蛋白含量測定及western步驟.doc

蛋白的提取和定量肺組織用預(yù)冷1TBS洗凈后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,決定未來的蛋白濃度和蛋白液體積）,50-60mg肺組織砸碎放入1.5ml離心管，冰上孵育1h，10000轉(zhuǎn)4離心10min，轉(zhuǎn)上清至新管。裂解液分裝后保存于-70蛋白質(zhì)定量：BCA蛋白測定法根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50：1）配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BCA試劑盒中，BSA原濃度2mg/mL),稀釋到1mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0，2，5，10，15，20，25 ul標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液補足到25.1234567BCA( ul)2002002002002002002001mg/mLBSA02510152025ddH2O252320151050加樣品2uL加到96孔板的樣品孔中，加蒸餾水23微升。各孔加入200微升BCA工作液，37oC放置30分鐘。同時打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。注：也可以室溫放置2小時，或60oC放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適量在較高溫度孵育，或延長孵育時間。測定A570的波長，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。計算調(diào)蛋白時所需TBS和RSB的體積（調(diào)所有樣品濃度至3-5ug/ul）：總體積=蛋白體積*蛋白濃度/3（ul）RSB=1/5*總體積（ul）TBS=總體積-RSB-蛋白體積（ul）先加RSB（對蛋白有保護(hù)作用），后加TBS。最后放于-70保存。Western BlotSDS-PAGE1. 玻璃板：注意對齊、夾緊，防止漏出，短板朝前。2. 按下表配制分離膠，濃縮膠。膠濃度ddH2O凝膠儲備液Gel buffer10%SDS10%APSTEMED濃縮膠4%(5ml)3.05 ml0.65 ml1.25 ml50 ul25 ul10 ul分離膠10%（10ml）4.1 ml3.3 ml2.5 ml100 ul50 ul10 ul3. 灌膠：將配好的凝膠溶液沿玻璃板長面灌入，為方便可將玻璃板向后傾斜，灌至距綠線1cm左右，用dd水封頂，放置3040min。狀況好時往往能觀察到水與膠的界限。4. 分離膠凝固后，配制濃縮膠。將水倒掉，灌好濃縮膠，立刻插入梳子，等待40min。在此期間，打開水浴鍋（100）注：此步后可停止，將膠連同梳子放入4保存一夜，若保存時間較長，為防止水分流失，可加蓋濕潤的濾紙和保鮮膜。5電泳前準(zhǔn)備好：待測蛋白、Marker、1running buffer。蛋白在沸水中煮35min。（第二次后不用煮沸）6拔梳子，立即用1running buffer沖洗孔道（用塑料吸管）。7將玻璃板取出，固定于電泳槽（短面沖里相對），也要牢固，可先將電泳液倒入兩玻璃板槽間觀察是否滲漏。注：標(biāo)記號1、2板及左右。8固定好后，加樣。 跑道號碼 加入物質(zhì)及體積 1 3.5ul Marker (thermo #26616) 2-10 10ul Sample 9玻璃電泳槽倒?jié)M1running buffer，電泳液沒過電泳槽中的鋼絲即可，注意標(biāo)記好帶的順序。10. 電極 黑對黑紅對紅，電壓100V 電泳11.5h，等藍(lán)色條帶跑出后再等待1015min。藍(lán)帶對應(yīng)8KD蛋白，根據(jù)蛋白樣品分子量決定具體的電泳時間，確保不讓目標(biāo)蛋白拋出凝膠。一般可等藍(lán)帶完全跑出凝膠后10多分鐘停止電泳。Western-ECL一、轉(zhuǎn)膜1. 玻璃板取出，用蹺膠片打開，標(biāo)記好切膠位置，將濃縮膠和分離膠上的空白切掉。切膠時不要劃，要切。注意，在右上角切口標(biāo)記，量膠的長、寬。2. 將切好的膠（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃動使膠脫離下來，放上搖床，中速30min。3. 根據(jù)膠的長寬剪濾紙和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角與膠一樣切口。濾紙不能太大，膜可以大一點。PVDF膜甲醇激活，transbuffer搖床10min。