酵母菌的分離篩選方法.doc

酵母菌的分離篩選方法 酵母菌多數(shù)為腐生，一般生長在含糖較高，偏酸的環(huán)境中，在通氣條件下，液體培養(yǎng)比霉菌快。菌落與細菌相似，較大而厚，多數(shù)不透明，菌落光滑濕潤粘稠，乳白色，少數(shù)干皺，邊緣整齊，呈紅色或粉紅色，圓形 橢圓 卵形，液體培養(yǎng)基生長會生成沉淀或菌膜。含高糖濃度（45%），分離蜂蜜酵母，球擬酵母屬等嗜高滲透壓的酵母。1.培養(yǎng)基：1.1葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO42.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加拉紅 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用）1.2乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗糖）20g/L 乳酸5ml馬鈴薯去皮切片200g，加水煮沸30min，紗布過濾，補足蒸餾水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培養(yǎng)用）（富集用）1.3麥芽汁培養(yǎng)基：1：4水60-65水浴3-4小時，4-6層紗布過濾，可加一個蛋清加水20mL調(diào)均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸過濾，10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121 20min （分離保存用） 滅菌后加入300u/ml硫酸鏈霉素（集菌用） 1.4虎紅（孟加拉紅）培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉紅0.033g/L 氯霉素0.1g/L 瓊脂15g/L PH自然 （分離純化用）1.5 豆芽汁培養(yǎng)基： 黃豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黃豆芽，加水煮沸30min，紗布過濾，補足蒸餾水1L1.6察氏培養(yǎng)基：主要培養(yǎng)霉菌觀察形態(tài)用蔗糖30g/L 硝酸鈉3g/L 磷酸氫二鉀1g/L 氯化鉀0.5g/L 硫酸鎂0.5g/L 硫酸亞鐵0.01g/L 瓊脂15-20g/L 121 20min PH自然 一般分離黃酒酵母 酒精酵母使用曲汁培養(yǎng)基，啤酒酵母用酒花麥汁培養(yǎng)基，葡萄酒酵母用葡萄汁培養(yǎng)基。2.集菌：研究酵母菌生態(tài)和某種基物或樣品中的酵母菌區(qū)系，一般不進行集菌，以免改變其中不同種類數(shù)量間的對比，將樣品制成菌懸液按常規(guī)法分離。若從樣品中分離特定種類時先集菌。集菌發(fā)酵力強菌株，加酸性含糖的培養(yǎng)基，酸性豆汁，必要時注入高濃度的酒精（13-17%），霉菌在液體中形成菌絲體，酵母不形成菌絲，25-28 2-3d，遇到菌絲體用接種環(huán)挑去燒掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至兩環(huán)移植另一液體培養(yǎng)基中，集菌連續(xù)兩至三次才能完成，要配合鏡檢。實例：將待分離的樣品10g（ml）放入90ml無菌水或生理鹽水/150ml三角瓶（玻璃珠），搖床振蕩20-30min，取上清液接種于酸性培養(yǎng)液（乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基 酸性麥芽汁或酸性豆芽汁）25-28 2-3d，培養(yǎng)過程中若出現(xiàn)菌絲體跳出燒掉，集菌連續(xù)兩至三次，培養(yǎng)液變成混濁，產(chǎn)生菌膜和沉淀物。鏡檢：美蘭染液染色，活菌可還原美蘭染液，菌體無色。3.篩選：分離：取集菌液適當稀釋，吸取0.1-0.2ml梯度菌液（至少兩個兩個平衡），涂布于馬鈴薯-葡萄糖 麥芽汁或虎紅培養(yǎng)基平板，也可采用混菌法或蘸取集菌菌液直接劃線，（平放12h后倒置培養(yǎng)），25培養(yǎng)48h，低溫酵母菌15 高溫酵母菌 35 40 45，形成清晰菌落。在培養(yǎng)皿底劃分小方格，待菌落生長良好后，用放大鏡或低倍鏡，觀察每格內(nèi)每個菌落編號并描述，顏色 表面 邊緣 切面等，再制片在高倍鏡下觀察各菌株的個體形態(tài)，做好記錄。選擇不同菌落分別接于麥芽汁斜面，25培養(yǎng)48小時備用。純化：培養(yǎng)基與分離培養(yǎng)基相同，否則，不同培養(yǎng)基菌落會改變形態(tài)，決不能認為菌落外觀相同菌屬于同一種。菌落外觀相近的菌落，只能挑取一至數(shù)個菌落為代表進行純化。常用方法為平板劃線分離法：挑取單菌落于平板劃線純化菌株，25-28 2-3d，選擇菌生長快 菌落大 典型繼續(xù)純化，每個分離物至少經(jīng)兩次劃線，結(jié)合鏡檢保持菌株的純度，對于保存菌株也應(yīng)定期檢查純度。純化的菌株轉(zhuǎn)接于麥芽汁斜面25-28 2d 待鑒定或用滅菌液體石蠟封面于4冰箱保存。篩選：性能測定：根據(jù)不同需要，選擇不同性能測定方法。