生物技術制藥課件.ppt

生物技術制藥BiotechnologicalPharmaceutics 生物工程系徐銳Tel mail 175912981 一 課程內容 第一章緒論第二章基因工程制藥第三章動物細胞工程制藥第四章抗體制藥第五章植物細胞工程制藥第六章酶工程制藥第七章發(fā)酵工程制藥 Chapter1緒論 第一節(jié)生物技術的發(fā)展史 一 生物技術 biotechnology 生物技術 以生命科學為基礎 利用生物體 或生物組織 細胞及其組分 的特性和功能 設計構建具有預期性狀的新物種或新品系 并與工程相結合 利用這樣的新物種 或品系 進行加工生產 為社會提供商品和服務的一個綜合性的技術體系 包括基因工程 細胞工程 發(fā)酵工程 酶工程 生化工程以及后來衍生出來的第二代 第三代的蛋白質工程 抗體工程 糖鏈工程和海洋生物技術等 不可取代性 育種 制藥 快速 精確 單克隆抗體檢測妊娠 低耗 高效 生物酶催化 化學催化 副產物少 副作用小 安全性好 高附加值性 符合生態(tài)型的經濟技術發(fā)展體系 生物技術的優(yōu)越性 現代生物技術的基礎學科和分支 分子生物學微生物學生物化學遺傳學細胞生物學化學工程 現代生物技術 醫(yī)藥生物技術 生物技術疫苗 生物技術診斷 農業(yè)生物技術 家畜生物技術 海洋生物技術 二 生物技術發(fā)展簡史 傳統(tǒng)生物技術的技術特征是釀造技術公元前6000年古代巴比倫人釀造啤酒公元前4000年埃及人發(fā)酵面包我國殷朝制醬周朝制醋特點 自然發(fā)酵 全憑經驗 傳統(tǒng)生物技術階段 近代生物技術的技術特征是微生物發(fā)酵技術1674年荷蘭布商列文虎克自制了高倍顯微鏡 300倍左右 觀察到了微生物 1865年法國科學家巴斯德證明了發(fā)酵原理 1928年英國Fleming發(fā)現青霉素1940年英國弗洛里 錢恩分離出青霉素 近代生物技術階段 近代生物技術時期的特點 1 產品類型多初級 氨基酸 酶 有機酸 次級 抗生素 生物轉化 甾體 等 2 生物技術要求高 純種 無菌 通氣 產品質量要求也高 3 生產設備規(guī)模巨大500立方米 2000立方米 4 技術發(fā)展速度快 青霉素初期發(fā)酵效價為200U ml 現在為80000U ml 現代生物技術的技術特征就是以基因工程為首要標志1953年Watson Crick提出DNA雙螺旋結構1973年建立DNA重組技術 Boyer Cohen 美國 1975年建立單克隆抗體技術 雜交瘤細胞 1978年大腸桿菌表達出胰島素1997年英國克隆多利羊 現代生物技術 現代生物技術包括 重組DNA技術 細胞和原生質體融合技術 酶和細胞的固定化技術 植物脫毒和快速繁殖技術 動物和植物細胞的大量培養(yǎng)技術 動物胚胎工程技術 現代生物反應工程和分離工程技術 蛋白質工程技術 海洋生物技術 現代微生物發(fā)酵技術 不能忘記的人 JDWatsonFHCCrick 1953年4月25日 英國 自然 雜志發(fā)表了沃森和克立克的文章 核酸的分子結構 DNA的一個結構模型 標志著DNA雙螺旋結構的建立 從此 遺傳學和生物學的歷史從細胞階段進入了分子階段 不能忘記的人 FSangerWGilbert Sanger 英國化學家 最早測定胰島素的氨基酸順序獲得1958年諾貝爾化獎 22年后 他因測定了一種噬菌體的一級結構獲1980年的諾貝爾化學獎 Gilbert在DNA測序領域 因其卓越的工作獲得1980年諾貝爾化學獎 不能忘記的人 PaulBerg Berg 美國生物化學家 通過把兩個不同來源的DNA連結在一起并發(fā)揮其應有的生物學功能 證明了完全可以在體外對基因進行操作 他作為 重組DNA技術之父 于1980年獲諾貝爾化獎 不能忘記的人 KaryBMullis 1985年穆利斯發(fā)明了高效復制DNA片段的聚和酶鏈式反應 PCR 技術 利用該技術可從極其微量的樣品中大量生產DNA分子 使基因工程獲得了革命性發(fā)展 第二節(jié)生物技術藥物 生物技術制藥 生物技術藥物 生物藥物 采用現代生物技術 按照人的設想 借助動植物微生物來生產所需的醫(yī)藥品 一般來說 采用DNA重組技術或其他生物新技術研制的蛋白質或核酸類藥物 生物技術藥物 生化藥物 微生物藥物 海洋藥物 生物制品的統(tǒng)稱 生物技術藥物分類 治療性藥物預防藥物診斷藥物 干擾素 生長激素 胰島素 集落刺激因子等 各類疫苗 甲肝疫苗 乙肝疫苗 卡介苗等 免疫診斷試劑 酶診斷試劑 單抗診斷試劑 基因診斷試劑等 生物技術藥物的特性 1 分子結構復雜2 具有種屬特異性3 治療針對性強 療效高4 穩(wěn)定性差5 基因穩(wěn)定性6 免疫原性7 體內的半衰期短8 受體效應9 多效性和網絡性效應10 檢驗的特殊性 第三節(jié)生物技術制藥 一 生物技術制藥的特征 高技術高知識層次的人才和高新的技術手段高投入一個新的生物醫(yī)藥的平均費用為1 3億美元 有的高達6億 長周期新藥開發(fā)周期8 10年 高風險成功率為5 10 研制時間卻需8 10年 高收益利潤率回報可高達10倍 上市后2 3年便可收回投資 生長激素釋放抑制素 別名為生長抑素 施他寧藥理作用 抑制胃酸分泌 顯著減少內臟血流 減少肝臟血流量 適應癥 適用于肝硬化所致的食管靜脈出血 急性胃潰瘍出血 糜爛和出血性胃炎所致的出血等 傳統(tǒng)生產方法 從羊的下丘腦中提取10萬只羊1mg基因工程技術生產 基因工程菌發(fā)酵生產10L大腸桿菌發(fā)酵液1mg低成本 0 3美元 mg多種基因工程藥物在臨床上大顯神威 促紅細胞生成素 EPO 粒細胞集落刺激因子 G CSF 等銷售額超過10億 二 生物技術在制藥中的應用 1 基因工程制藥 1 基因工程藥物品種的開發(fā) 2 基因工程疫苗 3 基因工程抗體 4 基因診斷與基因治療 重組乙肝疫苗 CHO細胞 重組乙肝疫苗 漢遜酵母 5 應用基因工程技術建立新藥的篩選模型 6 應用基因工程技術改良菌種 產生新的微生物藥物 7 利用轉基因動 植物生產蛋白質類藥物人體蛋白AAT 抗胰蛋白酶 10萬美元 g 轉基因羊羊奶中20g L 8 基因工程技術在改進藥物生產工藝中的應用 增加關鍵酶的劑量 提高酶活 抑制非必要表達 集中細胞內資源表達主要產物 克隆血紅蛋白基因 提高菌體呼吸強度 2 細胞工程制藥 1 單克隆抗體技術 2 動物細胞培養(yǎng) 3 植物細胞培養(yǎng)生產次生代謝產物紅豆杉細胞大規(guī)模培養(yǎng)紫杉醇 紅豆杉 紫杉醇結構 3 酶工程制藥4 發(fā)酵工程制藥工藝改進 新藥研制和菌種改造 青霉素?；?