分生實(shí)驗(yàn)報(bào)告DNA的限制性酶切與回收.docx

實(shí)驗(yàn)五DNA的限制性酶切與回收【實(shí)驗(yàn)原理】1.限制性核酸內(nèi)切酶是能夠識(shí)別特異DNA序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。其中類限制性內(nèi)切酶是重組DNA技術(shù)的基本工具酶。經(jīng)其切過的DNA有兩種不同的切口：平端切口和黏端切口。本實(shí)驗(yàn)利用EcoR和BamH對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生帶有粘性末端的DNA片段。粘性末端連接，DNA片段兩端的互補(bǔ)堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復(fù)原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高。2.經(jīng)過電泳的DNA條帶需要回收，進(jìn)一步分離純化以獲得純度較高的DNA片段。可先后使用溶膠液，漂洗液，和洗脫液將DNA回收。3.酶切緩沖液成分及作用： Tris-HCl，維持pH在7.48.0； Mg2+，內(nèi)切酶活性所必需； NaCl/KCl，增加離子濃度，利于酶活性； 二硫蘇糖醇(DTT)，保護(hù)酶，防止二硫鍵的形成4.星號(hào)活力限制性核酸內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能夠切割一些與其特異識(shí)別順序類似的序列，這種現(xiàn)象稱為星號(hào)活力。星號(hào)活力出現(xiàn)的原因：酶用量太大 100U / ug DNA。酶切體系中離子強(qiáng)度太低，12%)；有機(jī)溶劑的存在。5. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會(huì)形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。6. 酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中，根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對(duì)不同的限制酶，各廠家均有一最大的消化量指標(biāo)可參考。7.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。8.要保證酶作用時(shí)的最佳反應(yīng)條件(ph, 溫度)和底物用量，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。9.高于37或需長(zhǎng)時(shí)間保溫時(shí)，可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。10.反應(yīng)混合物混勻時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。11. 不同廠家的試劑不可混用，需要時(shí)請(qǐng)查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。12.緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時(shí)，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí)，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。13.瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。14.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。15. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】【實(shí)驗(yàn)分析】1. pUC18的凝膠中，右邊凝膠條帶色淺，混作一團(tuán)，實(shí)驗(yàn)失敗，可能是酶活性不足。左邊凝膠條帶分割明顯，但顏色較淺，可能因?yàn)楹枯^少。或者因?yàn)槟z失水過多，或者有碎膠影響其游走。pUC18經(jīng)EcoR和BamH兩種酶切之后，預(yù)期結(jié)果得到21bp和2.67kb兩種DNA片段，本實(shí)驗(yàn)則要選取2.67kb作為載體。在marker中，最亮的那條條帶為2kb的DNA片段，2.67kb的目的載體DNA條帶片段正好在marker最亮條帶的下方，另一條21bp的片段由于分子量太小，游動(dòng)快，位于marker的最小條帶的前方，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。因此，該凝膠中，左邊條帶實(shí)驗(yàn)比較成功，回收時(shí)只需切割2.67kb的條帶即可。2.Sp1的凝膠中，中間組凝膠中DNA游走不明顯，DNA混作一團(tuán)，可能是酶活性不足等導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。而左側(cè)組較為成功，凝膠中的條帶分成較為明顯的三條條帶，較符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。切割凝膠時(shí)，應(yīng)選擇左邊凝膠，但是其在膠最前面仍有小的亮帶，可能是有RNA混雜。而右側(cè)組出現(xiàn)了不應(yīng)該出現(xiàn)的DNA條帶分離，可能是將SP1和Puc18誤混導(dǎo)致。分析原因， DNA由于酶切不完全，大部分DNA沒有被切開，導(dǎo)致上樣的DNA樣本分子量大，游走緩慢，結(jié)果中只有一條明顯的條帶，與少數(shù)不明顯的淺條帶。經(jīng)與marker相比較，左邊條帶的結(jié)果較符合預(yù)期。Sp1所在基因經(jīng)EcoR和BamH兩種酶酶切得2.2kb和4.9kb兩