產(chǎn)氣性能比較：采用杜氏管發(fā)酵法，將斜面菌種兩環(huán)接種于麥芽汁或豆芽汁液體培養(yǎng)基中（可以分兩次加培養(yǎng)基），28振蕩培養(yǎng)48h，產(chǎn)氣時間和產(chǎn)氣量。產(chǎn)酒精能力測定：采用蒸餾法測酒精含量。產(chǎn)香能力測定：通過嗅覺鑒定。 附：不同酵母菌的形態(tài)特征：釀酒酵母：在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，菌落與細菌相似，比細菌大而厚，不透明，表面光滑，濕潤粘稠，乳白色，形成假菌絲。單細胞，形狀有圓形 橢圓形等，大小不一。在麥芽汁中，沉淀表面形成環(huán)狀膜。不能利用硝酸鹽。產(chǎn)朊假絲酵母：在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落為乳白色，平滑，有光澤或無光澤，邊緣整齊呈菌絲狀。細胞呈圓形 橢圓形和圓柱形等。能利用硝酸鹽為氮源。實例1：大曲中酵母菌的分離及鑒定 1.富集培養(yǎng)：取5g樣品，在試管中加入10ml麥芽汁培養(yǎng)基，同時加入一滴乳酸搖勻，25-2824h，后取1ml菌液轉(zhuǎn)入另10ml麥芽汁培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)25-28 24h，稍長(過長則霉菌長出)。培養(yǎng)液變濁產(chǎn)膜或沉淀。觀察：用無菌操作法取少許菌液置于載玻片中央的0.l%美藍染色液中，混勻后加蓋玻片制成水浸片，先用低倍鏡后換高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖情況。活酵母菌可使美藍還原，從而使菌體不著色，用此方法可判斷酵母菌的死活。要求：較高的糖50g/l， 抑菌劑 孟加拉紅0.03 g/L（許多細菌 放線菌和快速生長的霉菌），PH 4.5?；蛴萌樗幔?ml）-馬鈴薯（200g）-葡萄糖（20g）培養(yǎng)基富集。2.酵母菌分離：平板劃線 涂布或混菌均可。取集菌菌液，梯度稀釋，取 10-5 10-6 10-7,0.1ml菌液涂布虎紅培養(yǎng)基上，25-28 48h（若不純可挑取單菌落連續(xù)多次劃線）。3.酵母菌選擇：對典型單菌落，經(jīng)美蘭染色，制片鏡檢，進行描述性記錄，然后選擇不同菌落轉(zhuǎn)接于麥芽汁斜面，25-28 48h備用。4.酵母菌純化：挑取10-7 培養(yǎng)基不同的單菌落，在PDA培養(yǎng)基接種25-28 2-3d后，取形態(tài)不同的單菌落傳接二次，觀察菌落形態(tài)確定為單菌落后，分別接種于PDA培養(yǎng)基和MA培養(yǎng)基中，25-28 3d，根據(jù)在不同培養(yǎng)基中菌落形態(tài)進行初步分類。將所得菌株于斜面培養(yǎng)保存在4冰箱中。實例2：高溫堆積糟醅中酵母菌的選育1.集菌：同上 45 2-3d，依此法轉(zhuǎn)接2-3次，再行分離。2.分離：梯度菌液分別涂布于麥芽汁 麩皮汁 豆芽汁平板于45 2-3d，將平皿上生長的菌落劃線純化，菌株移入斜面，備用。3.有效菌株的確認：分離的數(shù)十株酵母經(jīng)鏡檢有酵母屬的各種酵母，假絲酵母，紅酵母，白地霉等。用高粱粉糖化液，飴糖稀釋液，麩皮等進行發(fā)酵，測定次生代謝產(chǎn)物，依次判出Y1 Y2 Y3 Y4等與醬香酒產(chǎn)量質(zhì)量有關(guān)。4.菌種的分類鑒定：4.1形態(tài)特征：（麥芽汁瓊脂）編號 形態(tài)特征Y1 菌落由白色到奶油色，無光澤，軟而平滑或部分有皺紋。邊緣呈波紋，凸起，色黃，中心凹，奶油色，室溫放一月后，培養(yǎng)物由奶油色變淺褐色。細胞呈圓 卵圓 橢圓，大小不等。單個，成雙，偶爾成短鏈，多邊芽殖。 （意大利酵母） Y2菌落呈淺奶油色，菌落平滑或部分有皺紋，無光澤，邊緣呈黃色，大波紋狀。細胞圓形卵形 橢圓形，大小不等，多邊芽殖。 (地生酵母)Y3 28 3d后，細胞圓形 橢圓形，單個或成雙，兩端芽殖，培養(yǎng)物奶油狀，奶油色到淺褐色，平滑，稍平坦，光亮，邊緣偶爾波紋，無真菌絲。 （釀酒酵母）Y4 菌落白色至奶油色，無光澤，軟而平滑或部分有皺紋。培養(yǎng)時間偏長菌落漸硬，并呈菌絲狀，不易挑起。在麥芽汁平皿上，菌落白色，凸起，有皺紋，邊緣波紋狀。細胞較小，卵圓 橢圓形，有大量真菌絲。 （間型假絲酵母）4.2生理生化特征4.2.1發(fā)酵糖類： 酵母菌發(fā)酵液成分分析 Y1 Y2 Y3 Y4 香 氣 稍醬香，酯香 稍醬香，酯香 酯香 醇甜香酒精（%） 3.9 3.9 4.3 5.1代謝產(chǎn)物 乙 丙 丁 乳 異戊酸 同Y1 除硫甲基丙醇 乙 丙 丁 乳酸 乙醛 乙酯 乳酯 丙醇 其他成分均有 乙醛丙醇異丁醇 異丁醇 異戊醇 戊醇 異戊醇 硫甲基丙醇 各種酵母發(fā)酵糖類結(jié)果 Y1 Y2 Y3 Y4 葡萄糖 + + + +D-半乳糖 + - + -麥芽糖 + - + +蔗糖 + - + +乳糖 - - - +棉子糖 - - + +蜜二糖 纖維二糖海藻糖松三糖菊糖可溶性淀粉-甲基-葡萄糖苷 同化碳源葡萄糖 + + + +D-半乳糖 + - + -麥芽糖 + - + +蔗糖 + - + +乳糖 + - - +棉子