三 我國生物技術制藥現狀和發(fā)展前景 開始于20世紀70年代初 先是進行固定化酶的研究 以后固定化酶和固定化細胞的研究與應用得到發(fā)展 70年代后期 開始跟蹤國外基因工程技術的某些基礎性工作 80年代初期 開始乙型肝炎基因工程疫苗 基因工程干擾素的研究 生物技術方面的項目得到了國家的支持 其中 1b型干擾素為我國首創(chuàng) 目前我國生物制藥技術申報貌似 活躍 實際上都是在圍繞僅有的幾個老品種進行改進或改制 完全創(chuàng)新技術很少 與發(fā)達國家相比 我國生物技術實驗室技術差距不大 但在產業(yè)化方面與世界的差距正在逐漸加大 當今世界有20多種暢銷生物藥時 我國能生產10種 而現在世界上有140多種時 我國卻只能生產20多種 由于我國醫(yī)藥生物技術成果缺乏自主知識產權 而目前我國生物制藥公司中技術和產業(yè)發(fā)展比較成熟的也僅有北京天壇生物 深圳康泰生物 深圳科興 長春金賽等少數幾家企業(yè) 產業(yè)規(guī)模較小 而一些傳統(tǒng)型的制藥企業(yè)由于受技術條件等影響而難以迅速進入生物制藥領域 醫(yī)藥生物技術發(fā)展展望 21世紀是醫(yī)藥生物技術快速發(fā)展的時期 生物制藥 化學藥物 中藥形成三足鼎立 有效的為人類健康服務 1 利用新發(fā)現的人類基因開發(fā)新型藥物 人類基因組計劃已完成 1986年美國科學家達爾貝科提出的人類基因組計劃 1990年啟動該計劃 23對染色體30億對堿基 3 5萬個基因進行測序 美國承擔54 英33 日7 法2 8 德2 2 中國1 1999年中國加入人類基因組計劃 投資3億元 負責測定3號染色體3000萬對堿基 2000年4月完成 2 新型疫苗的研制艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等 3 基因工程活性肽的生產基因藥物 淋巴因子 生長因子 激素和酶4 其它醫(yī)藥業(yè)將得到不斷改造和發(fā)展轉基因藥材 利用轉基因的煙草來生產人造血漿將成為現實 5 新型生物反應器和新型生物技術不斷出現 新型生物反應器有 氣升式生物反應器流化床式生物反應器固定床式生物反應器袋式或膜式生物反應器中空纖維生物反應器等 四 我國的醫(yī)藥生物技術 已上市的基因工程藥物和疫苗1995年白細胞介素 21996年 1b 干擾素 2a 干擾素 2b 干擾素1997年粒細胞集落因子紅細胞生成素1992年乙型肝炎疫苗 作業(yè) 1 生物技術制藥的概念 2 生物技術藥物分為哪些類型 3 生物技術制藥有哪些特征 Chapter2基因工程制藥 用途 主要用于癌癥 人類免疫缺陷病毒性疾病 心血管疾病 糖尿病 貧血和許多遺傳疾病的治療 獲取方式 生化提取基因工程表達 成本高產量低質量難以保證 成本低產量高活性強性質優(yōu) 實例 人生長激素 侏儒癥 50具新鮮尸體腦下垂體中提取 采用基因工程從1 2升細菌培養(yǎng)液中提取獲得 1982年世界上第一個基因工程藥物 重組人胰島素獲準生產銷售 至今已有100多個生物技術藥物上市 促紅細胞生成素 EPO 以全球銷售額38億美元的業(yè)績 居全球最暢銷10種藥物的第6名 美國是現代生物技術的發(fā)源地 一直穩(wěn)居生物技術藥物研發(fā)榜首 其2002年產值和銷售額已超過200億美元 1989年我國第一個擁有自主知識產權的基因工程藥物 重組人干擾素 IFN 1b 上市以來 目前 世界上銷售額排前10位的生物技術藥物我國已能生產8種 國際生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展動態(tài) 第一節(jié)概述 生物技術的核心就是基因工程 20世紀70年代基因工程誕生 最先應用在醫(yī)藥科學領域 傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難 價格等因素的影響 此外在制備過程可能受到的病毒 衣原體 支原體等的感染等問題 促使人們尋求安全 實用 療效可靠的新方法來制備生物藥物 如 生長激素抑制素1mg傳統(tǒng)法 10萬只羊的下丘腦 現 10L大腸桿菌培養(yǎng)液 0 3美元 mg 尿激酶從男性尿中提取 胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取 應用基因工程技術可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問題 從量 質上都可以得到改進 且可以創(chuàng)造全新物質 如今 癌癥 病毒性疾病 心血管疾病以及內分泌等方面的預防 治療和診斷已可通過基因工程技術獲得 利用基因工程技術生產藥品的優(yōu)點 1 可以大量生產過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽 如胰島素 干擾素 細胞因子等 為臨床使用提供有效的保障 2 可以提供足夠數量的生理活性物質 以便對其生理 生化和結構進行深入的研究 從而擴大這些物質的應用范圍 3 利用基因工程技術可以發(fā)現 挖掘更多的內源性生理活性物質 4 內源性生理活性物質在作為藥物使用時存在的不足之處 可通過基因工程和蛋白質工程進行改造和去除 如白細胞介素 2的半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸 白細胞介素 2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高 5 利用基因工程技術可獲得新型化合物 擴大藥物篩選來源 利用基因工程技術生產藥品的優(yōu)點 第二節(jié)基因工程藥物生產的過程 基因工程技術是將所要重組對象的目的基因插入載體 拼接 轉入新的宿主細胞 構建成工程菌 或細胞 實現遺傳物質的重新組合 并使目的基因在工程菌 或細胞 內進行復制和表達的技術 基因工程藥物生產的上游和下游 上游階段 主要指的是目的基因分離 工程菌 或細胞 構建 上游階段的工作主要在實驗室內完成 下游階段 主要指的是從工程菌 或細胞 的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產品的分離純化 質量控制等 獲得目的基因 組建重組質粒 培養(yǎng)工程菌 構建基因工程菌或細胞 產物分離純化 除菌過濾 半成品檢定 包裝 成品檢定 基因工程藥物制備的一般過程 基因工程基本過程 切 接 轉 增檢 工程菌 或細胞 構建中重要的工具 工具 酶限制性內切酶連接酶逆轉錄酶Klenow酶大片段 DNA聚合酶I 核酸酶S1DNA擴增酶 第三節(jié)目的基因的獲得 克隆真核基因常用方法 逆轉錄法和化學合成法 不能直接分離 一 逆轉錄法逆轉錄法就是先分離純化目的基因的mRNA 再反轉錄成cDNA 然后進行cDNA的克隆表達 cDNA與模板mRNA序列嚴格互補 而不含內含子 逆轉錄法的步驟1 mRNA的純化2 cDNA第一鏈的合成3 cDNA第二鏈的合成4 cDNA克隆5 將重組體導入宿主細胞6 cDNA文庫的鑒定7 