提供了5種LysoSensor試劑，pKa不同，顏色各異。LysoSensor Blue DND-167和LysoSensor Green DND-189的pKa值很低，處于酸性環(huán)境中才會(huì)發(fā)出熒光，而LysoSensor Green DND-153在中性pH下就發(fā)出很強(qiáng)的熒光。LysoSensor Yellow/Blue DND-160很特別，具有雙激發(fā)和雙發(fā)射峰，是pH依賴的。在酸性細(xì)胞器中，它主要發(fā)黃色熒光，而在弱酸性細(xì)胞器中，熒光則為藍(lán)色。LysoSensor Yellow/Blue DND-160曾與fluo-3 AM共用，來(lái)同時(shí)測(cè)量兔胃腺中H+ 和Ca2+，以確定類膽堿和cAMP依賴通路激活后胃酸分泌的動(dòng)力學(xué)。除了上面這些傳統(tǒng)的熒光探針，Invitrogen的Organelle Lights?熒光蛋白也是一個(gè)不