將濾紙浸入Transbuffer。（Transbuffer不倒掉）4. 轉(zhuǎn)膜裝置: 濾紙可以采用學(xué)校的大張濾紙剪裁，四層疊在一起使用 三明治由低層向高層為：四層濾紙膜膠四層濾紙，大小要一致 濾紙、膜、膠都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER 100伏轉(zhuǎn)印60分鐘。 如果轉(zhuǎn)膜結(jié)束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗，晾干，保鮮膜包好后置四度保存。再用之前，甲醇激活，再用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗。即可封閉二、雜交1. 將10*TBS稀釋至1*（100ml1000ml），加入1ml Tween 20（0.1），即TBST。（Tween較粘稠，把槍頭剪掉一塊。）2配封閉液，脫脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足夠（2.5g脫脂奶粉，TBST50ml。）3. 將PVDF膜用PBST洗一下，根據(jù)Marker分子量切帶（在右上角切口標(biāo)記,一定要在平的地方切）。* 若此時停止當(dāng)日試驗，可將NC膜放在保鮮膜上晾干，包好放入冰箱4。待使用時，用PBST洗一下，放入封閉液。4正面朝上放入脫脂奶粉中封閉1h，放在搖床上。配雜交液：用小瓶稱0.2g BSA，用量筒加入PBST20ml。5雜交完畢后，用TBST略洗一下膜，加入雜交液將小條沒過（3ml即可，可視情況而定）6加入一抗，搖床2h。過夜。7取出膜，用洗膜液洗3次，515min次。計算雜交液體積，若不足再配。8. 洗完三次膜加入二抗，搖床1h9. 用洗膜液洗3次，515min次。三、發(fā)光反應(yīng)準(zhǔn)備：發(fā)光板、濾紙、小鑷子、1000l加樣器、發(fā)光液1，2（按1：1的量混合先白瓶后黑瓶，混勻，注意換槍頭）EP管。 顯影：將洗完的PVDF膜放入PBST保持膜濕潤，排好條帶，記住順序，用濾紙略吸水，放在發(fā)光板上，滴加顯影液，用槍頭滴在PVDF膜上，等2030s，發(fā)光。存盤。發(fā)光后，如要回收條帶，收回后蒸餾水洗凈，加入一抗二抗清除液，沒過條帶，搖床10min,蒸餾水漂洗5min,三次。洗凈晾干回收。下次再用繼續(xù)封閉。備注：1. 10TBS 0.2M Tris base (FW121.14) 12.114g1.5M Nacl (FW58.44) 43.83g H2O to 500ml PH=7.27.4 with HCLTBST 1 TWEEN20 TO 0.05 1L 100ml 10 and 500ul TWEEN202. RIPA buffer 100ml 可訂購 Tris 0.607g 溶于90ml水，HCl調(diào)PH=7.5，補足到100ml NaCl 0.8766gNP40 1ml，脫氧膽酸 0.5g， SDS 0.1g，用時按1：1000加入PMSF每10ml放入一片PhosSTOP3. PMSF貯備液配置0.1M儲存液，分子量174.190.0174g溶于為1ml無水乙醇（或異丙醇），-20攝氏度保存，用時1：1000稀釋；4. 5*RSB 10ml PH=6.8Tris-HCl PH 6.8 0.312M/L 3.12mM*121.14=0.3779gTrisSDS 10% 1g-巰基乙醇 25% 2.5ml溴酚蘭 0.25% 0.025g甘油 50% 5ml5. 凝膠儲備液（30AcrBise）可訂購 acrylamide(丙烯酰胺，有劇毒) 29gN,N-Methylenebisa-crylamide 1g，加ddH2O至100ml。6. Gel buffer 分離膠：1.5M TrisHCl PH: 8.8濃縮膠：0.5M TrisHCl PH: 6.8方法：按照Tris的摩爾質(zhì)量計算所需摩爾濃度（Tris摩爾質(zhì)量：121.14） 故分別稱取Tris 18.171g、6.057g，加蒸餾水9095ml，然后用PH計調(diào)節(jié)溶液PH,最后定容至100ml。7. 10%SDS1g SDS加入蒸餾水10ml8. 10APS 0.1g過硫酸銨加ddH2O至1ml，新鮮配制9. 10*電泳緩沖液（running buffer） Tris 30.3g，甘氨酸 144g，SDS 10g，蒸餾水定容至1000ml。（PH = 8.3）10. Transbuffer: Tris 3.03g，甘氨酸 14.4g，加水至850ml，再加甲醇150ml11. 封閉液：脫脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足夠（2.5g脫脂奶