目的cDNA克隆的分離和鑒定 cDNA克隆示意圖 mRNA 逆轉錄酶 ss DNA ds cDNA ds cDNA 核酸酶S1 1 mRNA的純化 真核細胞mRNA3 polyA 20 250 采用OligodT 纖維素 以親和層析法將mRNA從細胞總RNA中分離出來 2 cDNA第一鏈的合成 可用寡聚dT作為引物 在逆轉錄酶的催化下 開始cDNA鏈的合成 3 cDNA第二鏈的合成 除去cDNA mRNA雜交鏈中的mRNA鏈 堿解或RNaseH酶解 然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈 由于第一鏈cDNA鏈3 末端往往形成一個發(fā)夾形結構 所以 可以從這一點開始合成cDNA第二鏈 常用Klenow酶或DNA聚合酶I 切除發(fā)夾結構 核酸酶S1 專一性切除單鏈DNA 4 cDNA克隆 用于cDNA克隆的載體有三類 細菌質粒 如pBR322 pUC等 插入片段10kb動植物病毒根據重組后插入的cDNA能否經轉錄和翻譯合成蛋白質非表達型載體 pBR322及 gt10 表達型載體 pUC及 gt11 有利于目的基因的篩選 5 將重組體導入宿主細胞 1 轉化 指質粒DNA或以它為載體構建的重組DNA導入細菌的過程 2 轉染 指病毒或以它為載體構建的重組子導入真核細胞的過程 脂質體介導 原生質體融合 電穿孔 顯微注射 基因槍 病毒介導 農桿菌轉染 6 cDNA文庫的鑒定 1 表型改變 抗生素抗性 抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變 a互補 報告基因 缺陷恢復 2 結構特征 DNA大小 酶切圖譜 雜交 核酸 蛋白 PCR檢測 DNA序列分析3 免疫化學檢測 表達產物分析 7 目的cDNA克隆的分離和鑒定 從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆 主要采用 1 核酸探針雜交法 根據目的蛋白質的氨基酸序列 人工合成相應的單鏈寡核苷酸作為探針 從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆 2 免疫反應鑒定法 用表達型載體構建的cDNA文庫 可用免疫學方法分組逐一鑒定各cDNA的表達產物 即以某種蛋白質的抗體尋找相應的特異cDNA克隆 分離得到含有目的基因的陽性克隆后 必須對其作進一步的驗證和鑒定 限制酶圖譜 基因測序等 不需合成第二鏈 mRNA 逆轉錄酶 ss DNA PCR 特異引物 目的cDNA鏈 1985 PCR發(fā)明以后 RT PCR得到了廣泛的應用 二 逆轉錄 聚合酶鏈反應法 RT PCR 三 化學合成法較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成 必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質的氨基酸順序 人工化學合成的限制 一不能合成太長的基因 50 60bp 二是人工合成時 遺傳密碼的簡并性可導致中性突變 三是費用較高 第四節(jié)基因表達 基因表達 是指結構基因在生物體中的轉錄 翻譯以及所有加工過程 基因高效表達 將外源基因片段拼接到另一個基因表達體系中 使即獲得原生物活性又可高產的表達產物 最佳的基因表達體系 生物活性高 表達產量高 表達產物穩(wěn)定 表達產物容易分離純化 一 宿主細胞的選擇 1 培養(yǎng)容易 生長快速 2 容易獲得較高濃度的細胞 3 能利用易得廉價原料 4 不致病 不產生內毒素 5 發(fā)熱量低 需氧低 適當的發(fā)酵溫度 6 容易進行DNA重組技術操作 7 產物的產量 產率高 8 產物容易提取純化 宿主細胞常用兩大類 原核細胞 常用有大腸桿菌 枯草芽胞桿菌 鏈霉菌等 真核細胞 常用有酵母 絲狀真菌 哺乳動物細胞等 原核細胞 大腸桿菌 基因工程研究中采用最多的原核表達體系 優(yōu)點 生長快速 代謝簡單 遺傳體系清楚 容易操作 細胞破碎容易 缺點 不存在導向內質網的信號序列 分泌能力不足 產品多為胞內產物 活性偏低 提取困難 蛋白表達后不能修飾加工 糖基化等 產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基 能引起免疫反應 內毒素存留 枯草芽孢桿菌 分泌能力強 蛋白質不形成包含體 產物蛋白質不能糖基化 有很強的胞外蛋白酶對產物降解 鏈霉菌 作為外源性基因表達受到重視 不致病 使用安全 分泌能力強 表達產物可糖基化 真核細胞 酵母是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物 其基因組小 世代時間短 有單倍體雙倍體兩種形式 繁殖迅速 無毒性 能外分泌 產物可糖基化 已有不少真核基因成功表達 絲狀真菌優(yōu)點 分泌能力強 能正確進行翻譯后加工 肽剪切 糖基化 有成熟的發(fā)酵和后處理工藝 哺乳動物細胞優(yōu)點 表達產物可由重組轉化細胞分泌到培養(yǎng)液中 純化容易 產物是糖基化的接近天然物 缺點 生長慢 生產率低 培養(yǎng)條件苛刻 費用高 培養(yǎng)液濃度稀 二 大腸桿菌體系中的基因表達 一 表達載體表達載體必須具備的條件 1 載體能獨立地進行復制 復制起點 ori 2 應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記 以利于外源基因的克隆 鑒定和篩選 且克隆位點位于啟動子序列后 以便外源基因表達 3 應具有很強的啟動子 能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別 4 應具有阻遏子 使啟動子受到控制 只有當誘導時才進行轉錄 外源基因的高效表達往往會抑制宿主細胞的生長 增殖 而阻遏子可使宿主細胞免除此不良影響 5 應具有很強的終止子 以便使RNA聚合酶集中力量轉錄克隆的外源基因 而不轉錄其他無關的基因 同時 很強的終止子所產生的mRNA較為穩(wěn)定 6 所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號 即起始密碼AUG和SD序列 以便轉錄后能順利翻譯 如 在大腸桿菌中表達非融合蛋白的操縱子必須改建成 細菌啟動子 細菌SD序列 起始密碼子 結構基因 終止子 常用表達載體pBV220系統(tǒng) 啟動子 多克隆位點 終止子 阻遏子 P23 復制起始位點 它已成功地表達了人白細胞介素2 干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因 氨芐青霉素抗性基因 限制性內切酶 SD序列 pBV220系統(tǒng)國內使用最多的載體 其組成 來源于pUC8多克隆位點 核糖體rrnB基因終止信號 pBR322第4225 3735位 