免疫組化實驗步驟.doc

免疫組化實驗方法器材:微波爐 格蘭仕家用微波爐光學顯微鏡 OLYMPUS顯微鏡染色缸21個，1000ml燒杯1個，保鮮膜，濕盒 試劑：封閉用血清，DAB染液，SABC試劑盒，中性塑膠 武漢博士德生物工程公司無水乙醇，甲醇，二甲苯，檸檬酸，檸檬酸鈉，鹽酸，氨水，氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，吐溫-20，30%雙氧水，蘇木素染液試劑配制：1. 5PBS（1000ml）：NaCL：40g； KCL：1.2g；Na2HPO4：18.15g；KH2PO4：1.2g溶于ddH2O中定容至1000ml，調(diào)PH至 7.4-7.6。使用時稀釋5倍至1使用。2. 5PBST（1000ml）：NaCL：40g； KCL：1.2g；Na2HPO4：18.15g；KH2PO4：1.2g，tween-20:2.5ml溶于ddH2O中定容至1000ml，調(diào)PH至 7.4-7.6。使用時稀釋5倍至1使用。3. 檸檬酸鹽緩沖液：（10mM，PH6.0）： 10儲備液配制: 檸檬酸溶液：21.01g檸檬酸溶于1000ml H2O中得0.1mol/L檸檬酸溶液 檸檬酸鈉溶液：29.41g檸檬酸鈉溶于1000ml H2O中得0.1mol/L檸檬酸鈉溶液 取190ml檸檬酸溶液加810ml檸檬酸鈉溶液混合調(diào)PH至6.0得10檸檬酸鹽緩沖液，使用時稀釋10倍至1使用。4. 梯度酒精： 無水乙醇：取500ml無水乙醇至染色缸中，脫水和復水各3份共需6份 95%乙醇：取475ml無水乙醇加25ml水至染色缸中，脫水和復水各3份共需6份 70%乙醇：取350ml無水乙醇加150ml水至染色缸中，脫水和復水各1份共需2份5. 0.5%鹽酸酒精： 0.5ml鹽酸加入99.5ml 70%酒精實驗步驟：1. 取石蠟切片于烤箱中55-60烘烤1-1.5h使石蠟熔化2. 二甲苯脫蠟：將烤箱中取出的切片迅速置于二甲苯染色缸中脫蠟3min3次3. 系列酒精復水：將脫蠟完成后的切片分別置于無水乙醇2min3次，95%乙醇2min3次，70%酒精2min；蒸餾水中輕晃漂洗2min。4. 抗原修復：切片置于10mM檸檬酸鹽緩沖液中95以上修復，具體時間視不同組織不同切片質(zhì)量決定。注意不可長時間沸騰，以免導致脫片。實驗室現(xiàn)用格蘭仕家用微波爐設(shè)置條件：取600ml檸檬酸鹽緩沖液，power1加熱7min后溶液沸騰，調(diào)制power 60繼續(xù)加熱13min，在power60條件下可保證緩沖液溫度達到要求但不長時間沸騰，在加熱過程中使用保鮮膜封閉燒杯口并在保鮮膜上用針頭扎孔，以免加熱過程中緩沖液蒸發(fā)導致濃度改變。5. 自然冷卻至室溫，ddH2O流水沖洗10min。注意:室溫自然冷卻，流水沖洗保證檸檬酸鹽緩沖液不殘留，殘留可能導致后續(xù)實驗受到影響6. 使用與二抗來源相同的封閉血清37濕盒中封閉1h。滴加血清前可使用免疫組化筆在載玻片上畫圈以保證血清或抗體不會擴散7. 甩去封閉液滴加一抗4濕盒過夜孵育。一抗?jié)舛劝凑照f明書推薦使用封閉血清稀釋使用8. 一抗過夜孵育后PBST搖床漂洗5min，PBS搖床漂洗5min4次9. 按照說明書推薦濃度滴加相應二抗37濕盒孵育20-30min，PBS搖床漂洗5min3次10. 3%H2O2封閉10min去除內(nèi)源性過氧化物酶。清水漂洗后PBS 3min3次。注意：3%H2O2現(xiàn)配現(xiàn)用。時間不宜過長11. 滴加SABC后37濕盒孵育20min，PBST搖床漂洗5min4次，PBS 5min2次12. DAB染色：按照說明書要求現(xiàn)用現(xiàn)配DAB染液滴加至組織處于鏡下觀察染色，陽性染色出現(xiàn)后自來水沖洗后PBS漂洗2min。13. 蘇木素復染：滴加蘇木素至玻片上染色，染色時間視蘇木素質(zhì)量決定。染色后自來水沖洗完全去除蘇木素14. 鹽酸酒精分化及氨水返蘭：蘇木素染色在酸性條件下呈現(xiàn)棕色，在堿性條件下呈現(xiàn)藍色。分別調(diào)整鹽酸酒精分化及氨水返蘭時間使蘇木素染色為淡藍色。15. 脫水封片：按照與脫蠟復水反向順序進行脫水，脫水后使用中性樹膠封片。16. 鏡檢：待封片干燥后顯微鏡下觀察。注意事項：1. PBS濃度與PH值：使用PBS工作液濃度為1，PH：7.4-7.6；濃度過高或PH偏酸不易于染色且易導致背景較高。2. 切片質(zhì)量不佳較易脫片時一抗4孵育過夜后可37復溫30min，但易導致背景較高。3. 封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液要求PH值為7.4-7.6.4. 封閉血清應應與二抗種屬相同，可減少非特異性背景染色5. 在實驗過程中封閉以后干片會使背景加深。6. 蘇木素復染后氨水返藍過程會使背景及陽性染色有所降低，因此DAB染色時可以適當延長染色時間。7. 顯微鏡下觀察時使用自然光進行觀察，盡量不要使用軟件補光。8. 在進行熒光染色時可以忽略H2O2封閉過程9. 如不采用SABC法，則H2O2封閉過程應提前至使用二抗之前。DAB顯色時如在較短時間即可顯色但背景較高時可以考慮降低一抗?jié)舛燃霸黾右豢购笃创螖?shù)