pUC18第2066 680位 噬菌體cIts857阻遏子基因及PR啟動子 pRC23的PL啟動子及SD序列 pBV220系統(tǒng)優(yōu)點 cIts857阻遏子基因與PL啟動子同在一個載體上 可以轉化任何菌株 以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞 使表達產物不易降解 SD序列緊跟多克隆位點 便于插入帶起始ATG的外源基因 可表達非融合蛋白 強的轉錄終止信號可防止出現 通讀 現象 有利于質粒 宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定 整個質粒僅為3 66kb 有利于增加其拷貝數及容量 可以插入大片段外源基因 PR和PL啟動子串聯 可以增強啟動作用 本系統(tǒng)為溫度誘導 外源基因表達量可達細胞總蛋白的20 30 產物以包含體形式存在不易降解均一性好 PR和PL啟動子 選用溫度敏感突變體cIts857的基因產物來調控PL PR啟動子的轉錄 在較低溫度 30 時以活性形式存在在較高溫度 42 時失活脫落 PL PR cIts857 PL和PR表達系統(tǒng)存在的問題PL和PR表達系統(tǒng)誘導時不加化學誘導劑 成本又低廉 缺陷1 在熱脈沖誘導過程中 大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活 其中一些是蛋白水解酶 有可能降解所表達的重組蛋白 2 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時 通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30 提高到42 需要較長的時間 這種緩慢的升溫方式影響誘導效果 對重組蛋白表達量有一定的影響 3 pBV220系統(tǒng)表達的外源蛋白以包含體的形式存在 不易純化 pBG 2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產物純化的融合表達載體 該質粒在PRPL啟動子下游插入G蛋白中與IgGFc段結合的結構域基因片段180個核苷酸 下游是多克隆位點 引入了剪切融合蛋白的切點 具有與IgG結合的活性 可用親和層析 簡化下游工藝 pBG 2 2 pET系統(tǒng)pET系統(tǒng)被認為使最有潛力的系統(tǒng)之一插入基因的轉錄和翻譯系統(tǒng)來源于T7噬菌體表達由位于宿主細胞染色體上的T7 RNA聚合酶控制克隆宿主可用大腸桿菌K12的HB101 JM103等表達宿主為BL21 DE3 在LB或M9培養(yǎng)基中生長 IPTG或乳糖誘導外源基因表達量大 50 表達質粒pET 32a 優(yōu)點 是原核蛋白表達應用最多的系統(tǒng) 在任何大腸桿菌表達系統(tǒng)中 基礎表達水平最低 真正的調節(jié)表達水平的 變阻器 控制 提供各種不同融合標簽和表達系統(tǒng)配置 可溶性蛋白生產 二硫鍵形成 蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌 以FusionProtein的形式表達藥物基因許多蛋白質藥物與原核生物的蛋白質融合后 能保留原有的免疫原性 一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白 其免疫原性能得到加強 用這種融合蛋白免疫動物所制備的抗體 能夠用于檢測原來的多肽藥物 也可用于藥代動力學研究 藥物受體研究以及藥物產品的檢測 有些情況下 采用融合蛋白的形式表達外源基因是不得以而為之 一些多肽藥物在原核細胞中不穩(wěn)定 難以獲得高表達 這些蛋白與菌體蛋白融合后得到穩(wěn)定 但融合蛋白需經過后處理才能釋放出有活性的外源多肽 多肽藥物的純化通常較為困難 但與特定的原核蛋白融合后 不僅能穩(wěn)定所表達的產物 還能用識別蛋白的配體進行親和層析純化 如GST 融合基因 所產生的融合蛋白可用谷胱甘肽親和柱一次性純化 二 影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素 外源基因表達產量與細胞濃度和單個細胞平均表達產量呈正相關 單個細胞產量取決于 外源基因的拷貝數質粒的拷貝數直接關系到外源基因的拷貝數 拷貝數增加 表達量增加 外源基因的表達效率外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理啟動子終止子核糖體結合位點密碼子 轉錄 翻譯 啟動子和終止子的強弱 大腸桿菌高效表達需要強的啟動子和終止子 外源基因在強啟動子的控制下表達 容易發(fā)生轉錄過頭現象 即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉錄質粒上鄰近的DNA序列 形成長短不一的mRNA混合物過長轉錄物的產生在很大程度上會影響外源基因的表達 對于一些終止作用較弱的終止子 通常可以采用二聚體終止子串聯的特殊結構 以增強其轉錄終止作用 常見的強啟動子 Lac trp tac PL T7 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率 而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關 mRNA翻譯的起始效率主要由其5 端的結構序列 消除二級結構 所決定 稱為核糖體結合位點 RBS 核糖體結合位點的有效性 SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后 翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中的P位 這是翻譯啟動的前提條件 在很多情況下 SD序列位于AUG之前大約七個堿基處 在此間隔中少一個堿基或多一個堿基 均會導致翻譯起始效率不同程度的降低 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性 因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇 一般而言 有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達 外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因 密碼子組成 生物體對密碼子的偏愛性 表達產物的穩(wěn)定性 組建融合蛋白 利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽 采用位點突變的方法 選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞 可能會減弱表達產物的降解 細胞代謝負荷 宿主細胞的生長與重組質粒的復制分開 細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段 工程菌的培養(yǎng)條件除宿主 載體和克隆基因三者之間的關系影響外源基因的高水平表達外 培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素 三 真核基因在大腸桿菌中的表達形式 以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白 優(yōu)點 操作簡便 表達蛋白在菌體內穩(wěn)定 易實現高效表達 缺點 只能作抗原用 以非融合蛋白的形式表達藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始 在其氨基端不含細菌多肽序列 優(yōu)點 保持原有蛋白活性 缺點 易被蛋白酶破壞 分泌型表達蛋白藥物基因優(yōu)點 在周質中穩(wěn)定 有活性 不含蛋氨酸殘基 缺點 產量不高 信號肽不被切割 三 酵母中的基因表達 一 表達載體酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細胞內保存和復制 并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的DNA或RNA單位 1 載體的復制序列 酵母附加體質粒 yeastepisomalplasmid Yep類 酵母復制型質粒 yeastreplicationplasmid Yrp類 酵母著絲粒質粒 yeastcentromericplasmid YCp類 酵母整合型質粒 yeastinteegrativeplasmid YIp類 1 克隆載體從大腸桿菌中制備質粒比從酵母中容易得多 因此酵母質粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的 只有在最后階段才轉入酵母中 這就要求酵母載體也同時具有在大腸桿菌中復制和增殖的能力 2 表達載體將酵母菌的啟動子和終止子等有關控制序列引入載體的適當位點后 就構成了酵母菌的表達載體 普通表達載體 只能方便地引入外源基因并進行表達 對表達產物的組成 特別是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴格要求 精確表達載體 要求在啟動子或信號肽編碼序列的適當部位有內切酶點 以利于接入外源基因 并使他在表達后加工后N末端氨基酸序列與天然產物相同 既無多余的氨基酸 也無缺失的氨基酸 影響目的基因在酵母菌中表達的因素 外源基因的劑量高穩(wěn)定的高拷貝數的質?？墒雇庠椿蚋咝П磉_ 但高拷貝數通常會引起細胞生長量的降低 而單拷貝數的質粒對細胞的最大生長沒有影響 因而也能達到高效表達 外源基因的表達效率 啟動子 組成型和誘導型 分泌信號的效率 終止序列的影響 外源基因表達產量與細胞濃度和單個細胞平均表達產量呈正相關 單個細胞產量取決于 外源蛋白的糖基化外源蛋白經釀酒酵母糖基化后 可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中 某些蛋白質糖基化后更加穩(wěn)定 便于分離精制 宿主菌株的影響 菌體生長力強 菌體內源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定常用的幾乎是突變株 避免使用回復突變率高的不穩(wěn)定體系 最好使用二倍體或多倍體菌株 分泌能力強 5 培養(yǎng)條件 四 動物中的基因表達 優(yōu)點 產物類似于天然產物 容易分離純化缺點 動物細胞生長慢 培養(yǎng)條件苛刻 費用高培養(yǎng)液濃度較小 主要基因工程表達體系比較 第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點 菌體的生長通常用比生長速率來表示 比生長速率 菌體生長速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比 工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源 控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長 控制菌體的生長對提高質粒的穩(wěn)定性 減少代謝副產物積累 提高外源蛋白產率有重要意義 大腸桿菌的蛋白 菌體量的比值是基本恒定的 因而菌體的生長速度反映了蛋白質的合成速度 培養(yǎng)條件的改變 都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應 影響生物大分子的和成和菌體的生長 一 菌體的生長與能量的關系 碳源物質是組成培養(yǎng)基的主要成分 碳源物質為細胞提供能量 當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時 菌體會產生乙酸 導致培養(yǎng)基的pH值下降 從而影響菌體的生長 適當提高pH 可減少乙酸的抑制作用 分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源 連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內控制菌體的生長 從而控制乙酸的產生 減少它的抑制作用 加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產生 大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的透明顫菌血紅蛋白 VHB蛋白 的基因可提高菌體生長速率 采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷毎?阻止乙酰輔酶A乙酸產生 可提高產量 二 菌體生長與前體供應的關系 在基礎培養(yǎng)基中加入氨基酸 小分子前體 能使菌體蛋白合成增加 比生長率提高 基因工程菌質粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結構 致工程菌生長速率降低 質粒存在對菌體代謝的影響 中等拷貝質粒 56拷貝 的工程菌中與前體合成有關的酶增加 其質粒對工程菌的生長影響不大 高拷貝質粒的工程菌 240拷貝 生長速率和菌體總蛋白合成均減少 這與工程菌大量前體被利用引起前體不足 從而產生 嚴緊反應 有關 嚴緊反應當細菌發(fā)現它們處于很差的生長環(huán)境 沒有足夠的氨基酸來維持蛋白質合成時 它們就會停止大部分活動 這種現象稱為嚴緊反應 嚴緊反應產生兩種非正常的核酸堆積物 即ppGpp和pppGpp 統(tǒng)稱 P PPGPP 嚴緊反應機制 產生鳥苷四磷酸鳥苷五磷酸 激活核糖體RelA蛋白 嚴緊因子 抑制rRNA基因表達 核糖體與mRNA結合抑制其翻譯 氨基酸饑餓 GTPATP p ppGpp的產生機制 應急因子RelA是一種 p ppGpp合成酶 約與5 的核糖體結合在一起 當核糖體A位被空載tRNA占據時 RelA被激活 一個空載tRNA進入A位就生成一個 p ppGpp p ppGpp的作用 應急應答使得rRNA和tRNA的合成量大幅減少 10 20 一些mRNA的合成也減少 1 3 蛋白質的降解速率增加 許多代謝調節(jié)作用開始發(fā)生 基因工程菌的不穩(wěn)定性主要表現在重組質粒的不穩(wěn)定性 這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現形式 一 質粒的不穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定 指工程菌分裂時出現一定比例不含質粒子代菌的現象 結構不穩(wěn)定 指外源基因從質粒上丟失或堿基重排 缺失所致工程菌性能的改變 第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性 影響質粒分裂不穩(wěn)定的因素 含質粒菌產生不含質粒子代菌的頻率 這兩種菌比生長速度率差異的大小 質粒穩(wěn)定性的分析方法 樣品 不含抗性標記抗生素平板培養(yǎng)基 10 12h 100個菌落 含抗性標記抗生素平板培養(yǎng)基 10 12h 統(tǒng)計生長菌落數 重復三次 計算比值 穩(wěn)定性stability 二 提高質粒穩(wěn)定性的方法 1 選擇合適的宿主菌受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解2 選擇合適的載體低拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率高 增加工程菌質粒拷貝數可提高穩(wěn)定性 高拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率低 但如果提高質?？截悢?可能抑制菌體生長 對穩(wěn)定性不利 3 施加選擇壓力根據載體上的抗藥性標記 向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素藥物和食品生產時禁止使用抗生素加入大量的抗生素會使生產成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素 只能維持一定時間添加抗生素選擇壓力對質粒結構不穩(wěn)定無能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標記 向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復雜 成本較高 4 分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達造成質粒不穩(wěn)定時 可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制 在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài) 避免因表達造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生 在獲得需要的菌體密度后 再去阻遏或誘導外源基因表達 連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng) 如在第一級進行生長 維持菌體的穩(wěn)定性 在第二級進行表達 5 控制培養(yǎng)條件工程菌的培養(yǎng)條件對其質粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大可調控的環(huán)境參數為 培養(yǎng)基組分 培養(yǎng)溫度 pH和溶解氧濃度 有些含質粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質粒的菌反應慢 因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率 從而改善質粒的穩(wěn)定性 通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質粒的穩(wěn)定性 培養(yǎng)基組成 限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質粒的穩(wěn)定 6 固定化固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進行固定化后 質粒的穩(wěn)定性及目的產物的表達率都有了很大提高 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素 氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質粒的手段 往往在大規(guī)模生產中難以應用 而采用固定化方法后 這種選擇壓力則可被省去 不同的宿主菌及質粒在固定化系統(tǒng)中均表現出良好的穩(wěn)定性 中試是上游技術與工業(yè)化生產的連接環(huán)節(jié) 其目的在于考察一個上游構建成功的重組菌種是否適合未來的產業(yè)化 另外 通過中試還可以獲得大量的產品供臨床試驗 同時中試所得的相關培養(yǎng) 發(fā)酵 純化等工藝參數可以做為生產設計時的參考 第七節(jié)基因工程菌的中試 中試應考慮的問題 工程菌是否適宜商品化發(fā)酵反應器設計反應過程選擇發(fā)酵培養(yǎng)條件生產工藝最佳方法優(yōu)化工藝監(jiān)測方法工藝控制方法工藝自動化使用方法生物催化劑使用方法 如果有的話 產品提取方法分離精制技術等 一 工程菌選擇 用于中試的工程菌需具備的條件 1 能用一般基因重組技術獲得2 有高產潛力3 能以工業(yè)原料為培養(yǎng)基 主要是碳源4 生產工藝不復雜 能一般化5 能產生和分泌蛋白質 細胞外分泌 6 不致病 無毒性7 能安全生產 符合國家衛(wèi)生部門規(guī)定8 代謝可控性 產品有特異性9 發(fā)酵液粘度小等 二 反應器 發(fā)酵罐 設計符合生物反應和化學工程需要 設計基礎 5種生物數據 培養(yǎng)細胞系特性 細胞生長率 發(fā)酵罐消毒方法 溫度pH溶氧二氧化碳及代謝產物 后處理效果 設計中應考慮的問題 根據實驗條件需要 能連續(xù)發(fā)酵 也可分批發(fā)酵 并附有加料管取料管及測量儀表 易安裝及移動 儀表所得數據可靠 數據重復性好 可任意安裝附件 罐體材質好并打光 避免殘渣積存 三 發(fā)酵培養(yǎng)基組成 1 化學元素 細胞生長必需的碳 氮 氧 氫 磷及一些微量元素和金屬離子 2 特殊營養(yǎng)源 氨基酸 維生素等 3 能源 葡萄糖等 4 代謝控制物 生物活性物質 或者改變溫度 pH值 誘導菌種改變生長速度或代謝途徑等 目的為增加產量 注意 工業(yè)化生產用培養(yǎng)基以工業(yè)原料為主 以降低生產成本 所以中試時就要進行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件探索 四 工藝最佳化與參數監(jiān)測控制1 工藝最佳化 指最快周期 最高產量 最好質量 最低能耗 最大安全性 最周全的廢物處理效果 最佳化速度 最低失敗率等 只有在掌握菌種生物特性和發(fā)酵工藝參數了如指掌 才能設計出最佳生產工藝 2 參數監(jiān)測控制 四種需要監(jiān)測的參數主要參數 pH 溫度 溶氧 二氧化碳生物量 渾濁度 細胞組分 總氮量及菌絲干重 碳源 糖 有機酸 乙醇 淀粉 脂質產品 形成時間 形式 性狀等全自動化控制 五 計算機的應用 全自動化控制的基礎熱電耦電極 溫度離子敏感電極 離子pH電極 pH氧化還原電極 還原電位熱量計 熱平衡可以儲存于計算機 通過計算機計算 對比 優(yōu)化選擇 提高產品產量與質量 降低原材料與能源消耗 降低成本 最終模擬出一個高產 高質 低成本生產工藝最佳化的控制微生物數學公式并實際運用 培養(yǎng)工藝是發(fā)酵工藝的重要組成部分 對外源蛋白的表達至關重要 直接影響產品的產量和質量 從而影響產品成本及市場競爭力 最佳的培養(yǎng)工藝還要考慮對純化工藝的影響 第八節(jié)基因工程菌的培養(yǎng) 一 基因工程菌的培養(yǎng)方式 1 分批培養(yǎng) 培養(yǎng)基的量一次性加入 產品一次性收獲 分批培養(yǎng)操作簡單 但因不能控制生長 獲得的菌體密度也有限 2 補料分批培養(yǎng) 在一次投料發(fā)酵的基礎上 流加一定量的營養(yǎng) 使細胞進一步的生長 可得到更多的代謝產物 3 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地流加營養(yǎng) 并不斷地取出發(fā)酵液 連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學特性和穩(wěn)定性等研究 4 透析培養(yǎng) 5 固定化培養(yǎng) 補料分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng) 經過一段時間 間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基 使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法 在分批培養(yǎng)中 為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境 延長其生長對數期 獲得高密度菌體 通常把溶氧控制和流加補料措施結合起來 根據基因工程菌的生長規(guī)律來調節(jié)補料的流加速率 基因工程菌培養(yǎng)方式 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中 攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后 開動進料和出料蠕動泵 以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng) 但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性 連續(xù)培養(yǎng)比較困難 為了解決這一問題 人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開 進行兩階段連續(xù)培養(yǎng) 基因工程菌培養(yǎng)方式 透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離 其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產物來解除其對生產菌的不利影響 基因工程菌培養(yǎng)方式 發(fā)酵液 透析過的發(fā)酵液 透析膜 乙酸 養(yǎng)分 代謝產物 固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質粒的穩(wěn)定性 有人將固定化技術應用到這一領域 發(fā)現基因工程菌經固定化后 質粒的穩(wěn)定性大大提高 便于進行連續(xù)培養(yǎng) 特別是對分泌型菌更為有利 由于這一優(yōu)點 基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展 基因工程菌的培養(yǎng)方式 二 培養(yǎng)工藝因素 1 培養(yǎng)基 C源的使用是關鍵2 接種量 一般采用大接種量 10 15 3 溫度 溫度高引發(fā)熱休克效應 形成包涵體4 溶解氧 高水平轉錄和翻譯需大量能量5 誘導時機 對數期后期 OD600 2 5 6 誘導程序 短時升溫防止熱休克蛋白過量產生7 pH 大腸桿菌生長期6 8 7 4 蛋白表達期6 0 6 5 三 基因工程菌的培養(yǎng)設備 基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產物 由于這類物質是相對獨立于細胞染色體之外的重組質粒上的外源基因所合成的 細胞并不需要的蛋白質 因此 培養(yǎng)設備以及設備控制應滿足獲得高濃度的受體細胞和高效的表達基因產物 發(fā)酵罐的組成部分有 發(fā)酵罐體保證高傳質作用的攪拌器 精細的溫度控制和滅菌系統(tǒng) 空氣無菌過濾裝置殘留氣體處理裝置參數測量與控制系統(tǒng) 如pH O2 CO2等 培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等 基因工程菌的培養(yǎng)設備 基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中要求環(huán)境條件恒定 不影響其遺傳特性 更不能引起所帶質粒丟失 對發(fā)酵罐有特殊要求如要提供菌體生長的最適條件培養(yǎng)過程不得污染保證純菌培養(yǎng)培養(yǎng)及消毒過程中不得游離出異物 干擾細菌代謝活動 基因工程菌的培養(yǎng)設備 1 發(fā)酵罐的結構材料的穩(wěn)定性要好 一般要應用不銹鋼制成2 罐體表面光滑易清洗 滅菌時沒有死角3 所有的連接接口均要用密封圈封閉 不留 死腔 不得有泄漏4 發(fā)酵罐的排氣口須有蒸汽滅菌或微孔濾器除菌后才將廢氣放出 5 攪拌器轉速和通氣應適當6 與發(fā)酵罐連接的閥門要用膜式閥 不用球形閥7 空氣過濾系統(tǒng)要采用活性碳和玻璃纖維棉材料8 培養(yǎng)液要經化學處理或熱處理后才可排放9 軸封可采用磁力攪拌或雙端面密封 基因工程菌的培養(yǎng)設備 第十節(jié)基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物大部分為多肽或蛋白質 其分離 純化非常重要 特點 目的產物在初始物料中含量較低 含有大量細胞及代謝產物 表達產物穩(wěn)定性差 易失活變性 表達產物的種類繁多 結構不一 成品要求純度高 無菌 無熱原 一 建立分離純化工藝的依據 含目的產物的起始物料的特點基因工程菌的發(fā)酵產物其上游過程的各種因素對分離 純化工藝有影響 包括 菌種的類型及其代謝特性 原材料和培養(yǎng)基的來源及其質量 生產工藝及條件 初始物料的物理 化學 生物學性質 物料中雜質的種類和性質 目的產物特性 產品質量的要求 二 分離純化的基本過程 發(fā)酵液細胞分離胞內產物胞外產物細胞破碎固液分離可溶性蛋白包含體細胞碎片分離變性復性 濃縮初步分離高度純化制劑產品 三 分離純化的技術 分離純化的技術要求 技術條件溫和能保持產物生物活性 選擇性好 能從復雜的混合物中有效的將目的產物分離 達到較高的純化倍數 收率高 成本低 兩個技術間能直接銜接 不需要對物料加以處理 純化過程要快 滿足高生產率的要求 細胞破碎與固液分離 細胞收集 離心法 生物膜分離法 細胞破碎 是否加外力 機械破碎法 非機械破碎法 所用方法屬性 物理法 化學法 生物法 固液分離 高速離心 膜過濾 雙相萃取 目的產物含有大量雜質必須進行分離純化 蛋白質分離純化方法的設計根據其分子的理化性質和生物學特性來決定 五 重組蛋白的分離純化 產物特性作用等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質疏水性與疏水 反相介質結合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時間 產物的特性 分離純化方法 層析 chromatography A離子交換層析B疏水層析C親和層析D凝膠過濾層析 A離子交換層析離子交換層析的基本原理離子交換介質的基本性質離子交換介質的選擇原則 外源基因表達產物的分離純化方法 離子交換層析的基本原理 離子交換層析是以離子交換劑為固定相 以特定的含離子溶液為流動相 利用離子交換劑對待分離的各種離子結合力的差異 而將混合物中不同離子進行分離的層析技術 離子交換劑 通常是一種不溶性高分子化合物如纖維素 葡聚糖 瓊脂糖等 離子交換劑中所含的可解離基團在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用 離子交換劑 陽離子交換劑 強酸型和弱酸型可電離的基團磺酸基 SO3H 磷酸基 PO3H2 羧酸基 COOH 酚羥基 OH 陰離子交換劑 強堿型和弱堿型可電離的基團伯胺基 NH2 仲胺基 NHCH3 叔胺基 N CH3 2 季胺基 N CH3 3 離子交換劑的分類 常用的離子交換劑離子交換纖維素 離子交換纖維素是攜帶功能基團纖維素衍生物 具有松散的親水性網狀結構以及較大的表面積 大分子可以自由通過 因而對生物大分子 如蛋白質 的交換容量比離子交換樹脂大 陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素 CM纖維素 等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素 DEAE纖維素 常用的離子交換劑離子交換葡聚糖 離子交換葡聚糖是葡聚糖經環(huán)氧氯丙烷交聯后形成的具有多孔三維空間網狀結構和離子交換功能基團的多糖衍生物 SephadexG 常用的離子交換葡聚糖包括 陽離子交換劑CM SephadexC 25CM SephadexC 50陰離子交換劑DEAE SephadexA 25DEAE SephadexA 50 常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團的SepharoseCL 6BDEAE Sepharose 陰離子型 和CM Sepharose 陽離子型 的離子交換介質具有硬度大 性質穩(wěn)定 流速好 分離能力強等優(yōu)點 離子交換介質的選擇原則一般而言 酸性物質用陰離子交換劑分離堿性物質用陽離子交換劑分離氨基酸 核苷酸 蛋白質等兩性電解質 可根據其pI值及離子化曲線來選擇 離子交換介質的選擇原則 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH 蛋白質凈電荷 等電點 吸附陰離子交換劑 吸附陽離子交換劑 pHpI 對pI 5的某酸性蛋白質當pH5 5 9 0的范圍內時 蛋白質為陰離子 應首選DEAE纖維素 當pH3 5 4 5的范圍內時 蛋白質為陽離子 應首選CM纖維素 B疏水層析 疏水層析 HIC 是根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法 疏水性弱的物質 在較高離子強度的溶液時被洗脫下來 當離子強度降低時 疏水性強的物質才隨后被洗脫下來 疏水配基 烷基鏈配基 芳基配基 高分子配基 疏水基質 應用最廣泛 良好的生物相容性和化學穩(wěn)定性 基本操作 平衡Equilibration上樣Sampleapplication洗雜Washing洗脫Elution C親和層析親和層析的原理親和層析載體的性質與選擇親和層析配基的性質與選擇 親和層析的原理親和層析 利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附 如抗體與抗原 受體與激素 酶與底物之間的作用 配基 在親和層析中起可逆性結合的特異性物質 載體 與配基結合的支撐物 親和層析的特點 1 純化過程簡單 迅速 且分離效率高 2 特別適用于分離純化一些含量低 穩(wěn)定性差的生物大分子 3 純化倍數大 產物純度高 4 必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件 因此應用范圍受到一定的限制 常用的親和層析載體纖維素葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體 親和層析配基的選擇 純化對象和配基之間必須有較強的親和力 但親和力太高也是有害的 因為在解離配基復合物時所需的條件就要強烈 這樣可